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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS


Integrantes:

Jenny Cholango.
Carolina Donoso.
Leonardo Figueroa.
Cristian Pinta.
Dayana Villarreal.

Grupo: 8.
Carrera: Qumica Farmacutica.

Extraccin de ADN
Los protocolos de extraccin de ADN tiene el objetivo de obtener cantidad y
calidad de ADN ntegro, puro y reproducible, garantizando la eliminacin de
inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molcula
por eso han permitido estudiar con mayor precisin los patrones de diversidad
gentica y su distribucin; el comportamiento; la seleccin natural; las
interacciones biolgicas; la composicin, funcionamiento y dinmica de
comunidades microbianas, etc.
Debido a la gran variedad de protocolos basados en la capacidad de repelerse
de grupos fosfato por la carga neta negativa, los criterios para seleccionar el
protocolo son los siguientes:

cido nucleico diana


Organismo fuente
Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.)
Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la
purificacin)
Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis
de ADNc, etc.)

As
se catalogan en protocolos tradicionales y comerciales, estos se
desarrollan en varias etapas:

Colecta
de la
muestra.- Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite obtener
ADN ntegro y sin contaminantes, dependen del tipo de muestra que se usara:
Plantas.- Se colecta tejido foliar (tejido joven ya que contiene ms clulas por
unidad de peso que el tejido viejo y posee menos polisacridos y polifenoles
que dificultan la extraccin) e inmediatamente se congela en nitrgeno lquido
para evitar la formacin de cristales y que se sinteticen metabolitos
secundarios despus de la abscisin. Si el tejido es obtenido de invernaderos o
cultivo in vitro, no es necesario congelar el material, se puede hacer la
extraccin directamente, y se almacena el tejido a -80 C antes de la
extraccin.
Animales.- En tejidos se corta el tejido en pedazos pequeos (aprox. 0.5x0.5
cm) para facilitar su maceracin posterior, congelarse con nitrgeno lquido a
-80 C antes de la extraccin. En Sangre se utilizan agujas de calibre
apropiado, no movimientos bruscos durante el transporte para evitar la
hemlisis, coagulacin o contaminacin bacteriana. Las muestras pueden
mantenerse por unos das a 4 C despus de su colecta.
Homogenizacin de la muestra.- La homogeneizacin de la muestra
consiste en romper las uniones entre las clulas para facilitar la interaccin con
las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material gentico, puede ser
mecnica o qumica:
La homogeneizacin mecnica:
-Nitrgeno lquido: Macerar la muestra con nitrgeno lquido, en un mortero
de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrgeno lquido, congela
de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la
clula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradacin.
Si la muestra ya est congelada, se deber disgregar con nitrgeno lquido

para evitar la degradacin del ADN por accin de las DNasas. Ej: semillas,
plntulas, tejidos fibrosos o viscosos y hongos.
-Pistilos u homogeneizadores: Los pistilos disgregan la muestra mediante
friccin con la pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se
puede utilizar algn material abrasivo como vidrio pulverizado o resinas.
Cuando se utilizan dispositivos es necesario colocar el tubo sobre una cama
de hielo, lo cual evita que el ADN se fragmente por el calor que genera la
friccin. Con tejidos congelados se recomienda que el tejido se disgregue en
presencia de nitrgeno lquido.
Homogeneizacin qumica: La muestra se mantiene en solucin a altas
temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrpicos
que rompen las uniones entre las clulas o que incluso pueden perforar la
membrana celular. Ej: bacterias
Lisis celular.- Durante el proceso de lisis las interacciones entre las molculas
que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o
destruyen permitiendo que los cidos nucleicos se liberen, esto se realiza
mediante detergentes (SDS, Triton o detergentes comerciales), tambin se
emplean mtodos fsicos, como aquellos basados en ultrasonido, pero como un
mecanismo de defensa natural, las clulas contienen enzimas que destruyen al
ADN (ADNasas). Para esto se utilizan mtodos fsicos, tales como
desnaturalizacin por calor (a temperaturas de 65C) o con mtodos qumicos
como solventes orgnicos (fenol y cloroformo), antioxidantes (Ditiothreitol y mercaptoetanol), agentes quelantes (EDTA, EGTA) que capturan los iones
magnesio necesarios para la funcionalidad de las ADNasas, o agentes
caotrpicos que actan removiendo el agua estructural de las protenas.
1. Protocolo tradicional
Separacin de protenas y lpidos
En esta etapa se separa el ADN de las protenas y lpidos mediante solventes
orgnicos y ciclos de centrifugacin. Se utiliza la fuerte tendencia hidroflica de
los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las
protenas y los lpidos se separan en solventes orgnicos. La fase acuosa y la
orgnica se separan por centrifugacin lo que permite aislar al ADN. Los
solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol
isoamlico. Estos reactivos contaminan fcilmente el ADN, por lo que se debe
evitar acarrearlos en el proceso de purificacin.
Precipitacin del ADN
Despus de que son eliminados los lpidos y las protenas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones
de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las
fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre s
mismo hacindolo insoluble. Un paso de centrifugacin permite que el ADN
permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los

restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente


se elimina por evaporacin.
Redisolucin del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN
para mantenerlo en solucin. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7
para permitir la redisolucin completa del ADN y evitar una hidrolisis cida.
Cuando se utiliza una solucin amortiguadora, es preferible utilizar una
solucin de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para
almacenar el material. Cuando se est disolviendo el ADN es importante evitar
el pipeteo y la agitacin agresiva pues se pueden fragmentar molculas de alto
peso molecular. Una opcin que evita la fragmentacin consiste en incubar a
55C el ADN, 1 a 2 horas con agitacin suave.
2. Protocolo comercial
Unin del ADN a la matriz inorgnica y lavado
En el caso del kit con membrana de slice, en algunos casos a la mezcla de lisis
se le aade la solucin de unin que tiene un pH especfico. Antes de pasar la
solucin de lisis a travs de la columna, se adiciona etanol a la solucin,
eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato,
facilitando con ello la adsorcin de la molcula a la membrana cargada
positivamente. Los lpidos y protenas no son afines a la membrana y se
eliminan con ayuda de la solucin de lavado y un ciclo de centrifugacin,
mientras que el material gentico permanece unido a la matriz. El kit con
perlas magnticas adems de utilizar soluciones a pH especficos, utiliza un
imn o magneto que atrae a las perlas para separarlas de las soluciones en las
que se encuentran suspendidas. En este caso, se aade a la solucin de lisis
una solucin amortiguadora a pH cido que permite que las perlas se carguen
positivamente, favoreciendo la unin de ADN. Las protenas y lpidos tienen
baja afinidad por las perlas y son eliminados con soluciones de lavado a pH
fisiolgico. Las perlas son retenidas en la pared del microtubo con el magneto,
mientras que la solucin con los contaminantes se eliminan por pipeteo.
Recuperacion Del ADN De La Matriz
En los kits es necesario liberar el ADN de la matriz.

La membrana y el ADN se deshidratan con soluciones de lavado y ciclos


de centrifugacin.
Luego se recomienda centrifugar nuevamente la columna.
De modo que se evapore el etanol y eliminar el exceso de las
disoluciones.

Posteriormente se adiciona agua o solucin amortiguadora al centro de


la membrana, se espera que el ADN se hidrate, se centrifuga para
recuperarlo de la matriz y resuspederlo.

En el protocolo de perlas magnticas se utiliza una solucin bsica de tris-HCl


10mM con un pH de 8.5 para neutralizar la carga de perlas. El ADN se separa
de las perlas y se transfiere a otro tubo, mientras que las perlas son retenidas
por el magneto.
La mayora de los kits tienden a ser generales a la hora de su aplicacin, pero
se disean con un propsito especfico. Ejemplo: Un kit para extraer ADN de
sangre total, considera la presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el
proceso.
Dicho mtodo ser ms agresivo en comparacin con un kit diseado para
extraer ADN de clulas o tejidos animales. En los manuales proporcionados por
las fbricas se detallan adems de los pasos a seguir en cada caso:
La cantidad de muestra recomendada y el rendimiento esperado de acuerdo al
tipo de tejido (Invitrogen 2005). Dicha informacin se debe tomar en cuenta al
momento de elegir un Kit.
Mtodos De Anlisis
Cuantificacin del ADN:

Una vez obtenido el material gentico, es importante determinar el


rendimiento mediante espectrofotometra.
La ley de Beer-Lambert indica que la concentracin de una molcula en
solucin depende de la cantidad de luz absorbida de las molculas
disueltas.
Una caracterstica del ADN es que absorbe luz ultravioleta UV 260 nm y
permite estimar su concentracin mediante espectrofotometra.
Si la longitud de la celda en la que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la
absorbancia es igual a la densidad ptica (DO). En ADN genmico (doble
cadena), la densidad ptica equivale a 50 ug/ml.
Se debe considerar el factor de dilucin para obtener la concentracin
nanogramos por microlitro (ng/ul). En el caso del espectrofotmetro
Nanodrop, no es necesario diluir la muestra.
Para la reaccin de PCR se necesitan de 10 a 200 ng, se debe obtener al
menos 5 ng/ul de ADN en cada muestra, las concentraciones menores
dificultan la estandarizacin por PCR u otras tcnicas.
Una segunda valoracin de la pureza de cidos nucleicos es la
proporcin 260/230, y sus valores aceptados se encuentran de 2,0 a 2,2;
si la relacin es menor indican la presencia de contaminantes como
carbohidratos o fenol.
Para estimar la pureza del ADN se toma en cuenta la proporcin de la
absorbancia a 260 nm y 280 nm.

Proporcin=1,8 es ADN puro, si el valor es mejor que 1,8 indica la


presencia de protenas.

Comprobacin De La Integridad Del ADN Por Electroforesis

La integridad del ADN se puede observar mediante electroforesis en gel


de agarosa.
Si ADN est integro, se debe observar una banda estrecha cercana al
pozo en el que se coloc la mezcla del ADN.
Si est fragmentado se observar una banda de ms de 1 cm de ancho
o un sendero luminoso en el carril de la muestra.

Almacenamiento Del ADN


Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y analizado mediante
electroforesis, una parte de la muestra se puede almacenar a 4 C para los
anlisis inmediatos y el material restante a -20 C o -80 C, para una
preservacin por varios meses. En este ltimo caso es conveniente que
el ADN se conserve en soluciones con baja concentracin de sales para inhibir
la accin de DNasas contaminantes.
Ventajas Y Desventajas De Los Protocolos De Extraccin Tradicionales
Y Comerciales
La obtencin de ADN ntegro y puro es una parte fundamental para el buen
desempeo de las tcnicas utilizadas en biologa molecular.
Una de las ventajas de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as
como un alto rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido est
fragmentado. Estos mtodos son susceptibles de contaminacin, variacin y
errores por los mltiples pasos de manipulacin.
En los ltimos aos ha aumentado el uso de los de mtodos de extraccin
comerciales debido a que la matriz permite capturar selectivamente
al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con molculas
ntegras; al tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y se
disminuye la posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno.

Fig. Ventajas y desventajas de los mtodos tradicionales y comerciales


de extraccin y purificacin de ADN.
Perspectivas
Uno de los objetivos principales de los mtodos modernos de extraccin es
automatizar el proceso, mediante el uso de kits y extractores automticos
robotizados con la mnima intervencin de operadores, que permitan mejorar
la precisin, obtener resultados reproducibles y reducir el tiempo de
extraccin, en particular cuando se requiere procesar una gran cantidad de
muestras.
La extraccin de ADN ntegro y sin contaminantes es esencial para tener xito
en la obtencin de datos genticos, es el primer paso en la lista de tcnicas
moleculares que nos llevarn a comprender mejor y conservar la diversidad
biolgica a partir del conocimiento de genes y genomas que anteriormente era
inaccesible para le ecologa y la evolucin.
Protocolos de extraccin de ADN implementados en el laboratorio de
Evolucin Molecular y Experimental del Instituto de Ecologa
En el laboratorio se utilizan tres tipos de mtodos para la extraccin de ADN,
modificados de protocolos previos:

Extraccin de ADN en bacterias gram negativas


Extraccin de ADN en plantas
Extraccin de ADN en animales

Estos mtodos se basan en la lisis celular, eliminacin de protenas,


precipitacin y limpieza del ADN, debido presentan algunas ventajas: son

econmicos, no se manejan compuestos qumicos txicos o contaminantes al


ambiente y se obtienen grandes cantidades de ADN; pero tambin tienen
desventajas como: la pureza del ADN no es absoluta y en algunas especies se
obtiene un ADN parcialmente degradado (en pedazos).
Se utilizan paquetes comerciales cuando se requiere ADN de alta calidad o
bien se trata de organismos de cierto grado de complejidad como algunas
bacterias Gram positivas o plantas que naturalmente producen gran cantidad
de compuestos secundarios. Algunos paquetes comerciales de alto
rendimiento son: PURIGEN, QUIAGEN, MILIPORE, GENTRA, MoBio, etc.
Extraccin De ADN De Bacterias Gram Negativas
1. Obtener un cultivo nuevo de bacterias. En un microtubo de 1.5 ml agregar
0.5 ml de sulfato de magnesio 10 mM y resuspender en l una asada de
bacterias.
2. Centrifugar a 4500 xg por 3 minutos y eliminar el sobrenadante
perfectamente escurriendo las muestras en papel secante.
3. Resuspender en 300 l de buffer Tris HCl2 0.1M pH 8.
4. Adicionar 40 l de lisozima (20 mg/ml) y 5l de ARNasa (7000 U/ml).
5. Incubar a 37 C por 5 min., posteriormente a -20C durante 10 min. Y
finalmente a 85 C durante 10 min. Entre cada incubacin, mezclar
vigorosamente.
6. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ml).
7. Incubar a 70C durante 10 min., durante la incubacin invertir manualmente
5-10 veces.
8. Centrifugar a 8 000 xg durante 1 min.
9. Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 l), sin tocar el botn y transferir a
un tubo nuevo. Adicionar 150 l de isopropanol absoluto fro (a -20 C).
10. Incubar a -20 C durante 30 min.
11. Centrifugar a 10 000 xg durante 3 min. Eliminar perfectamente el
sobrenadante.
12. Limpiar el botn con 300 l de etanol al 70% agitando brevemente en
vrtex.
13. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min. Eliminar perfectamente el
sobrenadante.
14. Secar perfectamente el botn a 65 C por 5 min. Y resuspender en 50 a
00l de agua pura, desionizada y estril.
Un mtodo alternativo y muy eficiente es utilizar las soluciones del paquete de
la marca PUREGENE, al que aplicamos las siguientes modificaciones:
Tratamiento previo

1. Cultivar las bacterias en medio slidas, pobres en nutrientes, durante el


tiempo necesario para obtener un crecimiento abundante pero de clulas
jvenes.
2. En un tubo de 1.5 ml estril agregar 0.5 ml de sulfato de magnesio 10 mM
3. Agregar una asada pequea de bacterias (calculando una cantidad de 2
colonias medianas) y homogeneizar perfectamente pipeteando suavemente.
4. Incubar en hielo durante 10 min.
5. Centrifugar a 7000 xg durante 5 min. A 4 C.
6. Eliminar totalmente el sobrenadante colocando los tubos boca-abajo en un
papel secante.
Lisis celular
1. Agregar 300 l de solucin de lisis y resuspender las clulas pipeteando
suavemente varias veces.
2. Incubar a 80C por 5 min. Es conveniente mezclar invirtiendo los tubos 5-10
veces.
3. Incubar a 20C por 5 min.
4. Mezclar vigorosamente durante 10 seg.
Tratamiento con ARNasa
1. Agregar 4 l de solucin de ARNasa.
2. Mezclar invirtiendo los tubos 25-30 veces.
3. Incubar a 37C durante 15-30 min. Conservar en hielo.
Precipitacin de protenas
1. Agregar 100 l de Solucin de Precipitacin.
2. Mezclar vigorosamente durante 20 seg.
3. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min.
4. Tomar 300 l del sobrenadante, cuidando de no tocar el botn y transferirlos
a un tubo nuevo. Conservar en hielo.
Precipitacin de ADN
1. Agregar 300 l de isopropanol absoluto y fro (a -20C).
2. Mezclar invirtiendo los tubos 50 veces. Dejar reposar durante 1 hora a
-20C.
3. Centrifugar a 8 000 xg durante 1-2 min.
4. Eliminar el sobrenadante y escurrir perfectamente los tubos en papel
secante.
5. Agregar 300 l de etanol fro al 70%. Mezclar vigorosamente durante 5 seg.

6. Centrifugar a 10 000 xg y eliminar perfectamente el sobrenadante


escurriendo en papel secante.
7. Incubar el botn a 65C durante 1 min. Ventilar en la campana de flujo
laminar por 5 min.
Hidratacin del ADN
1. Agregar de 20 a 50 l de Solucin de Hidratacin.
2. Incubar a 65C durante 5min.

Extraccin De ADN En Plantas


Para extraer ADN en plantas se ha usado ciertos protocolos, que son
codificados del protocolo original conocidos como mini-prep.
Un factor determinante para obtener ADN de calidad es controlar la
concentracin de sales residuales, que deben ser eliminadas.
Para ello existen protocolos de limpieza con fenol-cloroformo, pero nosotros
hemos llegado a controlar el exceso de sales directamente desde la
elaboracin de los buffers de extraccin, evitando con ello el manejo del fenol
que es altamente contaminante y peligroso.
Lo que hacemos realizar una extraccin preliminar y medir su calidad en un
biofotmetro; si las lecturas indican exceso de sales reducimos el NaCl al
mnimo posible.
Esto se debe a que algunas plantas acumulan sales en sus tejidos y la reaccin
se satura de sales.
En otros grupos de plantas como cactceas y crasulceas, la extraccin de
ADN resulta ms difcil por la presencia de una gran cantidad de
mucopolisacridos y compuestos secundarios, en cuyo caso hemos logrado la
extraccin aplicando el siguiente protocolo bsico, que modificamos en
algunos pasos segn los requerimientos de las plantas.
Extraccin de ADN total de plantas suculentas por el mtodo CTABSTE

Moler 0.5 g de tejido fresco con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo
fino.
Agregar 260 l de CTAB y 975 l de STE, agitando hasta obtener un
jarabe.
Agregar 65 l de SDS al 20% agitando vigorosamente por 5 minutos e
incubar a 65C por 10 minutos.
Agregar 325 l de acetato de potasio 5M fro e incubar a -20C por 40
minutos.
Centrifugar los tubos a 12 000 xg por 30 minutos.

Filtrar la fase acuosa con un trozo de algodn estril insertado en la


boca del tubo y sobre ste recuperar el sobre- nadante en un tubo
nuevo.
Agregar 2/3 del volumen de sobrenadante obtenido con isopropanol fro
(-20C), agitar suavemente e incubar a -20C por 1 hr.
Mezclar suavemente, y centrifugar los tubos a 12 000 xg a 6C por 10
minutos. Eliminar el sobrenadante, dejar secar el botn de ADN y re
suspender en 0.5 ml de agua ultra pura. Incubar a 65C por 10 min.
Centrifugar a 12 000 xg por 10 minutos y transferir el sobrenadante a un
tubo nuevo.
Agregar 30 l de acetato de sodio 3M y 300 l de isopropanol fro (20C) y mezclar suavemente. Incubar a -20C por 30 minutos.
Mezclar suavemente y centrifugar a 6C por 10 minutos, se formar un
botn pequeo traslcido.
Limpiar el botn con etanol fro (-20C) al 80 %, mezclando en vortex
hasta soltar el botn. Si lo considera necesario se puede repetir el
lavado con alcohol al 80%.
Centrifugar a 1000 x g y eliminar el sobrenadante.
Re hidratar el ADN con agua ultra pura, el volumen de agua depende del
tamao del botn y puede ir de 15 l a 150 l.

Reactivos:
Buffer de extraccin CTAB

Tris-HCl 100 mM pH8


NaCl 1.5 M
EDTA 20 mM pH8
CTAB 4%
PVP40 4%
Ac. Ascrbico 0.1%
DIECA 0.1% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta
el momento de usar el buffer)

Buffer de extraccin STE

Tris-HCl 100 mM pH8


EDTA 50 mM pH8
NaCl 100mM
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento
de usar el buffer)
SDS 20%
Acetato de potasio 5 M
Acetato de sodio 3 M

Existen en ocasiones muestras verdaderamente complicadas, en estos casos


se inicia el proceso con una maceracin en alcohol etlico al 96%, lo que rompe
los mucopolisacridos y nos permite seguir con los procedimientos normales.
Cuando es necesario limpiar el ADN porque se encuentra muy saturado de
sales o protenas que impiden la amplificacin de productos de PCR utilizamos
el siguiente mtodo:
Limpieza de las muestras con fenol-cloroformo

Agregar 50 l de fenol y 50 l de cloroformo y agitar en el vrtex para


mezclar perfectamente.
Centrifugar a 10 000 xg por 30 segundos.
Rescatar la fase superior, con cuidado, sin tocar la interfase blanca que
contiene las protenas y ponerla en otro tubo limpio.
Agregar 50 l de fenol y 100 l de cloroformo, agitar en vrtex y
centrifugar en microcentrfuga como se hizo en los pasos anteriores.
Repetir estos pasos hasta que no se vea turbia la fase superior, y
cuando esto suceda ponerle 100 l de cloroformo, mezclar bien en el
vrtex y centrifugar. Rescatar la fase superior a un tubo nuevo.
Precipitar el ADN agregando 10 l de NaCl 2M y 250 l de isopropanol y
reposar la muestra a -20C 4 hr. mximo.
Centrifugar los tubos por 1 hora a 12 000 x g a 6C, eliminar el
sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 80% fro.
Secar el precipitado y re suspender en 20-40 l agua ultra pura.

EXTRACCIN DE ADN EN ANIMALES


Para la extraccin de este material se puede utilizar el protocolo mini-prep
modificado bsicamente con un aumento de proteinasa K y de ARNasa. Se
puede mantener semejante el resto del protocolo. Tambin se ha combinado
partes del protocolo mini-prep con el uso de paquetes comerciales para clulas
animales, como las clulas hepticas de borrego cimarrn, Ovis canadensis, de
las que se obtuvo ADN de buena calidad.
Cuando no obtenemos la calidad requerida para los experimentos a realizar,
recurrimos al uso de los paquetes comerciales mencionados, ya que a pesar de
ser muy caros y no permitir realizar estudios extensivos, permiten obtener ADN
de buena calidad. Respecto a los costos de dichos paquetes, basta decir que
siempre es ms barato no tener que repetir todo el experimento y que es
posible obtener buenas promociones si se consiguen los componentes a granel
y en grandes volmenes, y no en paquete, pues siempre es necesario ajustar
los protocolos.

Mtodos de extraccin del ARN


GIPS

El mtodo utilizado con ms frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en ingls;


cido tiosanato de guanidina, fenol, sarcosyl) desarrollado por Chomczynski y
Sacchi (1987). Cada uno de estos componente juega un papel especfico: el
cido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder
denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule
en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase
acuosa; el sarcosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la
lisis celular, pero no reemplaza la ruptura fsica de las clulas que
generalmente se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un
vrtex o de un homogenizador celular (como Bead-Beater). Sin embargo, es
importante tratar las muestras con ADNasas libres de ARNasas.
BOOM
El mtodo BOOM, desarrollado por Boom et al. (1990) lleva a cabo la
extraccin con el cido tiosanato de guanidina, separando los cidos nucleicos
con base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de slica, en vez de
utilizar fenol. Dado que este mtodo aisla tanto ADN como ARN, resulta
esencial utilizar las nucleasas especficas para ADN que lo eliminen de la
muestra. Algunas compaas han creado paquetes de extraccin basados en
este principio, que utilizan matrices de slica diseadas para favorecer el
enlace de ARN (como RNeasy de QIAGEN). Las molculas grandes de ARN,
incluyendo ARNr y ARNm, son insolubles en soluciones con altas
concentraciones de sal, por lo que durante su precipitacin es comn utilizar
cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas) e incubar las muestras a 0C durante
dos horas antes de centrifugar. Sin embargo, este mtodo no debe ser utilizado
para ARN que ser sometido a transcripcin reversa (vase ms adelante).
Transcripcin Reversa
Esta tcnica permite pasar, en sentido inverso al dogma central de la biologa
molecular, de ARN a ADN. El primer paso es convertir el mARN en ADN
complementario (cADN) a partir de la actividad de la reverso transcriptasa.
Esta enzima existe en la naturaleza como parte del mecanismo de replicacin
en virus, y utiliza un tARN como oligonucletido o primer.
Mtodo utilizado para transcripcin reversa para expresin de genes
involucrados en la fijacin de nitrgeno en muestras acuticas
(modificado por Zani et al., 2000 del kit de Promega de RT-PCR)
Agua ultra pura sin nucleasas (28 l)
Buffer de virus de mieloblastosis de ave 5x (10 l)
dNTP, a concentracin de 10 mM por ncleotido) (1 l)
Primer a 12.5 M (2 l)
Reverso transcriptasa de virus de mieloblastosis de ave (1 l)
Muestra de ARN libre de ADN (1 l)

Ciclo
30 min a 42 C
El cADN formado durante la transcripcin reversa es posteriormente utilizado
en la reaccin de PCR para amplificarlo e identificar el gen que estaba
originalmente expresndose en nuestra muestra.
Mtodo para aislamiento de ARN total de muestras de agua
ambientales (modificado a partir del kit de QIAGEN, Rneasy; Falcn et
al., 2004)
1. Colectar muestras de agua en filtros DURAPORE (Millipore, Corp. San
Jos, CA. EUA).
2. Colocar filtros con las clulas hacia fuera dentro de tubos Eppendorf de
1.5 ml con micro esferas de vidrio y con la solucin RLT que
contienecido tiosanato de guanidina y -mercaptoetanol (que desactiva
molculas complejas y ayuda en la lisis celular).
3. Aplicar vibracin con vrtex o con homogenizador celular (vibracin 1
min, colocar en hielo 1 min, vibracin 1 min).
4. Centrifugar (2 min x 10000 xg) y transferir el supernadante (con ARN) a
tubo colector nuevo. Agregar 350 l de etanol absoluto para limpiar y
ayudar a la precipitacin del ARN. Mezclar bien por pipeteo o vrtex.
5. Transferir mezcla a tubo de centrfuga de 1.5 ml con filtro de slica
(columna); colocar columna en tubo colector. Centrifugar (15 seg x
10000 x g) para atrapar el ARN en la matriz de slica.
6. *En caso de utilizar ADNasa, agregar 350 l de la solucin RW1, 80 l de
la solucin de ADNasa (10 l de la solucin stock -1500 unidades de
ADNasa slida disuelta en 550 l de agua ultra pura libre de nucleasasen solucin RDD). Centrifugar (15 seg x 10000 xg). Repetir la limpieza
con solucin RW1 (350 l) y centrifugar (15 seg x 10000 xg). Si no se
utiliza ADNasa pasar directamente al siguiente paso.
7. Limpiar la muestra con la solucin RW1 (que contiene cido tiosanato
de guanidina). Agregar 700 l y centrifugar 15 seg x 10000 xg.
8. Colocar la columna en tubo colector nuevo y limpiar con 500 l de
solucin RPE (que contiene etanol absoluto); centrifugar 15 seg 10000
xg. Repetir.
9. Centrifugar 1 min x 10000 xg para limpiar la muestra de todo etanol
residual.
10. Colocar columna en tubo colector nuevo y agregar entre 30 y 50 l de
agua ultra pura libre de nucleasas. Esperar un minuto para separar las
hebras de ARN de la membrana de slica y centrifugar (1 min x 10000
xg).
11. Guardar el ARN aislado (total) en nitrgeno lquido o a -80 C.
Extraccin de RNA total de bacteria
DA 1

Previamente calentar a 80C el Buffer de Extraccin en un bao de agua, o


fraccionar en tubos de 1,5ml y calentar en bloque.
1) Transferir 1,5 ml de cultivo de E. coli a un tubo de microcentrfuga
(Eppendorf) y centrifugar a mxima velocidad durante 1 minuto.
2) Retirar el tubo de la microcentrfuga, descartar el sobrenadante
invirtiendo el tubo y eliminar los restos de medio de cultivo tomndolos
con una pipeta P-200.
3) Repetir la operacin un total de 3 veces (de esta manera, se obtiene un
sedimento de bacterias provenientes de 4,5 ml del cultivo).
4) Resuspender el pellet en 400 l de Buffer de Extraccin caliente y 400 l
de cloroformo, mezclar rpidamente por inversin.
5) Incubar 1 minuto a 80C.
6) Mezclar nuevamente el contenido del tubo con Vortex durante 1 minuto.
7) Centrifugar a mxima velocidad por 10 minutos.
8) Retirar el tubo de la microcentrfuga con cuidado para no mezclar las
dos fases formadas: tomar la fase superior acuosa (aprox. 400 l) y
trasvasarla a un tubo estril nuevo de 1,5ml.
9) Adicionar 1 volumen de LiCl 4M (aprox. 400 l).
10)
Incubar ON (OverNight) a 4C.
DA 2
11)
Centrifugar a mxima velocidad por 15 minutos. (De ser posible a
4C). Trasvasar el sobrenadante a un tubo estril nuevo de 1,5ml y
guardar (de aqu recuperaremos el DNA. NO TIRE EL SOBRENADANTE)
12)
Lavar el pellet con etanol 70%. Para ello, agregar 500 l de etanol
70%, luego centrifugar a 14000rpm por 5 minutos, y por ltimo,
descartar el sobrenadante (eliminar los restos de etanol tomndolos con
una pipeta P-200).
13)
Dejar secar aproximadamente 5 minutos.
14)
Resuspender en 50 l de agua bidestilada estril.
1.
2.
3.
4.
5.

Precipitacin de DNA desde el sobrenadante


Precipitar el DNA con 1 volumen de isopropanol.
Centrifugar a mxima velocidad por 1 minuto.
Descartar el sobrenadante, y lavar el pellet con 500 l de etanol 70%.
Centrifugar 5 minutos a 14000rpm.
Dejar secar aproximadamente 5 minutos.
Resuspender en 50 l de agua bidestilada estril.

SOLUCIONES EMPLEADAS
Buffer de Extraccin: Tris-HCl 100mM, pH= 8,0 EDTA 10mM, pH= 8,0 SDS
1 % LiCl 100Mm. Solucin de cloruro de litio: LiCl 4M.