PARCIAL 1 LABORATORIO BIOMOL

PRACTICA 1. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO MICROBIANO

La extracción y purificación de los ácidos nucleicos, como el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el
ácido ribonucleico (ARN) es el primer paso en la mayoría de los estudios moleculares. El primero en
aislar y purificar el ADN fue el químico suizo Johan Friedrich Miescher, quien en el año 1869 aisló a
partir del núcleo de los glóbulos blancos varias moléculas ricas en fosfatos, a las cuales les llamó
nucleínas (ácidos nucleicos). El protocolo original de Miescher era burdo y el ADN obtenido no era
puro. La contaminación con proteínas era una de sus preocupaciones, por lo que modificó su
protocolo agregando pepsina, una proteasa, para digerir de esta manera las proteínas presentes.

Los metodos de extraccion y purificacion del ADN se seleccionan de acuerdo con:

- El tipo de ácido nucleico a extraer: ADN genómico, ADN plasmídico, ARN total, ARN
mensajero, etc.
- El organismo de donde se extraerá el ácido nucleico: Células animales, células vegetales,
parásitos, mohos, levaduras, bacterias, virus, etc.
- El material de extracción: Órganos completos, tejidos, cultivos celulares, fluidos corporales,
muestras ambientales, alimentos, etc.
- Los resultados deseados: Rendimientos, pureza y tiempo de purificación de los ácidos
nucleicos, etc.
- La aplicación posterior: Amplificación, clonación, transcripción reversa, etc.

Los métodos de extracción de ácidos nucleicos, sin importar el tipo de ácido nucleico a extraer o la
procedencia del material a utilizar, siguen siempre tres etapas básicas:

1. Lisis de células e inhibición de nucleasas:

La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere la homogeneización de
los tejidos y el lisado de las células, de tal forma que las paredes y/o membranas de la célula sean
degradadas, alteradas o perforadas y de esta manera todos los ácidos nucleicos sean liberados. Los
principales componentes de las paredes y membranas que son alterados son los lípidos, carbohidratos
y proteínas; y el método de lisis utilizado depende de la naturaleza de cada célula, por ejemplo, las
células bacterianas son lisadas generalmente por la acción de detergentes, mientras que las levaduras,
son tratadas con enzimas que afectan la integridad de su pared celular; y las células sanguíneas son
lisadas por presión osmótica con altas concentraciones de sales. También es posible realizar la ruptura
mecánica de pared y membranas de una amplia variedad de microorganismos mediante
procedimientos mecánicos, como por ejemplo la utilización de perlas de vidrio.
En esta etapa se deben inactivar las nucleasas celulares que podrían digerir los ácidos nucleicos. Esto
asegura que la cantidad de ADN o ARN íntegro obtenido sea la máxima. Se puede utilizar una
solución con detergentes para solubilizar las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes para
inactivar las nucleasas.
El DNA y otros componentes celulares como lípidos, azúcares y proteínas, se disuelven en la solución
de lisis. El DNA es una molécula soluble gracias a la carga negativa que le otorgan los grupos
fosfatos.

Procesos más comunes utilizados:

- Ruptura mecánica con perlas de vidrio, ruptura hipotónica, o congelación descongelación.
- Lisis con detergentes o agentes caotrópicos.
Nota: Un agente caotrópico sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en
macromoléculas tales que proteínas, ADN o ARN y las desnaturaliza.
- Digestión enzimática con proteasas, lisozimas o enzimas específicas que romperán la pared de
los microorganismos.

2. Extraccion y purificacion de los ácidos nucleicos

La centrifugación permite remover la mayor cantidad de restos celulares presentes en la muestra
(detritus celular), pero las proteínas permanecen asociadas al ADN, lo cual puede interferir con
posteriores análisis.
La extracción de estas proteínas con solventes no miscibles (que no se mezclan) permite eliminar las
proteínas contaminantes de los ácidos nucleicos, para ello, se utiliza una combinación de fenol y
cloroformo. Después de agregar estos agentes desnaturalizantes, se separa la suspensión por medio de
centrifugación, obteniéndose dos fases: una orgánica y una acuosa, separadas entre sí por una interfase
de proteínas desnaturalizadas; en la fase acuosa se encuentran los ácidos nucleicos. De otro lado,
también es posible precipitar las proteínas mediante la utilización de altas concentraciones de sal o
cambios en el pH.

3. Precipitación o concentración de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos de la fase acuosa se recuperan por precipitación. Para ello se utilizan alcoholes,
como el etanol o el isopropanol, que deshidratan la molécula y la adición de sales, como el acetato de
sodio o de potasio, neutraliza las cargas negativas, lo que potencia el efecto deshidratante, haciéndola
insoluble y conlleva a la precipitación reversible del ADN por medio de la centrifugación. El ADN o
ARN precipitado forma finas hebras blancas u ocres, mientras que el resto de las sustancias
permanecen disueltas. Posteriormente, el ADN o el ARN se disuelve en volúmenes pequeños de agua
o en buffer TE, y se almacenan para utilizarlo en experimentos posteriores.
Metodo basico para la extracción del ADN

EXTRACCION ADN GENÓMICO

Método Levaduras Bacterias

Lisis Digestión enzimática: solución Digestión enzimática con

1 (pH 8, sorbitol 0.9 M, EDTA lisozima y proteinasa K, perlas
0.1 M DTT 50 mM) y 2 (pH, de vidrio o detergentes como el
Tris HCl 50mM, EDTA SDS. Incubación y agitación
50mM), y solución de la vortex.
enzima liticasa (0.5 mg
enzima/40 ul sorbitol 0.9 M) y
SDS al 10%.

Extraccion y purificacion Acetato de potasio 5M, Etanol Acetato de amonio 8M,

absoluto frío, Fenol saturado y isopropanol frío, etanol al 70%
cloroformo. frío, agua MQ esteril y enzima
RNAsa.

Concentración Etanol absoluto frío,

isopropanol frío y etanol al
70%.

FUNCIONES DE LOS REACTIVOS Y DEMÁS COMPONENTES

Utilizados en la Lisis Celular:
EDTA: Agente quelante que atrapa los iones Mg2+ usados por las DNAasas como cofactores para
degradar el ADN.
Sorbitol: Mantiene el ambiente osmótico para mantener el equilibrio.
Tris (hidroximetil amino metano): Es un tampón biológico usado para estabilizar el pH de la
solución
Proteinasa K: es una enzima que sirve para romper/degradar a las proteínas que están unidas al ADN
y también para romper la membrana en bacterias.
DTT: Desnaturalizante de proteínas porque rompe los puentes disulfuro (enlaces covalentes).
Enzima Liticasa: Rompe enlaces del Beta-glucano (enlaces de la pared celular de la levadura).
SDS: Detergente iónico que desnaturaliza proteínas.
Enzima Lisozima: Enzima que se utiliza paravvdegradar peptidoglicano de la bacteria.
Perlas de Vidrios: Romper pared de bacterias.

Extraccion y Purificacion
Acetato de potasio y amonio: Solubiliza el ADN ya que el ADN tiene carga negativa, mientras que
el potasio y amonio tienen cargas positivas y ayuda a precipitar de cierto modo las proteínas.

Nota: La solubilidad de una proteína a baja fuerza iónica generalmente aumenta con la
concentración de sal. El salting in es el fenómeno por el cual la concentración de sal aumenta la
solubilidad de la proteína. A altas fuerzas iónicas, la solubilidad de las proteínas disminuye, este
fenómeno es conocido como salting out.

Etanol absoluto: Deshidrata, robando las interacciones del agua con el ADN, y precipita el ADN.
Isopropanol: Concentrar y desalinizar preparaciones de ácidos nucleicos en soluciones acuosas.
Buffer TE: Aumenta la estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo o de uso
frecuente, pues inhibe DNasas presentes en la muestra.
Fenol y cloroformo: Se utilizan para formar las fases orgánica y acuosa, desnaturalizar proteínas e
inactivar nucleasas.
Etanol al 70%: Insolubilizar el ADN y solubilizar iones, sales y cualquier contaminante que puede
estar aún asociado a la molécula de ADN.
RNAsas: cataliza la degradación del RNA en componentes más pequeños.
Agua MQ esteril: Ayuda a mantener el DNA intacto durante el proceso de extracción.
Extracción de ADN usando Columnas
1. Liberar ADN. Digestión enzimática.
2. Preparar columna, adicionar solución y centrifugar.
3. Unir ADN, agregar etanol y centrifugar.
4. Lavar columna y centrifugar 2 veces.
5. Eluir ADN. Centrifugar 1 minuto.
https://www.youtube.com/watch?v=cbE9_9BSAaM
Ventajas de usar kits comerciales: Extracción más rápida y mayor pureza.
Desventajas: La concentración obtenida de ácido nucleico puede ser más baja y es más costoso este
método.
En los métodos manuales de extracción puede obtener una mayor cantidad de ADN pero la fuerza se
puede ver alterada. Si en estos métodos se utiliza más cantidad de reactivos de la indicada, se puede
taponar la membrana.

PRACTICA 2. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO

La extracción y purificación del ADN plasmídico es esencial para diversos análisis moleculares. Los
métodos más utilizados para su extracción y purificación incluyen la lisis alcalina, métodos por
calentamiento y purificación con litio.
El método con el que se realizará la extracción de ADN plasmídico es la extracción por medio de lisis
alcalina; en este procedimiento el ADN plasmídico es aislado de pequeñas cantidades de cultivos
bacterianos. Las células bacterianas son recolectadas de un cultivo líquido crecido previamente y
luego son lisadas al utilizar una solución de SDS, el cual desnaturaliza las proteínas bacterianas de la
membrana mientras que el NaOH desnaturaliza el ADN tanto el ADN cromosómico como el ADN
plasmídico. Posteriormente, la mezcla es neutralizada con Ácido acético glacial, el cual es un ácido
débil que conlleva a que el ADN de bajo peso molecular se renaturalice, por ello el ADN plasmídico
se reasocia rápidamente, mientras que el ADN cromosómico permanece precipitado debido a su alto
peso molecular. El acetato de potasio además ayuda a que las proteínas permanezcan insolubles.
Finalmente, tanto el ADN cromosómico como las proteínas son removidas rápidamente por
centrifugación.
Los alcoholes, como el isopropanol y el etanol absoluto, son ampliamente utilizados para la
precipitación de ácidos nucleicos, por ello, la fase acuosa obtenida después de separar las proteínas y
el ADN cromosómico, es precipitada con un volumen de isopropanol o dos volúmenes de etanol
absoluto y posteriormente se realiza un lavado con etanol al 70%, el cual tiene dos funciones, iniciar
el proceso de rehidratación de los ácidos nucleicos y extraer las sales utilizadas en el proceso de
extracción y que pueden estar unidas a los ácidos nucleicos. Una vez resuspendido el ADN plasmídico
en buffer TE o en agua milliQ, se realiza un tratamiento con la ribonucleasa ARNasa para digerir el
ARN residual que pudo haberse extraído en el proceso, ya que este ácido nucleico también es de bajo
peso molecular y puede ser renaturalizado.
Glucosa: Se encuentra en la solución que prepara la célula para la lisis, y su papel es desestabilizar la
pared celular y por ende se rompe esa pared celular.

¿CÓMO EVALUAR LA INTEGRIDAD DEL ADN?

PRÁCTICA 3. VALORACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS: INTEGRIDAD, CALIDAD Y
CONCENTRACIÓN
La integridad de los ácidos nucleicos hace referencia al estado de conservación de la molécula y
generalmente se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa, mientras que la calidad, o grado de
contaminación con proteínas y la concentración, se valoran a través de mediciones
espectrofotométricas.

Electroforesis en gel para ácidos nucleicos

El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia
de un campo eléctrico. La electroforesis es una técnica de separación de ácidos nucleicos tales como
el ADN y ARN de acuerdo con su tamaño y reactividad o carga. Se basa en el principio que, bajo la
influencia de un campo eléctrico aplicado, las moléculas cargadas migran en dirección al ánodo,
debido a la carga neta negativa del ADN por los grupos fosfatos en su composición estructural. La
separación de los fragmentos está influenciada por la movilidad con la cual moléculas de diferente
tamaño son capaces de pasar a través del gel. El tamaño y la forma de las moléculas afecta su
movilidad, por ello,las moléculas de mayor tamaño migran más lentamente debido a que sufren más
resistencia al interior del gel mientras que las moléculas de menor tamaño se desplazan más
rápidamente.
Agarosa: Debido a sus propiedades fisicoquímicas, a su facilidad de preparación y poder de
gelificación, es el soporte más comúnmente utilizado para electroforesis en el área de la biología
molecular. Además, los geles de agarosa no son tóxicos y están prácticamente libres de cargas iónicas,
lo cual es importante para evitar que la solución buffer se desplace por el gel cuando se activa el
campo eléctrico. Está formada por polímeros de agarobiosa.
Migración del ADN en el gel: El fundamento de esta separación es que cuanto mayor es el
superenrollamiento, más compacta es la forma de un cccDNA, y por lo tanto, mayor será la facilidad
con que puede migrar por la matriz del gel. En consecuencia, un cccDNA relajado por completo migra
con más lentitud que un toposiómero muy superenrollado del mismo DNA circular.

Para poder analizar el ADN en gel de agarosa, es necesario utilizar el buffer de carga, el cual
desempeña varias funciones importantes en la electroforesis en gel de agarosa:
• Dado que el ADN es muy poco denso, puede difundirse en el buffer de corrido. Es necesario que el
ADN permanezca en el fondo del pozo, para ello, el buffer de carga contiene Ficol o glicerol, los
cuales le dan densidad al ADN, así el ADN no se difundirá y migrará en el fondo del gel.
• Debido a que el ADN es incoloro, no es posible monitorear su migración en el gel de agarosa. Por
ello, el buffer de carga además está constituido por uno o varios colorantes químicos que migran por
encima del ADN y así permiten monitorear su migración en el gel de agarosa. El colorante más
utilizado es el azul de bromofenol.

Así mismo, cuando se analiza una muestra de ADN en gel de agarosa, debe de emplearse un marcador
de peso molecular, el cual permite estimar el tamaño de los fragmentos de ADN. Existe una amplia
variedad de marcadores de peso molecular y su selección depende de la muestra a analizar, si se
analiza un ADN genómico, generalmente se utiliza un marcador de peso de alto peso molecular,
mientras que para productos amplificados se utilizan marcadores de peso de 1 kb.

Para poder visualizar el ADN en el gel de agarosa es necesario utilizar un colorante fluorescente, el
cual se intercala en las bases del ADN y cuando el gel es sometido a luz ultravioleta, se observan las
bandas de ADN. El colorante más utilizado es el Bromuro de etidio, pero debido a que es mutagénico,
se empleará el colorante EZ- vision, el cual no es mutágeno ni tóxico.

Factores que afectan la movilidad electroforética del ADN:

- Voltaje aplicado
A voltajes bajos, la migración de las moléculas lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado.
Sin embargo, si la fuerza iónica del campo es elevada, la movilidad de los fragmentos de alto peso
molecular se incrementa diferencialmente, esto quiere decir que las moléculas no se separan
completamente a pesar de aumentar la velocidad de la electroforesis. Por lo tanto, el rango de
separación efectiva en los geles de agarosa decrece cuando se eleva el voltaje aplicado.

- Buffer de corrido
La movilidad electroforética del ADN es influenciada por la composición y la fuerza iónica del buffer
de electroforesis. En ausencia de iones (agua desionizada), la conductividad eléctrica es mínima y el
ADN migra lentamente. Por otro lado, en un buffer con una fuerza iónica demasiado alta, la
conductividad eléctrica es alta, aún con voltajes moderados y se generan grandes cantidades de calor,
lo que podría fundir el gel y desnaturalizar el ADN. Actualmente se utilizan diferentes buffers, los
más utilizados son el buffer Tris Acetato EDTA (TAE) el cual tiene una baja carga iónica mientras que
el buffer Tris Borato EDTA (TBE) tiene una alta carga iónica.

- Tamaño del ADN

Las moléculas de ADN lineal de doble cadena migran a través del gel a velocidades que son
inversamente proporcionales al logaritmo de su número de bases. Debido a la fricción que impone la
malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño se retrasan con respecto a las de menor
tamaño.

- Conformación de ADN
El ADN puede presentar diferentes topoisómeros que afectan la movilidad en el gel de agarosa. El
ADN circular de doble cadena superenrollado migra a mayor velocidad que el ADN circular enrollado
y circular relajado que migran más lentamente.

- Concentración de agarosa
Para permitir una mejor resolución de las bandas se han determinado concentraciones de agarosa de
acuerdo con el tamaño de las muestras de ADN, tal como se muestra en la siguiente tabla.

Evaluación espectrofotométrica de los ácidos nucleicos

El análisis espectrofotométrico de ADN o ARN es uno de los análisis más empleados para determinar
la calidad o pureza del ADN así como también su concentración. El análisis espectrofotométrico se
basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta. En el caso del ADN y el
ARN, la muestra es expuesta a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un
fotodetector mide la luz que pasa a través de la muestra. Una parte de la luz ultravioleta pasará a
través de la muestra y otra parte será absorbida por el ADN/ARN. A mayor cantidad de luz absorbida,
mayor será la concentración de ADN/ARN en la muestra. Por lo cual, el efecto resultante es que
menos luz será detectada por el fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (DO).
Empleando la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz ultravioleta absorbida con
la concentración de la molécula absorbente.
El beneficio de utilizar el análisis espectrofotométrico para determinar la concentración es que
también es posible estimar la calidad o pureza del ADN al utilizar la relación de absorbancia a 260 nm
y a 280 nm. Esta relación es ampliamente utilizada para evaluar la cantidad de proteína contaminante
que queda del proceso de extracción de ácidos nucleicos, ya que las proteínas absorben a 280 nm. Se
ha considerado que el ADN puro, presenta una relación 260/280 de ~1.8 mientras que para el ARN
puro la relación 260/280 es ~2.0. Se ha encontrado que una relación 260/280 baja es indicativa de que
la muestra de ADN o ARN puede estar contaminada con solventes orgánicos, los cuales se han
empleado en el proceso de extracción de los ácidos nucleicos, o con concentraciones muy bajas de
ADN incluso por debajo de 10 ng/ μl, mientras que una relación 260/280 por encima de 2,
normalmente no son sugestivas de ningún problema.

Componentes:
Camara de electroforesis: Brinda el soporte al gel de agarosa y está conectada a una fuente de poder
que facilitara que exista un flujo de los iones. Las moléculas migrarán del polo negativo (cátodo) al
polo positivo (ánodo).
Fuente de poder
Buffer carga: Compuesto por glicerol (molécula que le va a permitir al ADN ser más denso y/o
pesado) y colorantes (azul de bromofenol y xilencianol) para poder mirar la muestra que se está
sembrando y que migran por encima del ADN para monitorear el frente de corrido.
- Xilencianol (TAE: 4.160 pb, TBE: 3.030 pb)
- Azul de BRomofenol (TAE: 370 pb, TBE: 220 pb)
- Anaranjado G (TAE/TBE <50)
Intercalante: Colorante fluorescente que se intercala con el ADN. El gel es sometido a luz
ultravioleta. Tipos: Bromuro de etidio (el más utilizado), SYBR safe, Gel red y EZ-vision. Este es el
que le da el color a la muestra, los colorantes de los buffer de carga no son necesarios realmente, solo
son para ver el frente de corrido.
Marcador de peso molecular: Patrón de bandas específico con tamaños conocidos. Para identificar
qué marcador de peso molecular utilizar se depende del tamaño de la molécula de la muestra.

EXTRACCIÓN DE ARN
Lisis
Enzimática: composición de la pared MO
Física: Perlas de vidrio
Extraccion y Purificacion
Trizol
Fenol pH ácido 4,2 y cloroformo
Concentración
Etanol, Isopropanol
ADNasa

TRIZOL (Solución monofásica de fenol, isotiocianato de guanidina)

- Aislar ARN total de alta calidad a partir de células y tejidos humanos, animales, plantas,
levaduras o bacterias.
 - Permite el aislamiento de ARN, ADN y proteínas de una misma muestra.
- Mantiene la integridad del ARN debido a la inhibición de la actividad de las ARNasas
mientras que se rompen las células y los componentes celulares son disueltos durante la
homogeneización.
- Se añade cloroformo que permite separar en una capa acuosa superior (que tiene ARN) y en
una capa orgánica roja y de interfase inferior (que contiene ADN y proteínas).
Tipos de ARN: mensajero, ribosomal, de transferencia.
https://www.youtube.com/watch?v=9TOicbmuM_U