Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Biología Molecular

Laboratorio 1: Extracción y cuantificación de ADN.

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

1. Aplicar una técnica de extracción de ADN a partir de tejido vegetal, que implica una
combinación de métodos mecánicos, físicos, y químicos.
2. Comprender la función de cada uno de los reactivos utilizados durante la extracción de
ADN
3. Conocer el fundamento de la cuantificación del ADN mediante espectrofotometría
4. Evaluar los resultados de una extracción de ADN utilizando la técnica de
espectrofotometría

INTRODUCCIÓN

Uno de los más importantes avances en la biología ha sido la descripción de la estructura del
ADN (ácido desoxirribonucléico), “la molécula de la vida”. El estudio de sus propiedades
fisicoquímicas y biológicas ha resultado en un enfoque completamente novedoso en lo
referente al origen, flujo, y almacenamiento de la información genética en los organismos vivos
(lo que se considera el dogma central de la biología molecular). Además, el conocimiento de la
estructura del ADN ha hecho posible el desarrollo de soluciones médicas concretas a través de
la ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante.

Marco Teórico

El ADN es una estructura termodinámicamente estable, aunque su contenido de información es

dinámico y sujeto al cambio. El efecto de su expresión es de enorme complejidad y plasticidad.
Estos dos hechos definen la originalidad de un organismo, lo cual lo hace ligeramente distinto
de otros individuos de su misma especie, y completamente diferente de organismos de otros
grupos o taxa que al igual que él comparten el hecho de poseer moléculas de ADN.

El ADN como macromolécula es un polímero de carácter ácido, con características

fisicoquímicas propias, responsable de la generación, transmisión, y almacenamiento de la
información hereditaria en todo organismo vivo. Todas las células eucariotas poseen ADN en
su núcleo (ncDNA), y también en organelos como cloroplastos (en plantas; cpDNA) y
mitocondrias (mtDNA). En procariotas (e.g., bacterias), el ADN se encuentra en el citoplasma
ya que estas carecen de membrana nuclear. El ADN se encuentra asociado a diferentes
proteínas (eg. histonas), estableciendo complejos especiales que resultan en diversos niveles
de organización dentro de los cuales los cromosomas son los más representativos.

Una molécula de ADN consiste en dos cadenas unidas por puentes de hidrógeno formando una
doble hélice (Fig. 1). Cada cadena es una secuencia repetitiva de unidades similares llamadas
nucleótidos, cada uno compuesto de un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada (Fig.
1). Cuatro bases diferentes están presentes en el ADN: adenina (A), timina (T), citosina (C) y
guanina (G). Los puentes de hidrógeno forman pares de bases que son complementarias: A
siempre estará unida a T por dos puentes de hidrógeno, mientras que G estará unida con C por
tres puentes de hidrógeno (Fig. 1). Este patrón garantiza que la secuencia de bases a lo largo
de una de las cadenas es exactamente complementaria a la otra, lo cual indica que ambas
cadenas conservan la misma información genética. El orden específico de las bases a lo largo
de la cadena se conoce con el nombre de secuencia del ADN. La secuencia específica son las
instrucciones genéticas exactas requeridas para crear un individuo con características únicas.
La información genética contenida en el ADN puede entonces ser definida como frases escritas
usando las bases A, C, T y G como alfabeto. El tamaño del genoma corresponde al número
total de pares de bases.

Figura 1. Estrucutra de ADN. La doble hélice del ADN está compuesta por dos cadenas
anitparalelas (una corre en dirección 3'→5', y la complementaria en dirección 5'→3'). La
posición 3' o 5' se refiere a la posición de los carbonos del azúcar. El carbono 5 está unido al
grupo fosfato y el carbono 3 está unido a el grupo hidroxilo. Cada cadena consiste en una
azúcar, un grupo fosfato, y un nucleótido (A, T, C, G).

Responda: En la figura 1, cuál es la secuencia del ADN leída en sentido 3'→5'?

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 Seguridad durante la práctica:

Normas de seguridad: El estudiante debe referirse al manual de normas de

seguridad

Elementos de protección personal:

 Es INDISPENSABLE utilizar bata de laboratorio durante el desarrollo de
la práctica. Las piernas y los pies deben estar cubiertos también (ie. no
shorts, ni faldas, no sandalias!)
 Utilizar guantes de látex SIEMPRE que se manipulen muestras
biológicas (por seguridad personal y para no contaminar la muestra!)

Manejo de residuos químicos: Tanto por razones de seguridad como por

respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos generados en
las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por esto el
estudiante debe:

 Utilizar los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos

de laboratorio, los cuales están debidamente identificados según el tipo
de sustancia a desechar.
 Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para
evitar reacciones no controladas y potencialmente peligrosas. No arrojar
por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el
desarrollo de la práctica.
 Si tiene alguna inquietud comuníquela al responsable del laboratorio,
quien le indicará la forma correcta de desechar el material.

ACTIVIDAD 1: EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE TEJIDO FOLIAR

VEGETAL

Objetivos

- Aplicar una técnica de extracción de ADN a partir de tejido vegetal: Aislamiento del material
genético (Ácido Desoxirribonucleico o ADN) de células de Fresa (Fragaria sp) y otra fruta de su
selección, mediante un método de extracción rápido y sencillo.
- Comprender la función de cada uno de los reactivos utilizados durante la extracción de ADN

Introducción

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. Recordemos que el ADN se
encuentra en el núcleo de la célula, y las mitocondrias y cloroplastos. Entonces, en primer
lugar, tiene que romperse la pared celular (en plantas) y la membrana plasmática para poder
acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear
para dejar libre el ADN. Luego, se deben eliminar las proteínas asociadas al ADN, y proteger el
ADN de enzimas que puedan degradarlo. Por último, se aísla el ADN. Para cada uno de estos
pasos existen diferentes formas de hacerlo! El proceso de extracción se puede dividir en las
siguientes etapas:
 a. Maceración mecánica del tejido para romper las paredes y membranas celulares. Para
lograrlo se puede emplear nitrógeno líquido congelando totalmente las muestras. La
tarea de pulverizar el tejido se logra utilizando un mortero o agitadores mecánicos.
Dependiendo del tipo de tejido que se utilice: material vegetal, o tejido animal (músculo,
hígado) o sangre, se utilizan diferentes protocolos para acceder al ADN.

b. Lisis celular a través de una solución buffer, que contiene: un detergente, un agente
quelante de iones (EDTA) y el buffer (TRIS), los cuales se utilizan con la finalidad de
solubilizar las membranas lipo-protéicas y desnaturalizar proteínas que puedan
degradar el ADN. En este paso normalmente las muestras son sometidas a una
temperatura de 65°C.

c. Extracción de lípidos y proteínas mediante tratamiento con un solvente orgánico.

Luego de unos minutos de centrifugación se generan dos fases, una orgánica y otra
acuosa. El ADN, ARN y algunos polisacáridos son retenidos en la fase acuosa.

d. Precipitación del ADN por tratamiento con sales y alcohol. El ADN, al ser hidrofílico,
forma un precipitado en presencia de sal y alcohol, el cual en ocasiones puede ser
visible a simple vista.

e. Lavado del ADN con alcohol.

f. Rehidratación del ADN en una solución buffer Tris-EDTA que contiene ARNasa, una
enzima que se encarga de degradar el ARN presente, quedando sólo el ADN purificado.

MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO:

Equipos/insumos Cantidad
Gradilla para tubos de 1.5ml 1
Cuchilla minora 1
Mortero 2
Pipeta graduada de 10ml 1
Probeta de 100ml 1
Micropipeta de 200µl 1
Pipeta Pasteur 1
Tubo Falcon de 50ml 2
Tubo eppendorf de 1,5ml 4
Puntas de micropipeta 10-200µl 1 caja para todo el curso
Espectrofotómetro 1 para todo el curso
Hielera de Icopor 1 und por salón de clase
Hielo 10 kg por salón de clase
Bandeja para descarte 1 und

Reactivos Cantidad por grupo

Solución de SDS al 10% 15ml
Solución de NaCl 5M 250µl
Etanol al 96%, frío a -20ºC 50ml
Buffer TE (Tris-HCl10 mM /EDTA 500ml para todo el curso
1mM)
Metodología

1. Corte su fruta (fresa y otra) en trozos pequeños utilizando la cuchilla. Macere el tejido (1
o 2 fresas maduras) empleando el mortero. Hágalo lentamente, teniendo cuidado de no
salpicar, hasta que quede una masa homogénea idealmente sin grumos. Macere cada
fruta por separado, asegurándose de no contaminar las muestras.

2. Deposite 1ml de líquido resultado del tejido macerado (utilizando una pipeta pasteur) en
un tubo Falcon de 50ml debidamente marcado. Evite agregar pulpa! Intente pasar solo
líquido (juguito) para aumentar el éxito de su extracción. Su marca en el tubo debe
identificar: 1. Su grupo y 2. El tipo de muestra.

3. Adicione 2ml de solución SDS al 10% y agite por inversión durante 1 minuto.

4. Adicione 100µL de solución de NaCl 5M y nuevamente agite activamente durante 1

minuto.

5. Añada 10ml de etanol al 96% (debe estar a una temperatura de -20ºC). Agite por
inversión (muy suavemente).

6. Anote sus observaciones. Qué está ocurriendo en este paso?

7. Remueva el ADN con una punta de micropipeta, y transfiérala a un tubo eppendorf

debidamente marcado.

8. Deje secar el botón de ADN (la nubesita que removió en el paso anterior) a 55ºC por 20
minutos.

9. Adicione 2ml de Buffer TE. Use el vórtex para homogenizar.

ANALICE Y RESPONDA

1. De acuerdo a las seis etapas (a, b, c, d, e y f) mencionadas en la introducción de la

guía, ¿cuáles pasos (1-9) de la metodología descrita, corresponden a cada una de
estas etapas? Expliqué cuál es la función de, y cómo actúa cada uno de los reactivos.

2. Qué pasó cuando se adicionó el etanol a la muestra? Hubo algún cambio?

En su informe, incluya fotos de sus resultados con las diferentes frutas, y compare
brevemente lo que obtuvo (cuál funcionó mejor y especule porqué)

ACTIVIDAD 2: CUANTIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO UTILIZANDO

ESPECTROFOTOMETRÍA

Objetivos

- Conocer el fundamento de la cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

- Evaluar los resultados de una extracción de ADN utilizando la técnica de espectrofotometría
Metodología

1. En un tubo eppendorf debidamente marcado, realice una dilución 1:100 (10 µl de la

muestra en 990 µl de buffer TE) de cada una de sus extracciones de ADN.

2. Calibrar a cero el espectrofotómetro con el buffer TE.

3. Una vez calibrado, adicione x vol. la dilución de la muestra en una cubeta de cuarzo.
Mida y registre el valor de la D.O. a 260 y 280 nm.

4. Estime la concentración de ADN en la muestra utilizando la siguiente relación:

[ADN] = 50 µg.ml-1x D.O.260nm x factor de dilución

5. Calcule de relación 260/280 a partir de los resultados de la D.O

Presente sus resultados en forma de tabla, incluyendo la concentración de ADN y la relación

260/280. No olvide la leyenda de la tabla.

ANALICE Y RESPONDA

1. Compare los resultados obtenidos con cada una de sus frutas. Encontró diferencias?
Son similares? A qué se puede deber estos resultados?

2. A qué parte de la estructura de la molécula del ADN se debe la absorción de luz

ultravioleta observada en el espectrofotómetro?

3. Por qué considera que es necesario estimar la concentración del ADN aislado?

4. Qué indica la relación 260/280 sobre la calidad del ADN?

5. Con base en la concentración y pureza de la muestra de ADN que extrajo en el

laboratorio (para cada una de sus frutas), determine si el protocolo de extracción usado
fue eficiente o no, según lo reportado en la literatura.

REFERENCIAS:

Edwards K., Johnstone C. and Thompson. 1991. A simple and rapid method for the preparation
of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research, Vol. 19 No. 6).

Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.

González D.O. et al. 1995. Protocolos para Marcadores Moleculares. Unidad de Investigación
en Biotecnología, CIAT, Cali, Colombia. Publicación CIAT No. 258.