LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA 1: PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS Y

SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

I. EL PROBLEMA

El carácter único de cada α-aminoácido se debe a la estructura del grupo R, en los

péptidos y proteínas estos grupos R a menudo se denominan cadenas laterales y
pueden variar desde un átomo de hidrógeno, hasta grupos complejos como el
guanidino. El propósito de esta práctica es identificar algunos aminoácidos y sus
grupos característicos en las cadenas laterales por reacciones específicas
observables como cambios de color, además de usar la técnica de cromatografía
en capa delgada (CCD) para identificarlos y separarlos por su diferente afinidad
por las fases móvil y estacionaria.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Aminoácidos
Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos por
si solos o polimerizados en péptidos o proteínas. Se conocen por sus nombres
comunes, con frecuencia estos nombres indican alguna característica física del
aminoácido, por ejemplo, el aminoácido más sencillo en estructura se llama
glicina proviene del griego “glyKos” que significa dulce, la asparragina se encontró
por primera vez en los espárragos (“asparagus” en inglés) y la tirosina se encontró
en el queso (“tyros” en griego). Así los aminoácidos se estudian con sus nombres
comunes y se clasifican de acuerdo con el tipo de la cadena lateral R, En la figura
1 se ilustra la estructura básica de los aminoácidos.

Figura 1. Estructura química de un aminoácido

Configuración de los aminoácidos

El carbono α de los aminoácidos naturales es un centro asimétrico, excepto para

la glicina, en consecuencia pueden existir como enantiómeros. La notación D y L
que se usa en los monosacáridos es también válida para los aminoácidos, en la
figura 2 se representa un aminoácido en la proyección de Fischer, con el grupo
carbonilo arriba y el grupo R abajo en el eje vertical, de tal manera, que la
molécula es un D aminoácido si el grupo amino está a la derecha y un L
aminoácido si el grupo amino está a la izquierda.

Figura 2. Configuración L y D de los aminoácidos

Reacciones de identificación de los aminoácidos

Reacción con la ninhidrina

El grupo alfa-amino forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta-azuloso

en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la
prolina e hidroxiprolina, café para la asparragina que tiene un grupo amido en la
cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino presentes
en péptidos y proteínas.

Reacción de Millón

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de

mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de
la tirosina y los péptidos y proteínas que la contienen.

Reacción de Sakaguchi

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la arginina reacciona con

soluciones de alfa-naftol en presencia de bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos.

Reacción de Ehrlich

La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral

de los aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico
y nitrito de sodio por formación de sales de diazonio fuertemente coloreadas
permitiendo así detectar la presencia de tirosina e histidina libres o formando
péptidos y proteínas.
Cromatografía

La Cromatografía se define como un método de separación relativamente rápido,

basado en la distribución selectiva de las sustancias a separar, entre dos fases
inmiscibles, denominadas FASE ESTACIONARIA y FASE MÓVIL. Las dos fases
deben permanecer en contacto pero no deben mezclarse. Con base en lo anterior,
la denominada FASE ESTACIONARIA, normalmente es un material SÓLIDO
granulado , poroso y adsorbente sobre una delgada capa de un soporte de vidrio,
metal u otro material inerte, y la FASE MÓVIL es un LÍQUIDO constituido por un
solvente o mezcla de solventes .Estas características del sistema cromatográfico,
lo hacen altamente eficiente para separar mezclas de sustancias que tienen gran
semejanza en su estructura química y sean afines con las dos fases del sistema,
lo cual no es posible por otros métodos como el de destilación o extracción con
solventes ya estudiados en cursos previos. La separación se fundamenta en
diferentes principios como la absorción, adsorción, reparto y arrastre mecánico, de
tal manera que se establece una competencia entre las dos fases por las
sustancias a separar, la fase móvil "lavará" a estas con diferente eficiencia, de
modo que aquellas que "prefieren disolverse" en la fase móvil se moverán rápido,
mientras las que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria se
moverán menos. Existen diferentes tipos de cromatografía: sobre papel, en capa
delgada (CCD), también llamada TLC (de la sigla en inglés para thin layer
chromatography), en columna, cromatografía de gases y cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC de la sigla en inglés).

III. MATERIALES Y REACTIVOS

1. CROMATOGRAFÍA
TRAER LÁPIZ DE GRAFITO ( no portaminas) Y REGLA EL DÍA DE LA
PRÁCTICA

TRAER MASCARILLA CON FILTRO PARA SOLVENTES,ESTA SE COLOCA

MIENTRAS SE ABRA LA CÁMARA

Materiales 3 Cámaras para cromatografía

1 Placa de celulosa
10 Tubos capilares para aplicación de muestras
1 Bandeja para colorear
1 pipeta graduada de 10 mL
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
2 probetas de 100 mL
1 espátula
El volumen del solvente requerido depende del tamaño y número de las cámaras
de revelado que se dispongan para la práctica.
Solventes ( fase móvil): butanol-acetona-ácido acético-agua (28:28:6:18)
300 mL solución reveladora de ninhidrina en etanol y acidulada (PREPARADA EL
MISMO DÍA)

50 mL Soluciones patrón de los siguientes aminoácidos: valina, histidina,

triptófano, leucina, acido aspártico, lisina, metionina, prolina, serina, ácido
glutámico, arginina, cisteína, asparragina, lisina, fenilalanina, isoleucina y alanina.
(Ver método de preparación)

Cinco bandejas de metal (o de disección) para adicionar la ninhidrina.

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO

Las soluciones están propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por
ejemplo 10 mL de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 8 grupos se requieren
máximo 80 mL de ninhidrina.

Materiales

12 Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 1 mL.
2 Pipetas graduadas de 2 mL.
2 Pipetas graduadas de 5 mL.
2 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Vaso de precipitados de 600 mL.
1 Embudo ordinario
1 Erlenmeyer de 125 mL.
1 Gradilla para tubo de ensayo
1 Pinza metálica para tubo de ensayo
1 Placa refractaria
1 Aro con nuez

Material de uso general

Soportes

Para prevenir la contaminación de los reactivos: las soluciones que no estén en

frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el monitor debe estar pendiente,
que las pipetas no las intercambien durante al práctica.

Reactivos por cada grupo de trabajo:

10 mL de Ácido acético concentrado
Se requiere la preparación de los siguientes reactivos:
10 mL de reactivo de ninhidrina : disolver 100 mg. de nilhidrina en 10 mL. de
etanol a 95% y completar a 100 ml con agua destilada
10 mL de reactivo de millon: disolver 1 g de mercurio en 1 mL. de ácido nítrico
concentrado,calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 mL con agua
5 ml}L de reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. de bromo en 100
mL. de NaOH al 5%

Soluciones

10 ml de Hidróxido de amonio 10%

20 ml de Ácido clorhídrico 2%.
20 ml de Sulfato de cobre 0.5%.
10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco).
10 ml de Ácido sulfanílico 0.5% en HCl.
50 ml de Alfa-naftol 0.15%.
15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los aminoácidos disponibles en
el laboratorio como:
Cisteína o metionina.
Glutamina o asparragina.
Lisina u ornitina.
Tirosina.
Fenilalanina.
Prolina.
Arginina.
Histidina.
Triptófano.
Alanina.

Posibles muestras proteicas a seleccionar por su profesor:

Clara de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 en cloruro
de sodio al 1%.
Yema de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 en cloruro
de sodio al 1%.
Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 mL. de agua caliente y
filtrar a través de gasa doble.
Albúmina sérica bovina: solución al 2% en cloruro de sodio al 1%

IV. PROCEDIMIENTO

1. CROMATOGRAFÍA
Precauciones: use guantes y gafas durante toda la práctica, colóquese la
mascarrilla al abrir la cámara, mantener la cámara de cromatografía tapada y
cuando sea necesario destaparla hágalo rápidamente y tape de nuevo. Una vez
puestas las placas en la cámara NO LA MUEVA DE SU LUGAR.
Para la extracción de aminoácidos a partir de muestras vegetales puede usar las
siguientes técnicas:

Extracción etanólica de aminoácidos presentes en espinaca

Pese en un vidrio de reloj 5 g de material vegetal (espinaca) seco y finamente
picado, transfiéralos completamente a un mortero y realice dos extracciones, cada
una con 15 mL de etanol al 70%. Centrifugue los extractos etanólicos y reúnalos
en un vaso de precipitados de 100 mL, luego al baño maría o directamente en un
pequeño vaso de precipitados evapore el etanol hasta una cuarta parte del
volumen original (esté siempre pendiente para no secar la muestra) y guarde
cuidadosamente.

Para el monitor: Método de preparación de los patrones de aminoácidos

Preparar las soluciones de los siguientes aminoácidos patrones, suspendiendo 1
mg (0,99) de cada aminoácido en 2,5 mL de solución metanol:agua (50:50, v/v) a
pH 1,7. Calcular que la solución de cada aminoácido patrón sea del 39,6 % (m/v).

Coloque 10mL de la fase móvil (mezcla de solventes) en cada una de las cámaras,
tápelas y déjelas en reposo mientras prepara las cromatoplacas.

Preparación de las cromatoplacas

Tome una cromatoplaca e identifique la parte donde está la celulosa (fase

estacionaria), con un lápiz trace una línea a 1,5cm del borde inferior; (Observe
las figuras 3 y 4) esta será la línea de siembra. Según las instrucciones del
profesor aplique con un tubo capilar sobre las líneas de siembra, cinco gotas del
extracto etanólico preparado en el procedimiento anterior (espinaca) y tres gotas
de cada uno de los aminoácidos patrón en el lugar correspondiente; seque la
placa en la estufa. Una vez hayan secado las gotas aplicadas, introduzca lo más
rápidamente posible con cuidado y de manera perpendicular la placa en la cámara
de cromatografía que contiene la fase móvil, tape la cámara. Cerciórese que los
solventes hayan quedado por debajo de la línea de aplicación y deje que
asciendan por la placa hasta el límite superior de la misma. Una vez hayan
ascendido completamente, seque en la estufa a 100ºC, pase la placa por la
bandeja con la solución reveladora de ninhidrina y seque nuevamente a la misma
temperatura por cinco minutos o hasta que desarrolle el color. Encierre las todas
las manchas con lápiz, marque el centro de las mismas. Calcule el Rf como se
indica en la figura 5. Marque las placas y envuélvalas en película plástica para
entregarlas con el informe.

Figura 3. Recorte de las placas cromatográficas

 Figura 4. Pasos para sembrar y correr las placas.

cm

Figura 5. Cálculo del RF

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO
*Realice todos los ensayos en tubos limpios y secos

Ensayo con ninhidrina

Rotule tres tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina y
muestra proteica. A cada uno de los tubos de ensayo agregue 1mL de las
respectivas sustancias que indica el rótulo usando agua destilada para el tubo
marcado como blanco. Adicione a cada tubo 1 mL de reactivo de Ninhidrina,
caliente en baño de agua a ebullición por 10 minutos. Observe los colores
desarrollados y anote los resultados.
Ensayo de Millon

Rotule 4 tubos de ensayo identificados cada uno como: blanco, tirosina,

fenilalanina, y muestra proteica. A cada uno de ellos agregue 2mL de la solución
correspondiente y 1mL de reactivo de Millon. Caliente en baño de agua en
ebullición por 10 minutos. Observe los colores desarrollados y anote los
resultados.

Reacción de Sakaguchi

Rotule 3 tubos de ensayo como: blanco, arginina y muestra proteica.

Agregue a cada uno 5mL. de las soluciones correspondientes, enfríe en baño de
hielo por 10 minutos y luego adicione 1mL de NaOH 40%, deje enfriar 10 minutos
más y luego agregue 5mL de α-naftol y 3 gotas de Reactivo de Sakaguchi, la
aparición de un color rosado o rojo es prueba positiva para el grupo guanidinio.
Observe y anote los resultados.

Reacción de Ehlrich

En 5 tubos de ensayo rotulados como: blanco, triptófano y muestra proteica.

Agregue a cada tubo en el siguiente orden: 1 mL de ácido sulfanilico 0.5% y 1 mL
de nitrito de sodio, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos luego a cada
tubo agregue 1 mL de la solución correspondiente al rótulo. Mezcle y adicione a
cada tubo 0.5 mL de NH4OH 10%.Observe y anote los resultados.

V. BIBLIOGRAFÍA

Bohinski. Robert. 1991. Bioquímica. 5ed. México: Pearson.

Brieger, Gottfried. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de

Laboratorio. España: Harper y Row Publishers INC.

Daniels, Farrintong. 1972. Curso de Fisicoquímica Experimental. Centro Regional

de Ayuda Técnica AID. Españ: McGraw-Hill.

Fessenden, Ralph y Joan S. Fessenden. 2002. Química orgánica. México:

Interamericana.

Mathews, Christopher K y Van Holde, K.E. 2004. Bioquímica. 3 ed. España:

Pearson

Pecsok, Robert & Shields, Donald. 1970. Modern Methods of Chemical analysis.
Estados Unidos: John Wiley & Sons.

Skoog, D.A. y West D.M. 1999.Química analítica. 7 ed. España: Reverte.

 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507
PREINFORME 1: PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE
AMINOÁCIDOS Y SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Nombre: SARA JULIANA DUARTE GONZALEZ Grupo: 1.1

I. CUESTIONARIO DE CONSULTA PARA EL PREINFORME

Responda las siguientes preguntas en forma concreta, ordenada y con citas en

normas APA:

1). Consulte los nombres, símbolos, estructuras desarrolladas y la clasificación de

los aminoácidos proteicos desde los siguientes puntos de vista y realice una tabla
ilustrativa clasificándolos en: esenciales y no esenciales para el hombre, ácidos y
básicos, aromáticos, alifáticos, iminoácido, azufrados, hidroxilados, polares con
carga y sin carga y apolares. (*Se recomienda estudiar los aminoácidos y
clasificaciones porque esto es un factor de éxito para su primer examen parcial).

 ANEXOS (Anexo1. Tabla de clasificación de AA)

2) Dentro de la anterior tabla, para cada aminoácido, encierre la cadena lateral o el

grupo R e identifique los grupos funcionales presentes.

 ANEXOS (Anexo1. Tabla de clasificación de AA)

3) Defina oligopéptido, péptido y proteína.

 Oligopéptido: Un oligopéptido, a menudo llamado péptido (oligo- , "unos

pocos"), consta de dos a diez aminoácidos (está referencia varía segun el
autor) y puede incluir dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos
(Welker & Von Döhren, 2006). Algunas de las principales clases de
oligopéptidos naturales incluyen aeruginosinas,
cianopeptolinas, microcistinas, microviridinas, microgininas,
anabaenopeptinas y ciclamidas (Welker & Von Döhren, 2006).

 Péptido: Un péptido es una molécula que resulta de la unión de dos o más

aminoácidos (AA) mediante enlaces amida (Moran, 2016). En los péptidos y
en las proteínas, estos enlaces amida reciben el nombre de enlaces
 peptídicos y son el resultado de la reacción del grupo carboxilo de un AA
con el grupo amino de otro, con eliminación de una molécula de agua.
Generalmente se considera, según el autor, que los péptidos no son
mayores de 50 o 100 aminoácidos (Moran, 2016). De manera también
general a una cadena polipeptídica se le considera péptido y no proteína si
su peso molecular es menor de 5.000 daltons (Moran, 2016).

 Proteína: Las proteínas son biomoléculas de alto peso molecular

constituidas por una cadena lineal de aminoácidos (Superior a 50 AA)
unidos por enlaces peptídicos que se mantiene plegada de forma que
muestra una estructura tridimensional (Moran, 2016). Las proteínas
desempeñan numerosas funciones en el organismo (Moran, 2016). . De
manera muy genérica, según su función, se clasifican como proteínas
estructurales o proteínas con actividad biológica (Moran, 2016).

4) Realice una tabla de composición de aminoácidos en la espinaca y en su

muestra proteica para reacciones de reconocimiento.

AA ESPINICA AA HARINA DE TRIGO

AMINOÁCIDOS CANTIDAD AMINOÁCIDOS CANTIDAD

Leucina 190 mg Leucina 702 mg
Lisina 160 mg Lisina 191 mg
Metionina 43 mg Metionina 147 mg
Prolina 103 mg Prolina 1221 mg
Serina 95 mg Serina 502 mg
Tirosina 80 mg Tirosina 286 mg
Treonina 110 mg Treonina 277 mg
Triptófano 41 mg Triptófano 104 mg
Valina 140 mg Valina 416 mg
Ácido aspártico 220 mg Ácido aspártico 398 mg
Acido glutámico 315 mg Acido glutámico 3318 mg
Alanina 130 mg Alanina 303 mg
Arginina 130 mg Arginina 347 mg
Cistina 38 mg Cistina 208 mg
Fenilalanina 110 mg Fenilalanina 467 mg
Glicina 123 mg Glicina 398 mg
Hidroxiprolina 0mg Hidroxiprolina 0 mg
Histidina 53 mg Histidina 181 mg
Isoleucina 120 mg Isoleucina 372 mg
Tabla1 Composición de aminoácidos presentes en la espinaca y harina de trigo.
 AA GELATINA AA CASEINA

AMINOÁCIDOS CANTIDAD AMINOÁCIDOS CANTIDAD

Leucina 2356 mg Leucina 7565 mg
Lisina 3268 mg Lisina 6120mg
Metionina 654 mg Metionina 2550 mg
Prolina 11180 mg Prolina 8500 mg
Serina 3010mg Serina 4335 mg
Tirosina 310 mg Tirosina 4590mg
Treonina 1565 mg Treonina 3485mg
Triptófano 5 mg Triptófano 1190 mg
Valina 1832 mg Valina 5100mg
Ácido aspártico 4842 mg Ácido aspártico 5960mg
Acido glutámico 8329 mg Acido glutámico 18105 mg
Alanina 7972 mg Alanina 2465mg
Arginina 6407 mg Arginina 2890 mg
Cistina 0 mg Cistina 0 mg
Fenilalanina 1703mg Fenilalanina 3910mg
Glicina 19780 mg Glicina 1445 mg
Hidroxiprolina 9546mg Hidroxiprolina 0 mg
Histidina 525mg Histidina 2295mg
Isoleucina 1178 mg Isoleucina 3995 mg
Tabla2 Composición de aminoácidos presentes gelatina y la caseína.

AA YEMA DE HUEVO AA CLARA DE HUEVO

AMINOÁCIDOS CANTIDAD AMINOÁCIDOS CANTIDAD

Leucina 1410 mg Leucina 932 mg
Lisina 1124 mg Lisina 639mg
Metionina 406 mg Metionina 406 mg
Prolina 674 mg Prolina 432 mg
Serina 1400 mg Serina 794 mg
Tirosina 674 mg Tirosina 397mg
Treonina 873 mg Treonina 501mg
Triptófano 251 mg Triptófano 173 mg
Valina 1072 mg Valina 846 mg
Ácido aspártico 1522 mg Ácido aspártico 1072mg
Acido glutámico 1902 mg Acido glutámico 1416 mg
Alanina 891 mg Alanina 716 mg
Arginina 1107 mg Arginina 587 mg
Cistina 268 mg Cistina 250 mg
Fenilalanina 683 mg Fenilalanina 656 mg
Glicina 536 mg Glicina 432 mg
Hidroxiprolina 0mg Hidroxiprolina 0 mg
Histidina 380 mg Histidina 242 mg
Isoleucina 943 mg Isoleucina 639 mg
Tabla3 Composición de aminoácidos presentes yema de huevo y clara de huevo.

5) ¿Describa la naturaleza química de la celulosa y tipos de sustancias que

pueden usarla como fase estacionaria en la CCD?

La celulosa es un biopolímero compuesto exclusivamente de moléculas de β-

glucosa (desde cientos hasta varios miles de unidades), pues es
un homopolisacárido (Martínez, 2015). La celulosa es la biomolécula orgánica más
abundante ya que forma la mayor parte de la biomasa terrestre (Martínez, 15).
Igualmente la pueden producir algunos seres vivos que pertenezcan al
reino protista (Martínez, 2015). La celulosa se forma por la unión de moléculas de
β-D-glucosa mediante enlaces β-1,4-O-glucosídico (Martínez, 2015).
Al hidrolizarse totalmente se obtiene glucosa (Martínez, 2015). La celulosa es una
larga cadena polimérica de peso molecular variable, con fórmula empírica
(C6H10O5)n, con un valor mínimo de n= 2000 (Martínez, 2015).
Tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de
hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de
glucosa, haciéndolas impenetrables al agua, lo que hace que sea insoluble en
agua, y originando fibras compactas que constituyen la pared celular de las células
vegetales (Geissman, 1973).
La fase estacionaria consiste en una capa delgada de un adsorbente (como por
ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como
una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico (Geissman, 1973).

6) ¿Cómo se mide el Rf y para qué se utiliza?

 La constante Rf (Factor de retención) es simplemente una manera de

expresar la posición de u n c o m p u e s t o s o b r e u n a p l a c a c o m o u n a
f r a c c i ó n d e c i ma l y mi d e l a r e t e n c i ó n d e u n componente
(Universidad Autónoma de México, 2009). Se define como: Rf = (distancia
recorrida por la zona del soluto desde el origen) / (distancia recorrida
por la fase móvil desde el origen) ((Universidad Autónoma de México,
2009). La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente
desde el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el
denominador es 10 (Universidad Autónoma de México, 2009). Para que los
Rf sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones
(Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de
muestra) (Universidad Autónoma de México, 2009). El máximo valor de Rf
que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un Rf entre 0.55 y 0.7.
(Universidad Autónoma de México, 2009). Para averiguar si dos
compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma
placa y se desarrolla con varios eluyentes (Universidad Autónoma de
México, 2009). Una vez desarrollados se calculan los Rf y si son
 distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del
mismo compuesto. Por el contrario, si los Rf son iguales, los compuestos
pueden ser iguales o no (Universidad Autónoma de México, 2009).

II. RESULTADOS ESPERADOS Y DIAGRAMAS DE FLUJO

1. Separación e identificación de aminoácidos por cromatografía

Extracción etanólica de aminoácidos presentes en espinaca

Resultados esperados: Se espera calcular el factor de retención de los

aminoácidos fueron identificados mediante el método de cromatografía,
esto tomando en comparación la distancia que hay entre el punto de inicio y
el extremo de la mancha demarcada por el contacto de cada uno de los
aminoácidos con la solución reveladora de ninhidrina; esperando observar
coloraciones en tonos amarillos con relación a la presencia de aminoácidos
como prolina, valina y leucina (destacan por sus altas cifras en la
composición de la espinaca) ; tonos azules - violetas generados por aa
como la lisina, que son de carácter básico.
2. Identificación de aminoácidos por reacciones cualitativas

Reacción con la ninhidrina

 Resultados esperados: Observar reacción positiva por parte de los

aminoácidos y proteínas que contienen -NH 2, como la lisina, histidina y
arginina, con excepción de la prolina e hidroxiprolina.Las ninhidrinas forma
complejos violeta azuloso con este grupo, de tal forma que se espera
observar ente cambio de coloración (Mejia, et al, 2010). Las muestras
proteicas también podrían presentar una coloración amarilla gracias a la
presencia de la prolina; en el caso de la alanina, como también posee un
grupo amino primario debe formar complejos coloreados con la ninhidrina,
mientras que la muestra “blanco” no posee un grupo amino primario por lo
cual no se considera parte de los aminoácidos o proteínas y no debe
reaccionar con la ninhidrina (Mejia, et al, 2010).
Reacción de Millón

Resultados esperados: Este reactivo está formado por una mezcla de nitrito y
nitrato mercúrico disuelto en ácido nítrico (Bishnoi, 2015). Esta reacción se lleva a
cabo con residuos fenólicos, es decir proteínas que contienen tirosina para la
formación de nitrotirosina (Bishnoi, 2015). Las proteínas se precipitan por acción
de los ácidos inorgánicos fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se
vuelve gradualmente rojo al calentar por formación de una sal mercúrica (Bishnoi,
2015). Siendo así se espera obtener un resultado positivo de la mayoría de
proteínas, pero en especial la caseína, yema y clara de huevo, debido a que
cuentan con notable proporción de tirosina.

Reacción de Sakaguchi

Resultados esperados: Observar una reacción positiva y rápida por parte de la

Arginina o proteínas que la contienen en mayor proporción (gelatina, caseína,
yema de huevo, etc.). Es positiva para el aminoácido que contiene el grupo
guanidina en la Arginina (Calderón, 2017). El grupo guanidina presente en el
aminoácido reacciona con α-naftol e hipobromito alcalino para dar un complejo de
tonalidad rojiza (Calderón, 2017).
Reacción de Ehrlich

Resultados esperados: La presencia de anillos aromáticos fenólicos o

nitrogenados en la cadena lateral de los aminoácidos se puede identificar
mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales
de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia
de Histidina libres o formando péptidos y proteínas (Escalante, 2014). El resultado
positivo de esta prueba se puede evidenciar con un color rojo o Vino tinto
(Escalante, 2014). Se espera que todas las proteínas en estudio reaccionen de
forma positiva debido a la presencia de histidina, pero de manera especial la
gelatina, caseína, harina de trigo y clara de huevo por su mayor contenido del
aminoácido en cuestión.

III. Fichas técnicas.

 Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio (incluya las filas
necesarias para los solventes de la fase móvil y sustancias que componen
los reactivos para reacciones de reconocimiento).

LOS AMINOÁCIDOS NO SON PELIGROSOS POR LO TANTO NO SE LES

HACE FICHA

Primeros auxilios y Forma de

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad*
medidas de higiene eliminación
Ácido Liquido claro C,O Eliminar el
nítrico
HNO3 amarillento, Evite la exposición al contenido/recipient
producto, tomando las
asfixiable e conforme a la
medidas de protección
adecuadas. Consulte al reglamentación
médico, llevando la ficha de
nacional/internacio
seguridad. contacto con los
ojos: enjuague nal.
inmediatamente los ojos con
agua durante al menos 20
minutos
Contacto con la piel: lávese
inmediatamente después del
contacto con abundante
agua y jabón, durante al
menos 20 minutos.
Inhalación: para quien
proporciona asistencia, evite
la exposición al producto.
Use protección adecuada si
es necesario. Traslade a la
víctima y procúrele aire
fresco.
Ingestión: no induzca el
vómito, debe beber agua.
Nunca suministre nada
oralmente a una persona
inconsciente. llame al médico
Mercurio Hg Liquido C Información general: Absorber con un
Sustancia muy nociva para la
plateado material inerte y
salud, en caso de
inodoro emergencia buscar atención poner el producto
médica.
esparcido en un
Contacto ocular: Lavar los
ojos con abundante agua recipiente
durante al menos 15
apropiado para
minutos, levantando los
párpados superior e inferior. desechos. En caso
 Acudir a un médico. de derrames
Contacto dérmico: Lavar con
grandes: Líquido
abundante agua durante al
menos 15 minutos mientras corrosivo. Líquido
se quita la ropa y el calzado
venenoso. Detener
contaminados
Inhalación: De atención la fuga si no hay
médica inmediatamente. riesgo. Absorber
Remueva de la exposición y con tierra, arena u
mueva al aire fresco otro material no
inmediatamente. Si no está combustible.
respirando, dar respiración
artificial. Ingestión: Nunca
debe administrarse nada por
la boca a una persona
inconsciente. Acudir a un
médico.
Etanol al C2H6O Liquido F Piel: Quitar las ropas Ventilar. Eliminar
95% contaminadas. Aclarar y lavar
incoloro de toda fuente de
con agua y jabón. Ojos
color Enrojecimiento. ignición. Recoger,
Ojos: Enjuagar con agua
característico en la medida de lo
abundante durante varios
minutos (quitar las lentes de posible, el líquido
contacto si puede hacerse
que se derrama y
con facilidad), después
proporcionar asistencia el ya derramado en
médica.
recipientes
Ingestión: No comer, ni
herméticos.
beber, ni fumar durante el
Eliminar el residuo
trabajo. Enjuagar la boca.
con agua
Proporcionar asistencia
abundante.
médica.
Ácido C4H603 Liquido C,O,Xn Inhalación: Respiración Recoger, en la
acético artificial si estuviera indicada.
incoloro de medida de lo
Proporcionar asistencia
color acre médica. Piel: Quitar las ropas posible, el líquido
contaminadas. Aclarar con
que se derrama y
agua abundante o ducharse.
Proporcionar asistencia el ya derramado en
médica.
recipientes
Ojos: Enjuagar con agua
abundante durante varios herméticos.
minutos (quitar las lentes de
 contacto si puede hacerse Absorber el líquido
con facilidad), después
residual en arena o
proporcionar asistencia
médica. absorbente inerte y
Ingestión: No comer, ni
trasladarlo a un
beber, ni fumar durante el
lugar seguro.
trabajo. Enjuagar la boca.
NO provocar el vómito.
Alfa-naftol C10H8O Solido T Información general: En caso Recoger y
de emergencia buscar
cristalino depositar en
asistencia médica.
blanco o gris Contacto ocular: Lavarse contenedores con
rápidamente con abundante
cierre hermético,
agua en un lavadero de ojos,
como mínimo entre 10 y 15 cerrados, limpios,
minutos
secos y marcados.
Contacto dérmico: Lavar con
abundante agua, por lo Lavar con
menos por 10 minutos.
abundante agua el
Utilizar de preferencia una
ducha de emergencia. piso
Inhalación: Trasladar a la
persona donde exista aire
fresco. En caso de paro
respiratorio, emplear método
de reanimación
cardiopulmonar
Ingestión: Lavar la boca con
bastante agua. Dar a beber
agua. Inducir al vómito, solo
si la persona está
consciente.

Ácido RC6H5SO3 Liquido Xn, C Ojos: Irritante, edema en la Almacénelo en un

sulfanilico conjuntiva
H viscoso, área fresca, seca,
Piel: corrosivo. Necrosis
color pardo visible Mutagenicidad: En bien ventilada y
pruebas de toxicología
con olor alejada de la luz
genética no se prueba efecto
picante muta génico con el producto. solar directa.
Sensibilización cutánea y
Mantenga los
respiratoria: No sensibilizante
en piel. recipientes bien
Irritación:
cerrados cuando
EXTREMADAMENTE
no los esté
IRRITANTE para piel y ojos.
utilizando y cuando
estén vacíos.
 Protéjalos contra
daños.
Nitrito de NaNO2 Solido T,C Contacto ocular: Lavar con Los restos de
sodio 0.5% abundante agua, mínimo
higroscópico, producto químico
durante 15 minutos. Levante
blanco o y separe los párpados para deberían
asegurar la remoción del
amarillo disponerse de
químico
Contacto dérmico: Retirar la acuerdo a
ropa y calzado
tecnología
contaminados. Lavar la zona
afectada con abundante aprobada y a la
agua y jabón, mínimo
legislación local.
durante 15 minutos. Si la
irritación persiste repetir el
lavado y aplicar emoliente.
Inhalación: Tras inhalación
de productos de
descomposición, respirar aire
fresco, buscar ayuda médica.
Ingestión: Lavar la boca con
agua. Si está consciente,
suministrar abundante agua.
Sulfato de CuSO4∙5H2 Sólido, T Contacto ocular: Lavar con Barrer la sustancia
cobre 0.5% abundante agua, mínimo
O cristales derramada e
durante 15 minutos. Levantar
azules y separe los párpados para introducirla en un
asegurar la remoción del
recipiente; si fuera
químico.  Contacto dérmico:
Después del contacto con la necesario,
piel, lavar inmediatamente
humedecer el
con agua abundante. Se
puede usar agua fría. Cubra polvo para evitar
la piel irritada con un
su dispersión
emoliente.
 Inhalación: Trasladar a la
víctima al aire fresco. Afloje
el cuello y el cinturón de la
víctima. Si la persona no
respira, dar respiración
artificial.
 Ingestión: Afloje el cuello y
el cinturón de la víctima.
Nunca le dé nada por la boca
a una persona inconsciente.
No inducir al vómito. Llamar
al médico de inmediato.
Ácido HCl Gas C,T Inhalación: Ventilación, Evacuar la zona de
clorhídrico extracción localizada o
comprimido, peligro. Consultar
2% protección respiratoria. Aire
incoloro de limpio, reposo. Posición de a un experto.
semiincorporado.
olor acre Ventilar. Eliminar el
Respiración artificial si
estuviera indicada. gas con agua
Aclarar con agua abundante,
pulverizada.
después quitar Piel: la ropa
contaminada y aclarar de Separado de
nuevo. Proporcionar
sustancias
asistencia médica.
Ojos: Enjuagar con agua combustibles y
abundante durante varios reductoras,
minutos (quitar las lentes de oxidantes fuertes,
contacto si puede hacerse bases fuertes,
con facilidad), metales. Mantener
en lugar fresco,
seco y bien
ventilado.
Hidróxido NH4OH Liquido C Sustancia muy peligrosa por Agentes extintores:
de amonio inhalación, en caso de
incoloro con Niebla de agua.
emergencia buscar atención
olor a médica inmediatamente. Polvo Químico o
Ocular: Lavar con abundante
picante Bióxido de
agua, mínimo durante 15
minutos. Carbono
Dérmico: Retirar la ropa y
calzado contaminados. Lavar
la zona afectada con
abundante agua y jabón,
mínimo durante 15 minutos.
Inhalación: Trasladar al aire
fresco. Si no respira
administrar respiración
artificial.
Ingestión: Lavar la boca con
agua. Si está consciente,
suministrar abundante agua.
No inducir el vómito.
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente
(O), inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+),
corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).

PAUTAS PARA LA ELABORACIÓN DEL INFORME

I. TABLA DE DATOS

1. CROMATOGRAFÏA

Completa la siguiente tabla de datos para la cromatografía

Cromatografía del extracto etanólico

Compuesto Distancia al Distancia al Rf Nombre

No * centro de la límite del del
mancha solvente compuesto
probable

*Calcule los valores de Rf de todas las señales obtenidas de los patrones y la

muestra.

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO
Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento, evite limitarse a escribir
tubo 1, tubo 2, etc., describa en forma organizada las observaciones en cada tubo
y si la prueba puede considerarse positiva o negativa. Luego de las tablas incluya
fotos claras de tubos debidamente marcados (muestra, reactivo y nombre de quién
realizó la prueba)

II. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A continuación encuentra pautas para discutir, explicar y no solo describir sus

resultados, recuerde que no es simplemente un cuestionario a responder, redacte
con base en citas de autores confiables, haciendo llamados a fotos y tablas.

1. CROMATOGRAFIA

Determine la cantidad de aminoácidos diferentes que encontró por cromatografía

en la muestra de espinaca.
Compare los valores de Rf de las señales obtenidas en la espinaca con los
correspondientes patrones e identifique hasta donde sean posible los aminoácidos
presentes.
Consulte en la literatura, los valores de Rf para sistemas cromatográficos similares
(fase estacionaria y fase móvil similar) y analice qué tan válida es la comparación
con los valores por usted obtenidos.
Realice las estructuras de todos los aminoácidos usados en la práctica, analice
las estructuras y establezca cuál fue el orden de migración, es decir ¿cuáles
aminoácidos migraron más, los polares con carga, polares sin carga, o los
apolares y por qué cree usted que fue así de acuerdo con las condiciones de la
cromatografía en cuanto a polaridad de la fase estacionaria y móvil?

2. PARA CADA PRUEBA DE RECONOCIMENTO DE AMINOÁCIDOS

Describa el fundamento químico de la prueba realizada.

Encierre y nombre el o los grupos funcionales que reaccionaron o los
responsables de la coloración positiva del ensayo con aminoácidos o proteína, use
imágenes de fórmulas estructurales desarrolladas.
Realice la ecuación de la reacción química correspondiente con él o los
aminoácidos particulares que pudo identificar, no con R.

Relacione con toda la información del pre informe: consulta y resultado esperado.
*Recuerde explicar tanto las pruebas positivas o negativas.

II. BIBLIOGRAFÍA.

Aminoácidos de las espinacas. Disponible en:

https://alimentos.org.es/aminoacidos-espinacas.

Aminoácidos de la harina de trigo. Disponible en:

https://alimentos.org.es/aminoacidos-harina-trigo

Bishnoi, A. (2015. Pruebas de proteínas. Instituto Srrotario de Tecnologia Quimica

SHROFF.

Calderón, S. (2017). Reacciones de reconocimiento de proteínas. Facultad de

Medicina. Departamento de Bioquímica. Kingdom of Saudi Arabia.

Escalante, K. (2014). Pruebas generales para detección de aminoácidos y

proteínas. Biorgánica, Ingeniería Agropecuaria, Facultad de ciencias agrarias,
Universidad del Cauca.

Ferritina y Albumina: Aminoácidos. 7 diciembre 2011. Disponible en :

https://es.slideshare.net/Maisabelita/ferritina-y-albumina
Ficha técnica: Ácido clorhídrico. Disponible en:
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Fic
heros/101a200/nspn0163.pdf

Ficha técnica: Ácido nítrico. Disponible en:

http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FISQ/Fic
heros/201a300/nspn0209.pdf

Ficha técnica: Acido sulfanilico. Disponible en:

http://www.brinsaquimica.com.co/wp-content/uploads/2018/07/2.Ficha-de-
Seguridad-A%CC%81cido-Sulfo%CC%81nico-Lineal.pdf

Ficha técnica: Etanol. Disponible en: http://www.ebd.csic.es/lie/PDF/ETANOL.pdf

Ficha técnica: Hidróxido de amonio. Disponible en:

http://www.quimica.una.ac.cr/index.php/documentos-electronicos/category/13-
hojas-de-seguridad?download=253:hidroxido-de-amonio&start=160

Ficha técnica: Mercurio. Disponible

en:https://www.ciafa.org.ar/files/t8nqSMsoIxouFBASKVgK1UinhYtE1aaeCY7UkvV
2.pdf

Ficha técnica: Nitrito de Sodio. Disponible en:

http://www.quimica.una.ac.cr/index.php/documentos-electronicos/category/13-
hojas-de-seguridad?download=290:nitrito-de-sodio&start=200

Ficha técnica: Sulfato de cobre. Disponible en:

http://www.quimica.una.ac.cr/index.php/documentos-electronicos/category/13-
hojas-de-seguridad?download=331:sulfato-de-cobre-ii-pentahidratado&start=240

Geissman, T. (1973). Principios de química orgánica. ISBN 9788429171808.

Martínez, J. (2015).Bioenergía: Fuentes de conversión y

sostenibilidad. . ISBN 9789585888005.

Mejía. P. C., Giraldo. G., Loanga. C.N. (2010) Laboratorio bioquímica una visión
practica: Reconocimiento e aminoácidos. Primera edición. Armenia, Quindío:
editorial Elizcon.

Morán, A. (2016). Aminoácidos, péptidos y proteínas. Madrid, España: DCiencia.

Técnicas cromatografías: introducción a la cromatografía. Facultad de química,

Química analítica e instrumental II. Universidad Autónoma de México.
(2009).México. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
Welker, M., & Von Döhren, H. (2006). «Cyanobacterial peptides – Nature's own
combinatorial biosynthesis». FEMS Microbiology.