UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFÍA

MOLECULAR BBIOLOGY FOR ENGINEERS

2022-II
Práctica 1: EXTRACCION de DNA GENÓMICO Y CUANTIFICACIÓN DE DNA

INTRODUCCION

La extracción de DNA a partir de diversos organismos es un paso importante en

muchos protocolos de biología molecular. Consta la lisis de las células y solubilización del
DNA, seguido de uno o varios métodos químicos o enzimáticos que permiten la eliminación
de proteínas, RNA y otras macromoléculas. El método de extracción dependerá del tipo de
la muestra a utilizar, el tipo de DNA a purificar (genómico, plasmídico, mitocondrial), así como
de la calidad y nivel de pureza del DNA que se requiera para ser utilizado en técnicas de
análisis moleculares posteriores.
La lisis celular se realiza en presencia del EDTA, un agente quelante de iones
divalentes como el Mg+2, cofactor de nucleasas que degradan el DNA. La membrana celular
puede ser solubilizada utilizando detergentes o puede ser digerida enzimáticamente (por
ejemplo: Lisozima para digerir las paredes celulares de las bacterias). La lisis celular puede
también ser llevada a cabo por métodos físicos como el cambio brusco de temperaturas (frío-
calor-frío). Por otro lado, de utilizar un protocolo de ruptura mecánica, ésta debe ser mínima
para evitar fragmentar el DNA y llevado a cabo a 4oC. Durante la lisis celular puede
realizarse la remoción de RNA tratando la muestra con ribonucleasa libre de DNasa (DNAse
free RNase).
El contaminante más común en las extracciones de DNA son las proteínas. Estas
pueden ser removidas mezclándolas con fenol saturado en buffer Tris (pH 8.0) o con una
mezcla de fenol/cloroformo, el cual denatura las proteínas pero no los ácidos nucleicos. Esta
mezcla produce una emulsión, la cual al ser centrifugada permite obtener dos fases: la fase
inferior orgánica y la fase superior acuosa (donde se encuentra el DNA) separada por una
interfase de proteínas denaturadas. Existen otros métodos de remoción de proteínas como
la utilización de soluciones concentradas de sales (salting out), guanidina isotiocianato y
columnas de intercambio iónico o columnas de sílica.
La precipitación del DNA se lleva a cabo mezclando la preparación con sales como
acetato de sodio, NaCl, acetato de amonio, etc, y la adición de etanol absoluto o isopropanol.
Luego de la centrifugación el pellet de DNA puede ser lavado con etanol 70% para remover
el exceso de sales. El DNA puede ser solubilizado y almacenado en buffer conteniendo
EDTA (4oC hasta un mes) o con agua milliQ estéril (-20oC). Congelar y descongelar
repetidamente el DNA purificado conlleva a su degradación.
Es necesario minimizar la contaminación de la muestra con DNasas provenientes del
laboratorio y del operador. Es por eso necesario utilizar guantes, material y soluciones
esterilizadas por autoclave, reactivos libres de nucleasas, materiales nuevos en lo posible,
para evitar la incorporación de detergentes, o cualquier otro inhibidor que dificulte técnicas
posteriores a la purificación. La utilización de soluciones de hipoclorito de sodio para limpieza
de la mesa de trabajo, las puntas con filtro, micropipetas de desplazamiento positivo y
separación de materiales y de ambiente de procesamiento de la muestra con respecto a
otras técnicas, evitarán la contaminación de la extracción con DNA exógeno a la muestra.
Existen técnicas que permiten la cuantificación de ácidos nucleicos. Dependiendo de la
condición en la que se encuentre el DNA aislado se elige la más adecuada. Si la muestra de
DNA se encuentra pura, sin contaminantes como fenoles, proteínas, agarosa u otros ácidos
nucleicos, se puede utilizar la espectrofotometría. Por espectrofotometría se puede detectar
5-90 g/mL de DNA. Actualmente existen equipos como el NanoDrop TM, que permite
detectar por espectrofotometría 0.4-2ng/uL de DNA. Para cuantificar DNA o ARN por
espectrofotometría, se toman lecturas a 260nm y 280nm.

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La lectura a 260nm, nos permite la cuantificación del DNA, considerando que 1OD
equivale a:

- 50 ug/mL de DNA de doble cadena

- 33 ug/mL de DNA de simple cadena
- 20ug/mL de oligonucleótidos
- 40ug/mL para RNA.

La lectura a 280nm nos indica el grado de contaminación de la muestra ya sea con

proteínas o fenoles u otros contaminantes químicos utilizados durante la purificación del
DNA. El ratio A260nm/A280nm=1.8 indica una preparación pura de DNA. Si el valor es menor de
1.8, la muestra de DNA está contaminada con proteínas.

OBJETIVOS

• Extraer DNA genómico a partir de un cultivo de E. coli HB101 (PARTE I)

• Cuantificar el DNA genómico y verificar la calidad del DNA extraído por
espectrofotometría (PARTE II)

PARTE I

Extracción de DNA genómico a partir de un cultivo de E. coli HB101

Materiales y reactivos

o Micropipetas automáticas
o Baño maría
o Tips amarillos y azules estériles de punta roma
o Tubos de microcentrífuga 1.5mL estériles
o Buffer TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8)
o SDS 10% (Sodium Dodecyl Sulphate, dodecil sulfato de sodio)
o Proteinasa K (20 mg/mL)
o Acetato de sodio 3M, pH 5.2 (ajustar pH con ácido acético glacial)
o Isopropanol
o Etanol al 70% helado
o Cultivo de E. coli en caldo LB-Amp (Extracto de levadura 5g/l, Triptona 10g/l NaCl
10g/l, pH 7.4, ampicilina 100 ug/mL)

Procedimiento

Colección de células
Previo al inicio de la práctica se ha inoculado una colonia de E. coli, en medio LB-Ampicilina.
Se ha incubado durante la noche a 37ºC y con agitación vigorosa (200 rpm).

1. En su mesa encontrará un tubo de microcentrífuga con 1mL de cultivo de E. coli.

Centrifugar a máxima velocidad por 30 seg.
2. Eliminar el sobrenadante e invertir el tubo sobre un papel toalla limpio.

Lisis celular

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 3. Resuspender el pellet celular con 475 µL de Buffer TE mediante pipeteo (aspirar y
expulsar el líquido varias veces sobre el precipitado hasta que desaparezca).
Adicionar 25 µL de SDS al 10%.
4. Incubar a 80oC por 15 min.
5. Colocar inmediatamente en hielo por 5 min.

Digestión proteica

6. Atemperar la mezcla, adicionar 20 µL de Proteinasa K e incubar a 56oC 20 min.

7. Centrifugar a máxima velocidad por 5 min.
8. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5mL.

Precipitación del DNA

9. Adicionar 50 µL de acetato de sodio 3M pH 5.2.

10. Adicionar 500 µL de isopropanol y mezclar suavemente por inversión.
11. Con la punta doblada de un tip, colectar el DNA y transferirlo a un tubo de 1.5mL con
500 µL de etanol 70% helado.
12. Centrifugar a 13000 rpm por 10 min.
13. Eliminar el sobrenadante.
14. Adicionar 500 µL de etanol 70% helado. Mezclar con ayuda del vortex.
15. Centrifugar a 13000 rpm por 5 min.
16. Secar el DNA a temperatura ambiente por aprox. 10 min.
17. Resuspender el DNA en 40 µL de Buffer TE. Si observa que su muestra está muy
viscosa adicionar 40uL más de buffer TE.
18. Incubar el ADN a 65oC por 5min, con la tapa abierta en el baño maría.
19. Almacenar a -20C hasta su uso.

PARTE II

Cuantificación de DNA por espectrofotometría

Materiales y reactivos
o Micropipetas
o Tubos 1.5ml, puntas estériles
o Buffer TrisHCL 10mM pH 7.5
o Cubetas descartables UV-Vis
o Espectrofotómetro UV.

Procedimiento
1. En un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL mezclar 490 L de Tris HCL 10mM pH 7.5
con 10 L de DNA.
2. Colocar 500 L de Tris HCL 10mM pH 7.5 en una cubeta, y colocarla en el
espectrofotómetro.
3. Realizar la lectura en el espectrofotómetro a 260 nm. Llevar la absorbancia a 0.
4. Realizar la lectura de la dilución del DNA del paso 1 a 260nm.
5. Repetir los pasos 2-4, pero a 280 nm.
6. Calcular la concentración de DNA teniendo encuentra que: 1 OD = 50g/mL DNA.
7. Calcular el ratio A260nm/A280nm.

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CUESTIONARIO

1. Realice un flujograma que muestre el procedimiento realizado para la extracción de

ADN genómico de la bacteria (incluya este esquema en la sección material y métodos
de su informe). Resalte los pasos principales de la extracción.
2. ¿Qué método ha utilizado en clase para obtener DNA a partir de E. coli?.
3. ¿Cuál es la función del buffer de lisis?
4. ¿Qué es la proteinasa K, qué función tiene?
5. ¿Cuál es el principio de la precipitación etanólica del DNA?
6. ¿Cómo comprueba Ud. la calidad y pureza del DNA obtenido de la extracción
realizada?
7. ¿El procedimiento utilizado en la práctica le permite obtener ADN purificado?¿Cómo
modificaría Ud el protocolo para obtener un ADN con un A 260nm/A280nm= 1.8?
8. ¿Qué otras técnicas existen para cuantificar DNA?

BIBLIOGRAFIA

• Ausubel F., Brent, Kignston R., Moore D., Seidman J., Smith J. y Struhlk. 2003.
Current Protocol in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-
Interscience.
• Sambrook, J & D, Russell. 2001. Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1.
Editorial CSHL. EE.UU.
• Promega. Protocols and Applications Guide: The Source for Discovery. En:
http://www.promega.com/paguide/