Práctica 1 Metodo de Sanger

¿Con qué reacciona el DNFB?

Con los grupos alfa-amino libres, grupos imidazol, fenólicos y épsilon-amino.
Pasos generales de la determinación del aminoácido N-terminal.
 Dinitrofenilación del aminoácido N-terminal de la proteína.
 Eliminación del DNFB que no reaccionó.
 Hidrólisis de la DNP-proteína
 Identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel.

¿Cual es el objetivo de la práctica?

Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina
mediante el método Sanger.
Reactivos
 Hemoglobina Humana: componente estudiado
 Bicarbonato de sodio: da las condiciones alcalinas para llevar acabo la reacción de la
dinitrofelinación para que reaccione el DNBF con el grupo amino libre de la proteína y con
esto se favorece
 DNFB: sirve para empezar la reacción de dinitrofenilación (reactivo orgánico)
 Ácido clorhídrico 3 N: sirve para que el grupo amino vuelva a protonarse y se pueda detener
la reacción del DNFB
 Éter: ayuda a extraer el DNFB que no reacciono, aunque no le extrae al 100%
 FeSO4: sirve para saturar el éter ya que este es muy volátil y no se proyecte
 Ácido clorhídrico 6N: Es para dar un medio acido a la reacción y poder romper el enlace
peptídico de la hemoglobina, con esto se centrifuga para hidrolizar la proteína
 Ácido cítrico y citrato de sodio: es para la cámara cromatografía para saturarla y actúa como
recorrimiento en el papel
 Acetona y alcohol: sirve para la fase eteria, cuando se calienta y queda un polvo se ocupa
esta mezcla de solvente orgánico para diluirlos y poder manipularlos en la fase liquida
 Amoniaco: sirve para acentuar los resultados de la cromatografía y se observen mejor
 Hemoglobina, es una cadena tetraédrica y desarrolla 2 manchas, 1 del DNFB que no
reacciono y la otra a la valina
 Ácido cítrico 0.1 M y Citrato de sodio 0.1 M: Se usa como solvente afín a los compuestos a
separar en el cromatograma
 Derivados dinitrofenilados de FeSO4 al 0.6%: Reactivo a analizar en el cromatograma.
 Val, Asp y Phe: Aminoácidos de referencia para la práctica.
 Amoniaco concentrado: Para acentuar los tonos amarillos de la cromatografía
 ¿Por qué no se utiliza NaOH en vez de NaHCO3?
Porque el hidróxido de sodio es una base fuerte que genera una solución con un pH mayor
al requerido además de ser muy reactiva y se disocia fácilmente, rompiendo los enlaces
disulfuro y puentes de hidrógeno coagulando la proteína mientras que el bicarbonato es una
sustancia que genera una ligera álcalis y no desnaturaliza a la proteína por la disociación
parcial que presenta.
¿Qué es un Rf?
Es la relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen
de la placa o bien conocidos como frente del soluto y frente del eluyente, tiene un valor
constante para cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas
(adsorbente, disolvente, tamaño de la cubeta, temperatura, etc.)
¿Hay otro método para el análisis del residuo N-terminal?
La degradación de Edman.

Práctica 2 Reacción de aminoácidos 1

Insulina en el método de Sanger serían tres manchas, una del DNFB que no reacciono y los
dos aminos libres de cada una de la cadena una de la glicina de la cadena A y la otra
fenilalanina de la cadena B
En la Insulina
 Prueba de Plomo para cisteína, característica para grupos sulfhidrilo, positivo a un
precipitado obscuro

 Prueba de la ninhidrina, positiva precipitado de color azul, es positiva en la insulina

por los aminos libres

 Reacción de Hepkins-Cole, positivo a triptófano, anillo color rojo, da positiva en la

insulina por la presencia del triptofano

 Reacción de Millon, positivo da un precipitado color rojo, en la insulina da positivo

porque tiene tirosina

 Reacción Xantoproteica, positivo a aminos aromáticos activados anillos color amarillo,

en la insulina da positivo por la presencia de tirosina y triptófano

 Reacción del Biuret, prueba positiva a más de tres aminoácidos unidos, color violeta o
morado, da positiva en la insulina porque tiene más de tres aminoácidos unidos
Práctica 3 Punto isoeléctrico
Los metales pesados forman compuestos de coordinación dada a la reducción de radicales
en los aminoácidos, formando centros metálicos.

Salting in: Menor concentración de sales mayor precipitación de la proteína

Las proteínas aumentan su solubilidad al incrementar la concentración de sales.
Salting out: Mayor concentración de sal causa menor precipitación de la proteína
Disminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la concentración de sales y entonces
precipitan.
¿Qué es la constante dieléctrica?
Capacidad de un solvente para mantener dos cargas separadas. Medio continuo es una
propiedad macroscópica de un medio dieléctrico relacionado con la permitividad dieléctrica
del medio.

Fórmula del punto isoeléctrico (PI):

PI=pKa1 + pKa2 / 2

Ecuación de Charlotte:
pH= 7 + ½ (pKa acético) + ½ (log 0.25)
¿Qué solventes son buenos para precipitar a las proteínas?
Los solventes miscibles con el agua, como la acetona y el etanol, suelen ser buenos
precipitantes de proteínas porque sus bajas constantes dieléctricas reducen el poder de
solvatación de sus soluciones acuosas hacia los iones disueltos, como las proteínas.
¿Por qué se utilizó (NH4)2SO4 y el reactivo de Biuret en la prueba de separación para la
proteína?
Se utilizó sulfato de amonio para provocar la precipitación de la proteína, dado que se trata
de una sal altamente soluble. Lo que ocurre es que se crea una competencia entre las
moléculas de agua que están solubilizando a la proteína y las que solubilizan a los iones de
la sal, por lo que los iones acaparan las moléculas de agua provocando que la proteína se
coagule por las interacciones hidrofóbicas que hay entre los residuos de aminoácidos de la
misma (es decir, ya no hay agua suficiente para la proteína).
Para comprobar sí había proteínas en cada fase se utilizó el reactivo de Biuret, que permite
visualizar su presencia o no con un cambio de coloración de azul (sin proteínas) a morado
(con proteínas).
Práctica 4 Curvas de titulación
¿Cuántas zonas de amortiguamiento tiene el Ácido Aspártico?
3 curvas de titulación
¿Cómo se calcula el pka de una zona amortiguadora?
El promedio en la zona amortiguadora será igual al pka
¿Cómo se define un zwitterion?
Es el punto donde el número total de carga total es igual a 0

¿Cuántas zonas amortiguadoras presenta la curva de titulación de la glicina?

2 zonas amortiguadoras
¿Cantas zonas amortiguadoras tendrá entonces la curva de titulación de la arginina?
3 zonas amortiguadoras
¿Cuáles serán los valores de pH promedio de las zonas amortiguadoras de la curva de
titulación del ácido aspártico?

¿Cuál es la carga de la alanina en el jugo gástrico del estómago?

¿Cuál es la carga de la leucina en plasma sanguíneo?

¿Cuál es el PI de la serina?

¿A qué valor de pH la lisina podrá desplazarse en un campo eléctrico hacia el ánodo (las
partículas negativas se van al ánodo)?

Solo los ácidos débiles pueden ser soluciones amortiguadoras o reguladas, una solución de
la leucina tienen propiedad de regular el pH

La serina en su forma zwitterionica se estaría titulando el grupo acido con NaOH y el grupo
básico con HCl
Usted hace reaccionar al grupo COO de la serina antes de realizar la titulación. Que curva
de titulación se ve modificada en comparación con la de serina sin reaccionar: la de la
titulación con