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LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA GENERAL

PLAN DE ESTUDIO: __INGENIERIA BIOTECNOLÓGICA____

ASIGNATURA: __PRODUCCIÓN DE BIOMOLECULAS___
DOCENTE: _NELSON VEGA__ AÑO:_2020_

PRACTICA # 3: IDENTIFICACIÓN DE AMINOACIDOS

INTRODUCCIÓN
El carácter único de cada α aminoácido se debe a la estructura del grupo R. en los polipéptidos
los grupos R de los aminoácidos a menudo se denominan cadenas laterales y pueden variar
desde un átomo de hidrógeno, hasta estructuras complejas como el grupo guanidina, el
propósito de esta práctica es identificar algunos aminoácidos que presentan grupos
característicos en las cadenas laterales utilizando ensayos cualitativos y específicos para cada
función.

OBJETIVO:
 Identificar los aminoácidos presentes en diferentes muestras mediante pruebas cualitativas
teniendo en cuenta su coloración

GENERALIDADES:
Por la estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las proteínas
pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados. Estas
reacciones son la base para la determinación cuantitativa y cualitativa de las proteínas. Por
presentarse variaciones en la composición de los aminoácidos de las diferentes proteínas, se
manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reacción, íntimamente
relacionado con la naturaleza de la proteína analizada.

Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos, puesto que
constituyen los bloques fundamentales con que se forman las proteínas. Entre las principales
reacciones de identificación de los aminoácidos se encuentran las siguientes:

Prueba de coagulación: Es una prueba para identificar: albúminas, globulinas, glutelinas y

prolaminas. La positividad se manifiesta por la formación de un coágulo. No se conoce
exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre cierta deshidratación de la
molécula proteica.

El proceso de desnaturalización, con la consiguiente coagulación de las proteínas, se puede

producir por muchos medios, pero sea cual sea el carácter del agente utilizado, este produce
cambios físicos que causan una alteración de las propiedades de las proteínas. La
desnaturalización de la albúmina del huevo conduce al despliegue y desenrollamiento de las
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cadenas de péptidos, lo cual depende seguramente de la ruptura de los puentes intercadenas

que los mantiene plegados en la proteína natural.

Reacción con la ninhidrina: El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos

coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo
amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene
un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino
libres presentes en péptidos y proteínas.

Reacción del biuret: Esta reacción es general para todos los compuestos con dos uniones
amidas o peptídicas, unidas directamente o a través de un átomo de carbono intermedio. Los
dipéptidos y los aminoácidos no dan esta reacción, a excepción de la histidina, serina y
treonina.

La reacción del Biuret se debe a la coordinación de iones cúprica con los pares de electrones
sin compartir del nitrógeno del péptido y del oxígeno del agua, con la formación de un complejo
coloreado. Si se trata a continuación el Biuret alcalino, con solución de sulfato cúprico muy
diluida, se obtiene color violeta. Esta reacción es propia de las sustancias que contienen dos
grupos –CONH2, unidos directamente o por medio de un átomo de carbono o de nitrógeno. Los
dipéptidos no dan reacción no dan reacción positiva, ya que para que se dé, hacen falta dos o
más enlaces peptídicos.

Reacción de Millón: El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales
de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la
tirosina y las proteínas que la contienen.

Reacción Xantoprotéica: Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan

con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo
cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano.

Reacción de Sakaguchi: El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina

reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos. Es una prueba para identificar arginina y se usa para
identificar proteínas ya que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido .

Reacción de Ehrlich : La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena

lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y
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nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así
detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.

Reacción con acetato de Plomo alcalino: Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteina
y Cistina se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro
o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino

EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales
60 Tubos de ensayo
15 Pipetas graduadas de 5 ml.
Gradilla para tubo de ensayo
Pinza metálica para tubo de ensayo
Pipetadores tipo cremallera
Micropipeta de 100 – 1000 μl
Puntas para micropipeta
Pipetas pasteur
Probeta
Vasos precipitados
Erlenmeyers de 250 ml
Erlenmeyers de 100 ml

Equipos:
Balanza analítica
Plancha de calentamiento y agitación
Baño serológico

Reactivos y Soluciones
Ácido sulfúrico concentrado
Ácido nítrico concentrado
Ácido nítrico 20%
Ácido acético concentrado
Hidróxido de sodio 40%.
Hidróxido de sodio 10 %.
Ácido clorhídrico 2%.
Ácido clorhídrico concentrado
Acetato de plomo 10%.
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Sulfato de cobre 0.5%.

Nitrito de sodio 0.5% (fresco).
Ácido sulfanílico 0.5% en HCl.
Alfa-naftol 0.15%.
Hipoclorito de sodio 1%
Cloruro de sodio solido
Cloruro de sodio 20%
Carbonato de sodio 10%
Acetona
Cloruro férrico 1%
Nitrato de plata 1%
Acetato de plomo 1%

Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los siguientes aminoácidos

Cisteína ó metionina.
Glicina.
Tirosina.
Arginina.
Triptófano.

Albúmina de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 con agua destilada
Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 ml. de agua caliente y filtrar a través
de gasa doble

Soluciones problema sugeridas: colágeno, albúmina, gelatina, y las que el profesor considere

Se requiere la preparación de los siguientes reactivos:

Reactivo de ninhidrina: disolver 100 mg. de Ninhidrina en 10 ml de etanol a 95% y completar a
100 ml con agua destilada
Reactivo de millon: disolver 1 g de mercurio en 1 ml de ácido nítrico concentrado, calentar
suavemente, dejar enfriar y completar a 60 ml con agua
Reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. De bromo en 100 ml. De NaOH al 5%
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PROCEDIMIENTO

1. COAGULACIÓN DE PROTEINAS
VOL.
AGENTE COAGULANTE PROCEDIMIENTO
MUESTRA (ml)
Calentar poco a poco en la llama del
Calor directo del mechero mechero hasta que se produzca la
coagulación. Repetir en todas las muestras
 Albumina de Adicionar 3 ml de acetona y observar.
Acetona
huevo  3 ml Repetir en todas las muestras
 Proteína de trigo Adicionar 1 ml de Ácido clorhídrico
Ácido clorhídrico
 3 ml concentrado y observar. Repetir en todas las
concentrado
 Muestra muestras
problema  3 ml Adicionar 2 ml de Cloruro Sódico y observar.
Cloruro sódico al 20%
Repetir en todas las muestras
Adicionar 2 ml de ácido nítrico y observar.
Ácido nítrico al 20%
Repetir en todas las muestras
Se observan los tubos y se anotan los resultados obtenidos, así como aquellos tubos en los
que se haya producido coagulación

2. REACCIONES CUALITATIVAS
PRUEBA MUESTRA Vol. (ml) PROCEDIMIENTO
1. Adicionar la muestra en el tubo
 Agua destilada (blanco) 1 ml correspondiente.
 Alanina 1 ml 2. Adicionar 1 ml del reactivo de
1. Prueba de
 Albumina de huevo 1 ml Ninhidrina
Ninhidrina
 Proteína de trigo 1 ml 3. Calentar en baño de agua hirviendo
 Muestra problema 1 ml por 10 min.
4. Dejar enfriar y observar
1. Adicionar la muestra en el tubo
correspondiente.
2. Adicionar 2 ml de NaOH al 10%
 Agua destilada (blanco) 2 ml
3. Mezclar e ir añadiendo gota a gota el
2. Prueba de  Albumina de huevo 2 ml
sulfato cúprico al 0.5 % (CuSO4),
Biuret  Proteína de trigo 2 ml
agitando después de cada adición,
 Muestra problema 2 ml
hasta la aparición de un color violeta,
azul o amarillo. El color violeta indica la
reacción positiva.
 Agua destilada (blanco) 2 ml
3. Prueba de 1. Adicionar la muestra en el tubo
 Tirosina 2 ml
Millon correspondiente.
 Albumina de huevo 2 ml
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 Proteína de trigo 2 ml 2. Adicionar 0,5 ml (500 µl) del reactivo

 Muestra problema 2 ml de Millon
3. Calentar en baño de agua hirviendo por
10 min.
4. Dejar enfriar y observar la coloración
1. Adicionar la muestra en el tubo
correspondiente.
2. Adicionar 1 ml de Ácido Nítrico
concentrado.
 Agua destilada (blanco) 2 ml
3. Calentar en baño de agua hirviendo por
 Tirosina 2 ml
4. Prueba 3 min. La aparición de una coloración
 Albumina de huevo 2 ml
Xantoproteica amarilla es una prueba positiva para
 Proteína de trigo 2 ml
aminoácidos aromáticos.
 Muestra problema 2 ml
4. Dejar enfriar el tubo.
5. Adicionar 1 ml de Hidróxido de sodio al
40% y el cambio de color a anaranjado
confirma la prueba.
1. Adicionar la muestra en el tubo
 Agua destilada (blanco) 2 ml correspondiente.
 Arginina 2 ml 2. Adicionar 5 gotas de NaOH al 40%
5. Prueba de
 Albumina de huevo 2 ml 3. Agregar 5 gotas de alfa-naftol.
Sakaguchi
 Proteína de trigo 2 ml 4. Adicionar 3 gotas de Hipoclorito de
 Muestra problema 2 ml sodio al 1%
5. Observar la coloración
1. Adicionar 1ml de Nitrito de Sodio al
0,5%
 Agua destilada (blanco) 1 ml 2. Adicionar 1 ml de Ácido Sulfanílico al
 Triptófano 1 ml 0,5% en HCl al 2%
6. Prueba de
 Albumina de huevo 1 ml 3. Dejar reposar por 5 min.
Ehrlich.
 Proteína de trigo 1 ml 4. Adicionar 1 ml de la muestra
 Muestra problema 1 ml correspondiente
5. Agregar 5 gotas de carbonato de sodio
al 10%
1. Adicionar la muestra en el tubo
 Agua destilada (blanco) 2 ml
7. Prueba de correspondiente.
 Cisteína. 2 ml
acetato de 2. Adicionar 2 ml de NaOH al 10%
 Albumina de huevo 2 ml
plomo 3. Agregar 0,5 ml de Acetato de plomo al
 Proteína de trigo 2 ml
alcalino 10%
 Muestra problema 2 ml
4. Baño de agua hirviendo durante 5 min.
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3. PRECIPITACION
a. Sales de metales pesados
Las sales de algunos metales pesados como el FeCl3 AgNO3, Pb(CH3COO)2 causan precipitación
de las proteínas
 Agregue 2ml de la solución de proteínas (albumina de huevo, proteína de trigo y muestra
problema).
 Agregue respectivamente 3 gotas de las siguientes soluciones, FeCl3 al 1%, AgNO3 al 1% y
Pb(CH3COO)2 1%
 Observe los resultados
b. Sales neutras
Las sales neutras provocan la precipitación de las proteínas
 Tome 3 ml de solución de proteína (albumina de huevo, proteína de trigo y muestra
problema) en el tubo de ensayo correspondiente
 Sature las soluciones con cloruro de sodio sólido, agregando la sal en pequeñas porciones
hasta que por agitación no se disuelva más, note cualquier cambio en la solución.

RESULTADOS
Complete el siguiente cuadro con la información obtenida de las pruebas realizadas con las
muestras dadas, reportando positividad o negatividad de cada reacción
MUESTRA
Coag. por calor
Coag. con Acetona
Coag. con HCl concentrado
Coag. con NaCl al 20%
Coag. con Ácido nítrico al 20%
Prueba de Ninhidrina
Prueba de Biuret
Prueba de Millon
Prueba Xantoproteica
Prueba Sakaguchi
Prueba Ehrlich
Prueba de Acetato de plomo
alcalino
Precipitación por FeCl3
Precipitación por AgNO3
Precipitación por Pb(CH3COO)2
Precipitación por NaCl
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CONSULTAR:
 Dibuje las estructuras de cada una de las reacciones hechas en la practica
 Cuáles son las aplicaciones prácticas de las pruebas.
 Realice el ejemplo de un enlace peptídico diferentes a los vistos en clase

BIBLIOGRAFIA

Universidad de Bogota, Jorge Tadeo Lozano. Guía N°9: ensayo para el reconocimiento de
aminoácidos. Recuperado de
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/organica/guia_9_aminoacid
os.pdf

Anónimo. Experimento #2: Metodos Cuantitativos para la identificación de aminoácidos y

proteínas. Recuperado de https://es.scribd.com/doc/58845422/metodos-cualitativos-para-la-
identificacion-de-proteinas

Bohinski. 1991 Bioquímica. 5ed., Pearson. México.

Fesenden and fesenden. 2002. Química orgánica. Interamericana. México

Mathews Van Holde . 2004 Bioquímica. 3 Ed Pearson. España

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ANEXO