Materia:

Biología molecular.
Tema:

Reporte de prácticas “Extracción del

ADN”.

Profesor:

Dra. María Luisa Pita López.

INTRODUCCION:
La extracción de ADN con el kit con membrana de sílice, requiere que a la mezcla
de lisis se le añada una solución de unión que tiene un pH específico. En este
caso se adiciona etanol a la solución de lisis, para eliminar la capa hidratante del
ADN y así se exponen los grupos fosfato, facilitando con ello la adsorción de la
molécula a la membrana de sílice cargada positivamente (Figura 1). Los lípidos y
proteínas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de las soluciones
de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras que el material genético
permanece unido a la matriz.
Además esta practica buscara que se otorgue una mejor visión sobre lo que son
los ácidos nucleicos y como es que podemos desenvolvernos en el laboratorio de
biología molecular, adquiriendo así poca pero muy buena experiencia de lo que
seria trabajar en un laboratorio de biología molecular.

OBJETIVO:
Separar y purificar ADN de las células mononucleares de sangre periférica por
centrifugación y filtración en columnas con membrana de sílice.

EQUIPO Y MATERIAL:
 Centrifuga y baño María
 Muestra de células
 Congelador a -20 C
 Tubo y aguja vacutainer
 Gradillas
 Guantes
 Spin Columns with Collection Tubes
 Collection Tubes (2.0 mL)
REACTIVOS:
Lysis/Binding Buffer
Digestion Buffer
Wash Buffer 1
Wash Buffer 2
Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA)
RNase A (20 mg/mL) in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA
Proteinase K (20 mg/mL) in storage buffer

MÉTODO:
1. Calentar el baño María a 55°C.
2. En un tubo de microcentrífuga estéril, agregar 200 uL de la muestra
de sangre fresca o congelada.
3. Agregar 180 uL de Genomic digestión y mezclar en Vortex hasta
obtener una solución homogénea.
4. Agregar 9 uL de proteinasa K a la muestra.
5. Agregar 9 uL de RNasa A a la muestra, mezclar en Vortex hasta
obtener una solución homogénea.
6. Agregar 180 uL de PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer y mezclar en Vortex
hasta obtener una solución homogénea.
7. Incubar a 55°C por 10 minutos para promover la digestión de las
proteínas por la proteinasa K.
8. Agregar 200 uL de etanol absoluto al lisado, mezclar en Vortex
hasta obtener una solución homogénea.
9. Tomar una columna PureLink Spin Column y un tubo colector del
paquete.
10. Agregar el lisado de células a la columna.
11. Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10,000 g por 1 min.
12. Descartar el tubo de colección y tomar un nuevo tubo de colección, colocar la
columna en el tubo limpio.
13. Agregar 450 uL de Wash Buffer 1 (previamente diluido con etanol absoluto) a
la columna.
14. Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10,000 g por 2 min.
15. Descartar el tubo de colección y tomar un nuevo tubo de colección, colocar la
columna en el tubo limpio.
16. Agregar 450 uL de Wash Buffer 2 (previamente diluido con etanol absoluto) a
la columna.
17. Centrifugar a temperatura ambiente a 15,500 g por 6 minutos.
18. Descartar el tubo de colección y tomar un nuevo tubo de
microcentrifuga, colocar la columna en el tubo limpio.
19. Agregar 25-200 uL de PureLink Genomic Elution Buffer o de agua
grado molecular a la columna.
20. Incubar a temperatura ambiente (TA) por 1 min. Centrifugar a TA a
10,000 g por 1 minuto.
21. El tubo ahora contiene el ADN genómico.
22. Descartar la columna y almacenar el ADN a -20°C hasta su uso.
RESULTADOS:
Bueno, a juzgar por la siguiente práctica, la realización de la practica se llevo a
cabo con éxito ya que se logró la extracción del ADN del núcleo de la célula, esto
no servirá para la practica siguiente en la cual determinaremos la pureza del ADN
extraído.

Centrifugadora que se uso

en la práctica.

CONCLUSIÓN Y APLICACIONES:
En conclusión, la práctica fue de muy interesante ya que, bueno en este caso no
se está acostumbrado a este tipo de practicas y resulta gratificante que haya
salido bien, y que se logró seguir los pasos correctamente, el uso de los reactivos
fueron las adecuadas también la cantidad de estos, pipetear, aunque resulta un
poco de habilidad no fue un problema para el equipo.
La purificación del DNA es importante porque permite:
1. Identificar mutaciones.
2. Ver características propias de los tipos de DNA (Polimorfismo).
3. Para clonar (Genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos).
4. Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno.
5. Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes
patogénicos.
6. Identificar resistencia microbiana.
7. Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos,
inmunológicos.
8. Medicina forense para la identificación de personas.
9. Para hacer tests de paternidad.
PRACTICA NUMERO 2 “CUANTIFICACIÓN DEL ADN”

Introducción:
La espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con
cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de
llevar a cabo ensayos de PCR, análisis de SNPS (Polimorfismos de nucleótido
único) o la secuenciación automática de muestras de DNA de plásmidos,
productos de PCR. También nos ayudara para determinar la pureza de lo ya
obtenido.

Material:
- Nanoespectrofotómetro.
- Puntillas estériles mara
micropipeta.
- Micropipeta de 3 microlitros.

Método:

Aquí podemos observar que de lo ya obtenido

de la practica anterior, procederemos a
cuantificar el ADN a través de un
nanoespectofotometro.

En esta imagen se puede observar la

gota pequeña de 2 µL de ADN en el
nanoespectrofotómetro el cual se diseña
para determinarla concentración
muestras de ácidos nucleicos de la DNA
y del ARN. La unidad asegura el análisis
rápido de 1µL al 2µL (longitud del
camino: muestras de 0,2 milímetros a de
0,7 milímetros).
REASULTADO:

Aquí se puede observar el resultado final fue de 50 ng/uL

Conclusión:
La cuantificación se realizó con éxito se logro hacer una buena
práctica, logrando evitar contaminar la muestra y el trabajo en equipo
se realizó con muy buena coordinación.
Aplicaciones:
El nivel de pureza de esta muestra es necesario para poder realizar
con mayor precisión los estudios con el ADN, esto serviría para la
validación de las muestras a realizar ya que se tendría mejor calidad.

Bibliografías:
- Laura Patricia Alejos Velázquez,María del Consuelo Aragón
Martínez,Amelia Cornejo Romero. Extracción y purificación de
ADN.
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.p
df. Consultado el 27 de febrero 2019.
- Vallin Plous, Carlos (2007). Microarreglos de ADN y sus
aplicaciones en investigaciones biomédicas. Revista CENIC.
Ciencias Biológicas, 38(2),132-135.[fecha de Consulta 14 de
Febrero de 2020]. ISSN: 0253-5688. Disponible en:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=1812/181221636005.
- Lisandro Alvarado. (2009). BIOLOGIA CELULAR EXTRACCIÓN
DE ADN . 15/02/2020, de Universidad Centroccidental Sitio web:
http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/MaterialDidactico/Micro/
BioCelular/Practica/extraccion_adn.pdf.
- Gemma Rodríguez. (2014). CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS . 15/02/2020, de SERVICIO DE GENOMICA DEL
IIBm (SQP) Sitio web:
https://www.iib.uam.es/portal/documents/76122/76162/CUANTIFI
CACION+DE+%C3%81CIDOS+NUCLEICOS+V2.pdf/04333940-
c6ff-4419-ad85-cfd1e04dbca8.