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AminoÁcidos y ProteÍnas ( Lab Oratorio

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UNIVERSIDAD DE SAN MARTÍN DE PORRES FACULTAD DE MEDICINA HUMANA CURSO DE QUÍMICA BIOLÓGICA

PRÁCTICA Nº 12 AMINOÀCIDOS Y PROTEÌNAS

Alumnos: Diego Gómez Wong Mónica Alexandra López Murga Jorge Luis Gálvez Díaz Grupo: 07L Hora: 10:00 – 12:00

LIMA-PERÚ 2008

I. INTRODUCCIÓN: Los aminoácidos son compuestos de bajo peso molecular y de alta polaridad, que poseen simultáneamente carácter ácido y básico. En la naturaleza, los aminoácidos se encuentran libres o formando parte de las proteínas (poliaminácidos), de las cuales podemos obtenerlos por hidrólisis. Un aminoácido, químicamente, es una molécula que contiene un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres. Por lo general, son insolubles en solventes orgánicos (como éter o benceno), pero solubles en agua, álcalis diluidos, o ácidos diluidos.

AMINO

ÁCIDO CARBOXILO

Los α-aminoácidos naturales de origen animal o vegetal, o los que se obtienen por hidrólisis enzimático o ácida de proteínas o péptidos, son óptimamente activas (excepto la Glicina), y por su configuración pertenecen a la serie L. Las rotaciones específicas son constantes valiosas para su identificación. Se pueden clasificar por su naturaleza de sus “Restos aminoácido” (-R):  Aminoácidos No Polares Neutros: Llamados también aminoácidos apolares. Presentan radicales de hidrocarbonatos apolares o hidrocarbonatos modificados, excepto la glicina. Son radicales hidrófobos. Encontramos:  Glicina: H-CH (NH2)-COOH  Alanina: CH3-CH (NH2)-COOH  Leucina: CH3 (CH3)-CH2-CH (NH2)-COOH  Valina: CH3-CH (CH3) – CH (NH2)-COOH  Isoleucina: CH3-CH2-CH (CH3)-CH (NH2)-COOH  Prolina: - CH2-CH2-CH2 - Ligado a un grupo amino o un carbono α  Fenilalanina: C6H5-CH2-CH (NH2)-COOH  Triptofano: R aromático-CH (NH2)-COOH  Metionina: CH3-S-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH  Aminoácidos Polares Neutros: Presentan radicales que tienen a formar puentes de Hidrógeno.  Serina: OH-CH2-CH (NH2)-COOH  Treonina: OH-CH (CH3)-CH (NH2)-COOH

   

Cisteina: SH-CH2-CH (NH2)-COOH Tirosina: OH-C6H4-CH2-CH (NH2)-COOH Asparagina: NH2-CO-CH2-CH (NH2)-COOH Glutamina: NH2-CO-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH

 Aminoácidos Básicos: Presentan radicales con grupo carboxílico. Son hidrófilos.  Ácido Aspártico: HCOO-CH2-CH (NH2)-COOH  Ácido Glutámico: HCOO-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH  Aminoácidos Ácidos: Presentan radicales con un grupo amino. Son hidrófilos.  Arginina: HN=C(NH2)-NH-CH2-CH2-CH2- CH (NH2)- COOH  Lisina: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH (NH2)- COOH  Histidina: H-(C3H2N2)-CH2- CH (NH2)- COOH

Para la IONIZACIÓN DE AMINOÁCIDOS: Los aminoácidos forman una sal interna debido a la transferencia de un protón del grupo carboxilo ácido al grupo amino básico. La estructura carboxilato de amonio resultante se conoce como el zwitterion. CH3CH(NH2)CO2H CH3CH(NH3)+CO2-

Otro punto importante es conocer qué es el PUNTO ISOELÉCTRICO (pI):

Es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa. pI: pK1 + pK2 2 La Ninhidrina nos permite reconocer o detectar los α-aminoácidos. Cuando existe presencia de α-aminoácidos en una solución, al añadir unas gotas de solución alcohólica Ninhidrina (o hidrato de tricetohidrindeno) al 0,25% se producirá una coloración violeta. También podremos reconocer los aminoácidos en solución alcohólica o acuosa, utilizando tricloruro férrico, con la cual el color de la solución sería rojizo. Para los restos aminoácidos de los diferentes aminoácidos se pueden detectar mediante diferentes pruebas. Por ejemplo:  Para los Aminoácidos Aromáticos, podemos utilizar ácido nítrico (HNO3), dándonos derivados nitrados (reacción Xantoproteica).  Para aminoácidos azufrados en medio alcalino, usamos sales del plomo, las cuales formaran un precipitado negro (PbS).  En aminoácidos con resto indólico, utilizaremos el pdimetilaminobenzaldehido o el ácido glicólico produciendo productos coloreados.  Y para aminoácidos fenólicos, nitrato mercúrico-mercurioso del reactivo de Millón para dar coloración rojo salmón… Ahora culminando con la parte de aminoácidos, es tiempo de empezar con las proteínas, del griego poton que significa primero. Las proteínas son macromoléculas de masa molecular elevada, formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico. Por ello pueden ser llamados polímeros de aminoácidos. Compuestas por Carbono (C), Hidrógeno (H), Oxígeno (O) y Nitrógeno (N) sino éste último el elemento característico. También contienen azufre, fósforo, hierro, etc. Son de vital importancia para el funcionamiento de las células y de su estructura. También son muy abundantes. Cumplen también función de catálisis enzimático, funciones contráctiles posibilitando así el movimiento; protección inmunitaria, etc. Podría señalarse que, “no existe vida sin proteínas”. Las proteínas son moléculas anfóteras, es decir, según el número relativo de grupos carboxilo y aminos libres, en solución darán reacción ácido o alcalina. En otras palabras, algunas moléculas se cargarán positivamente y otras negativamente.

El pH al cual una proteína determinada es eléctricamente neutra se conoce como punto isoeléctrico. Todas las proteínas son menos solubles cuando se encuentran en su punto isoeléctrico. Ahora conociendo sobre la COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS: Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70°C. o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria.

En enlace peptídico presente en una proteína puede ser reconocido por la reacción de Biuret da una coloración violeta característica.

III.- PARTE EXPERIMENTAL: A. REACTIVOS        Ninhidrina. Tirosina. Triptofano. cisteína. Ácido Glutámico. Albúmina. Cabello (queratina). NaOH. HNO3. H2SO4(concentrado) Acetato de plomo. N,N-dimetil Amino benzaldehído.  Cloroformo.  Sulfato de cobre     

B. MATERIALES       Tubos de ensayo y gradilla. Hornilla eléctrica. Baño maría. Bagueta. Pipeta. Mechero

C. PROCEDIMIENTOS RECONOCIMIENTO DE LOS ALFA AMINOÁCIDOS
− − −

Colocamos en 5 tubos de ensalllo 1ml de Triptofano, albúmina, cistina, tirosina, ácido glutámico, uno para cada tubo. Adicionamos 3 gotas de ninhidrina con mucho cuidado puesto que es cancerígeno. Por último llevamos los tubos al bañomaría para luego retirar y obserbar lo que ocurre. RECONOCIMIENTO DE RESTO AROMÁTICO

− − − −

Llenamos 2 tubos de ensayo con Albúmina y tirosina cada uno. Añadimos 0,5 ml de HNO3. Llevamos al baño maría un promedio de 7 minutos; dejamos enfriar. Añadir con mucho cuidado 0,5 ml de NAOH y anotar los resultados.

RECONOCIMIENTO DEL RESTO AZUFRADO
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En 2 tubos de ensayo colocar cisterna y albúmina. Luego añadimos 0,5ml de NAOH al 30%, añadimos también 2 gotas de acetato de plomo al 10%. Los llevamos al bañomaría por siete minutos, dejamos enfriar y observar.

RECONOCIMIENTO DE RESTOS INDÓLICOS
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En dos tubos de ensayo colocar 2 ml de albúmina y Cisteína. Acontinuación añadimos 0,5 ml de solución de ácido glicólico, mezclar bien. Luego añadir cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de H2SO4 (concentrado). Colocamos los tubos de ensayo en la gradilla y dejar reposar por 5min, sin agitar. Observar y anotar resultados.

PRUEBA DE MILLÓN En 2 tubos de ensayo colocar muestras de albúmina y tirosina. Luego añadimos 0,5ml de reactivo de Millón, y lo llevamos al baño maría por 5 minutos. Retirar, enfriar y observar. REACCIÓN DE BIURET Cogemos un tubo de ensayo y poner 3cc de albúmina de huevo. Añadimos 2cc de solución de hidróxido de sódico al 20%.

-

A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico, diluido al 1 %. Observamos si aparece la coloración violeta grisácea característica.

COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS En un tubo de ensayo colocamos una pequeña cantidad de clara de huevo. Luego añadimos 5 gotas de ácido acético y calentamos el tubo a la llama de mechero.

NATURALEZA ANFÓTERA DE LAS PROTEÍNAS Preparar cuatro tubos de prueba con lo siguiente:  1° tubo: Una gota de HCl 0,1M + 1gota de anaranjado de metilo+ 2ml de Agua.  2° tubo: Una gota de HCl 0,1M + 1gota de anaranjado de metilo+ 2ml de Agua.  3° tubo: Una gota de NaOH 0,1M + 1gota de fennolftaleína+ 2ml de Agua.  4° tubo: Una gota de NaOH 0,1M + 1gota de fennolftaleína+ 2ml de Agua. Añadimos al 1° y al 3° tubo 3ml de albúmina, agitar y observar. Al 2° y 4° tubo 3ml de Agua, agitar y observar. Explicar los resultados observados.

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IV.- RESULTADOS:

RECONOCIMIENTO DE ALFA AMINOÁCIDOS

Triptofano Ninhidrina + baño maría Coloración + Violeta

Albúmina + violeta

Cistina + violeta

Tirosina + violeta

Ác. Glutamínico + violeta

RECONOCIMIENTO DE RESTO AROMÁTICO

Albúmina HNO3 (Coloración) + NaOH (Coloración) + (Amarillo) + (Naranja)

Tirosina + (Amarillo) + (Naranja)

Cabello + H2O + (Amarillo) + (Naranja)

RESTO AZUFRADO Cistina NaOH + Acetato de Pb Precipitado Negro Albúmina Precipitado Negro

RESTOS INDÓLICOS Triptofano Rvo. N,N - dimetilaminobenzaldehido + (morado) Proteina + (morado)

PRUEBA DE MILLÓN Tirosina + (rojo) Albúmina + (rojo)

Rvo. Millón / Baño maría

REACCIÓN DE BIURET

Albúmina Clara de Huevo + NaOH (solución) + CuSO4 + (morado)

COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS Clara de Huevo+ Ác. Acético+Albúmina Calor Ácido Cloroformo Base NaOH Acetato de Pb CuSO4 + + + + + + +

NATURALEZA ANFÓTERA DE LAS PROTEÍNAS Albúmina Tubo 1 HCl + anaranjado de metilo Tubo 2 HCl + anaranjado de metilo Tubo 3 NaOH + Fenolftaleína Tubo 4 NaOH + Fenolftaleína Amarillo (ácido) Amarillo (ácido) Descoloración (base) Descoloración (base)

SAPONIFICACIÓN Grasa derretida NaOH + H2O positivo

TINCIÓN DE SUDÁN III Aceite Tinción de Sudán III Azul de metileno Tiñe No tiñe Colorante Lipofílico Lipofóbico

SOLUBILIDAD Aceite Inmisible Misible (apolar) Inmisible,

Agua Cloroformo Etanol

V.- DISCUSIONES:  Algunos ácidos grasos poliinsaturados (linoleico, linolénico y araquidónico) no pueden ser sintetizados por los animales superiores (incluido el hombre), y como su función biológica es fundamental, deben ser suministrados en la dieta.

VI.- CONCLUSIONES:  Durante el experimento en el que utilizamos el reactivo de Nihidrina, pudimos observar que todos los contenidos de los tubos de ensayo cambiaban su color a uno violeta debido a que éstos son αaminoácidos.  Gracias a la presencia de la fenolftaleína y anaranjado de metilo pudimos confirmar la capacidad anfótera que tienen los aminoácidos, ya que con la fenolftaleína se comportó como base y con el anaranjado de metilo como ácido.  Confirmamos que el reactivo de millón detecta restos fenólicos en aminoácidos, el reactivo de Ácido Glicólico detecta a los restos indólicos y el acetato de plomo, a los restos azufrados.  En el experimento de solubilidad de los lípidos, se podrá observar que el aceite se ha disuelto en el éter y no en el agua ya que éste subirá debido a su menor densidad.

VII.- CUESTIONARIO: 1. Escriba el nombre y la estructura de 6 de los aminoácidos esenciales. Estructura linealradical R-CH(NH2)-CO2H

Aminoácidos

Estructura completa

Valina

Leucina

Isoleucina

Fenilalanina

PhCH2

Treonina

Lisina

Cisterna

Metionina

2. Escriba la reacción entre la fenilalanina y la ninhidrina

3. ¿Qué aminoácidos se puede encontrar en la albúmina de huevo? La ovoalbúmina contiene aminoácidos esenciales como : Leucina, isoleucina, lisina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. 4. ¿Cómo se investiga la estructura primaria de una proteína? Si la estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína, nos indicará qué aminoácidos componen su cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. 5. ¿Qué aplicación tiene el concepto del punto isoeléctrico? Determinar el pH de un aminoácido que se presenta casi exclusivamente en forma de Zwitterion, es decir con las formas iónicas positivas y negativas en iguales proporciones. En el punto isoélectrico las proteínas precipitan, se separan de sus mezclas y se pueden purificar. 6. ¿Qué fuerzas intermoleculares son responsables de las estructuras 2°, 3° Y 4° de las proteínas? Para la estructura 2° el responsable son los puentes de hidrógeno; para la estructura 3°, el enlace salino, puentes de hidrógeno, interacción hidrofóbica, enlace disulfuro, interacciones de Van Der Waals. Y para la estructura 4° son las fuerzas electrostáticas débiles no covalentes. 7. ¿Cuáles son las aplicaciones de la electroforesis? La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la

malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. 8. Describa algunas de las propiedades biológicas de las proteínas.  Especificidad: Cada proteína podrá reaccionar químicamente con una sustancia específica, debido a la configuración externa de la molécula. Una alteración del plegamiento produce un cambio en la forma que afecta su superficie. Para que una reacción tenga lugar el acoplamiento entre la sustancia reaccionante y la proteína debe ser perfecto, para que los átomos de ambas moléculas estén lo suficientemente cerca que les permita reaccionar. Las proteínas solubles juegan un papel muy importante en las reacciones bioquímicas a nivel celular, por lo que cualquier cambio en su conformación puede alterar los procesos metabólicos.  Desnaturalización: Es la destrucción de la estructura terciaria de una proteína, en la que pasa de una forma plegada o enroscada a una forma opuesta, por rompimiento de enlaces de hidrógeno. En la proteína desnaturalizada ocurren cambios estructurales que afectan sus propiedades biológicas, como la hormonal, enzimáticas y la actividad inmunológica. Es generalmente un proceso irreversible, fuertemente endotérmico, que produce un desorden del sistema. Los principales agentes desnaturalizantes son: a) Altas temperaturas, provocan la coagulación. Ej. Huevo cocido. b) Cambios bruscos de pH.  Solubilidad: Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus radicales polares o hidrófilos se sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con el agua, constituyendo una capa de solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del tamaño, de la forma, de la disposición de los radicales y del pH. 9. ¿Qué aminoácidos rendirá la hidrólisis ácida del siguiente péptido?

Rendiría la Valina, la Fenilalanina y la Leucina.

BIBLIOGRAFÌA DIRECCIONES ELECTRÒNICAS http://www.ehu.es/biomoleculas/4q/pdf/lipidos.pdf http://www.soapyworld.com/tablas_sap.htm http://www.ehu.es/biomoleculas/AA/aa2.htm http://www.arrakis.es/~lluengo/proteinas.html http://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido http://www.profes.net/rep_documentos/Monograf/E2-3.pdf http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/Indices.pdf http://www.monografias.com/trabajos10/compo/compo.shtml http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm#los%2020 http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EX PERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/proteinas/ http://www.elergonomista.com/alimentos/prot.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidos_esenciales http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/aminoacids/estructurprot.ht ml http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-2221975.PDF

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