LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA 1: PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS Y

SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Ovoal bumina :
https://cool.culturalheritage.org/albumen/library/c20/messier1991a.html
I. EL PROBLEMA

El carácter único de cada α-aminoácido se debe a la estructura del grupo R, en los

péptidos y proteínas estos grupos R a menudo se denominan cadenas laterales y
pueden variar desde un átomo de hidrógeno, hasta grupos complejos como el
guanidino. El propósito de esta práctica es identificar algunos aminoácidos y sus
grupos característicos en las cadenas laterales por reacciones específicas
observables como cambios de color, además de usar la técnica de cromatografía
en capa delgada (CCD) para identificarlos y separarlos por su diferente afinidad
por las fases móvil y estacionaria.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Aminoácidos

Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos por
si solos o polimerizados en péptidos o proteínas. Se conocen por sus nombres
comunes, con frecuencia estos nombres indican alguna característica física del
aminoácido, por ejemplo, el más sencillo en estructura se llama glicina proviene
del griego “glyKos” que significa dulce, la asparragina se encontró por primera vez
en los espárragos (“asparagus” en inglés) y la tirosina se encontró en el queso
(“tyros” en griego). Así los aminoácidos se estudian con sus nombres comunes y
se clasifican de acuerdo con el tipo de la cadena lateral R, En la figura 1 se ilustra
la estructura básica de los aminoácidos.

Figura 1. Estructura química de un aminoácido

Configuración de los aminoácidos

El carbono α de los aminoácidos naturales es un centro asimétrico, excepto para

la glicina, en consecuencia pueden existir como enantiómeros. La notación D y L
que se usa en los monosacáridos es también válida para los aminoácidos, en la
figura 2 se representa un aminoácido en la proyección de Fischer, con el grupo
carbonilo arriba y el grupo R abajo en el eje vertical, de tal manera, que la
molécula es un D aminoácido si el grupo amino está a la derecha y un L
aminoácido si el grupo amino está a la izquierda.

Figura 2. Configuración L y D de los aminoácidos

Reacciones de identificación de los aminoácidos

Reacción con la ninhidrina

El grupo alfa-amino forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta-azuloso

en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la
prolina e hidroxiprolina, café para la asparragina que tiene un grupo amido en la
cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino presentes
en péptidos y proteínas.

Reacción de Millón

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de

mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de
la tirosina y los péptidos y proteínas que la contienen.

Reacción de Sakaguchi

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la arginina reacciona con

soluciones de alfa-naftol en presencia de bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos.

Reacción de Pauly
El ácido sulfanílico diazotizado se une a las aminas, fenoles e imidazoles para dar
compuestos azo fuertemente coloreados. Los compuestos de diazonio se forman
únicamente en el frío, así que las soluciones deben enfriarse en hielo antes de la
diazotización
Cromatografía

La Cromatografía se define como un método de separación relativamente rápido,

basado en la distribución selectiva de las sustancias a separar, entre dos fases
inmiscibles, denominadas FASE ESTACIONARIA y FASE MÓVIL. Las dos fases
deben permanecer en contacto pero no se deben mezclar. Con base en lo
anterior, la denominada FASE ESTACIONARIA, normalmente es un material
SÓLIDO granulado , poroso y adsorbente sobre una delgada capa de un soporte
de vidrio, metal u otro material inerte, y la FASE MÓVIL es un LÍQUIDO
constituido por un solvente o mezcla de solventes .Estas características del
sistema cromatográfico, lo hacen altamente eficiente para separar mezclas de
sustancias que tienen gran semejanza en su estructura química y sean afines con
las dos fases del sistema, lo cual no es posible por otros métodos como el de
destilación o extracción con solventes ya estudiados en cursos previos. La
separación se fundamenta en diferentes principios como la absorción, adsorción,
reparto y arrastre mecánico, de tal manera que se establece una competencia
entre las dos fases por las sustancias a separar, la fase móvil "lavará" a estas con
diferente eficiencia, de modo que aquellas que "prefieren disolverse" en la fase
móvil se moverán rápido, mientras las que sean preferencialmente solubles en la
fase estacionaria se moverán menos. Existen diferentes tipos de cromatografía:
sobre papel, en capa delgada (CCD), también llamada TLC (de la sigla en inglés
para thin layer chromatography), en columna, cromatografía de gases y
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC de la sigla en inglés).

III. MATERIALES Y REACTIVOS

1. CROMATOGRAFÍA

TRAER LÁPIZ DE GRAFITO (no portaminas) Y REGLA EL DÍA DE LA

PRÁCTICA

TRAER MASCARILLA CON FILTRO PARA SOLVENTES, ÉSTA SE COLOCA

MIENTRAS SE ABRA LA CÁMARA

Materiales 3 Cámaras para cromatografía

1 Placa de celulosa
10 Tubos capilares para aplicación de muestras
1 Bandeja para colorear
1 pipeta graduada de 10 mL
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 vasos de precipitados de 100 mL
2 probetas de 100 mL
1 espátula
El volumen del solvente requerido depende del tamaño y número de las cámaras
de revelado que se dispongan para la práctica.
Solventes ( fase móvil): butanol-acetona-ácido acético-agua (28:28:6:18)
300 mL solución reveladora de ninhidrina en etanol y acidulada (PREPARADA EL
MISMO DÍA)

50 mL Soluciones patrón de los siguientes aminoácidos: valina, histidina,

triptófano, leucina, acido aspártico, lisina, metionina, prolina, serina, ácido
glutámico, arginina, cisteína, asparragina, lisina, fenilalanina, isoleucina y alanina.
(Ver método de preparación)

Cinco bandejas de metal (o de disección) para adicionar la ninhidrina.

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO

Las soluciones están propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por
ejemplo 10 mL de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 8 grupos se
requieren máximo 80 mL de ninhidrina.

Materiales

12 Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 1 mL.
2 Pipetas graduadas de 2 mL.
2 Pipetas graduadas de 5 mL.
2 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Vaso de precipitados de 600 mL.
1 Embudo ordinario
1 Erlenmeyer de 125 mL.
1 Gradilla para tubo de ensayo
1 Pinza metálica para tubo de ensayo
1 Placa refractaria
1 Aro con nuez

Material de uso general

Soportes

Para prevenir la contaminación de los reactivos: las soluciones que no estén en

frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el monitor debe estar pendiente,
que las pipetas no las intercambien durante al práctica.

Reactivos por cada grupo de trabajo:

10 mL de Ácido acético concentrado
Se requiere la preparación de los siguientes reactivos:
10 mL de reactivo de ninhidrina : disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 mL. de
etanol a 95% y completar a 100 ml con agua destilada
10 mL de reactivo de millon: disolver 1 g de mercurio en 1 mL. de ácido nítrico
concentrado, calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 mL con agua.
5 mL de reactivo de sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. de bromo en 100
mL. de NaOH al 5%

Soluciones

20 mL Carbonato de sodio (10g/L)

10 mL de Hidróxido de amonio 10%
20 mL de Ácido clorhídrico 2%.
20 mL de Sulfato de cobre 0.5%.
10 mL de Nitrito de sodio 0.5% (fresco).
10 mL de Ácido sulfanílico 0.5% en HCl.
50 mL de α-naftol 0.15%.
15 mL de Soluciones al 0.1% en agua acidulada de los aminoácidos disponibles
en el laboratorio como:
Cisteína o metionina.
Glutamina o asparragina.
Lisina u ornitina.
Tirosina.
Fenilalanina.
Prolina.
Arginina.
Histidina.
Triptófano.
Alanina.

Muestras proteicas a seleccionar por su profesor:

Ovolabúmina: en cloruro de sodio al 1%.
Yema de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 en cloruro
de sodio al 1%.POR CONFRIMAR
Caseína: (5.7 g/L) disuelta de NaOH muy diluido. POR CONFIRMAR
Albúmina sérica bovina ( BSA) : solución al 2% en cloruro de sodio al 1%

IV. PROCEDIMIENTO

1. CROMATOGRAFÍA

Precauciones: use guantes y gafas durante toda la práctica, colóquese la

mascarrilla al abrir la cámara, mantener la cámara de cromatografía tapada y
cuando sea necesario destaparla hágalo rápidamente y tape de nuevo. Una vez
puestas las placas en la cámara NO LA MUEVA DE SU LUGAR.
Para la extracción de aminoácidos a partir de muestras vegetales puede usar las
siguientes técnicas:

Extracción etanólica de aminoácidos presentes en espinaca

Pese en un vidrio de reloj 5 g de material vegetal (espinaca) seco y finamente
picado, transfiéralos completamente a un mortero y realice dos extracciones, cada
una con 15 mL de etanol al 70%. Centrifugue los extractos etanólicos y reúnalos
en un vaso de precipitados de 100 mL, luego al baño maría o directamente en un
pequeño vaso de precipitados evapore el etanol hasta una cuarta parte del
volumen original (esté siempre pendiente para no secar la muestra) y guarde
cuidadosamente.

Para el monitor: Método de preparación de los patrones de aminoácidos

Preparar las soluciones de los siguientes aminoácidos patrones, suspendiendo 1
mg (0,99) de cada aminoácido en 2,5 mL de solución metanol:agua (50:50, v/v) a
pH 1,7. Calcular que la solución de cada aminoácido patrón sea del 39,6 % (m/v).

Coloque 10mL de la fase móvil (mezcla de solventes) en cada una de las

cámaras, tápelas y déjelas en reposo mientras prepara las cromatoplacas.

Preparación de las cromatoplacas

Tome una cromatoplaca e identifique la parte donde está la celulosa (fase

estacionaria), con un lápiz trace una línea a 1,5cm del borde inferior; (Observe
las figuras 3 y 4) esta será la línea de siembra. Según las instrucciones del
profesor aplique con un tubo capilar sobre las líneas de siembra, cinco gotas del
extracto etanólico preparado en el procedimiento anterior (espinaca) y tres gotas
de cada uno de los aminoácidos patrón en el lugar correspondiente; seque la
placa en la estufa. Una vez hayan secado las gotas aplicadas, introduzca lo más
rápidamente posible con cuidado y de manera perpendicular la placa en la cámara
de cromatografía que contiene la fase móvil, tape la cámara. Cerciórese que los
solventes hayan quedado por debajo de la línea de aplicación y deje que
asciendan por la placa hasta el límite superior de la misma. Una vez hayan
ascendido completamente, seque en la estufa a 100ºC, pase la placa por la
bandeja con la solución reveladora de ninhidrina y seque nuevamente a la misma
temperatura por cinco minutos o hasta que desarrolle el color. Encierre las todas
las manchas con lápiz, marque el centro de las mismas. Calcule el Rf como se
indica en la figura 5. Marque las placas y envuélvalas en película plástica para
entregarlas con el informe.

Figura 3. Recorte de las placas cromatográficas

 Figura 4. Pasos para sembrar y correr las placas.

cm

Figura 5. Cálculo del RF

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO
*Realice todos los ensayos en tubos limpios y secos

Ensayo con ninhidrina

Rotule cinco tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, prolina,
asparragina , BSA (muestra proteica) . A cada uno de los tubos de ensayo
agregue 1mL de las respectivas sustancias que indica el rótulo usando agua
destilada para el tubo marcado como blanco. Adicione a cada tubo 1 mL de
reactivo de Ninhidrina, caliente en baño de agua a ebullición por 10 minutos.
Observe los colores desarrollados y anote los resultados.
Ensayo de Millón

Rotule tres tubos de ensayo identificados cada uno como: blanco, tirosina, y BSA
(muestra proteica). A cada uno de ellos agregue 2mL de la solución
correspondiente y 1mL de reactivo de Millon. Caliente en baño de agua en
ebullición por 10 minutos. Observe los colores desarrollados y anote los
resultados.

Reacción de Sakaguchi

Rotule 3 tubos de ensayo como: blanco, arginina y (ovoalbúmina)muestra proteica.

Agregue a cada uno 5mL. de las soluciones correspondientes, enfríe en baño de
hielo por 10 minutos y luego adicione 1mL de NaOH 40%, deje enfriar 10 minutos
más y luego agregue 5mL de α-naftol y 3 gotas de Reactivo de Sakaguchi, la
aparición de un color rosado o rojo es prueba positiva para el grupo guanidinio.
Observe y anote los resultados.

Reacción de Pauly
Marque 6 tubos de ensayo como: blanco, tirosina, histidina, triptófano, y muestra
proteíca(yema de huevo o caseína, MUESTRA POR CONFIRMAR)
A cada uno de los seis tubos 1 mL de ácido sulfanílico. Después al blanco tubo
uno 2 mL de agua, 2 mL de tirosina al dos, 2 mL de histidina al tres; 2 mL de
triptófano; al cuatro 2 mL de glicina y 2 mL de muestra proteíca al 6. Enfríelos en
hielo, agrégueles 1 mL de la solución de NaNO 2 y déjelos enfriando durante 3
minutos. Al cabo de ese tiempo alcalinice las soluciones de cada tubo añadiendo 2
mL de Na2CO3 y registre los colores que se van formando.

V. BIBLIOGRAFÍA

Bohinski. Robert. 1991. Bioquímica. 5ed. México: Pearson.

Brieger, Gottfried. 1970. Química Orgánica Moderna. Curso Práctico de

Laboratorio. España: Harper y Row Publishers INC.

Daniels, Farrintong. 1972. Curso de Fisicoquímica Experimental. Centro Regional

de Ayuda Técnica AID. España: McGraw-Hill.

Fessenden, Ralph y  Joan S. Fessenden. 2002. Química orgánica. México:

Interamericana.

Mathews, Christopher K y Van Holde, K.E. 2004. Bioquímica. 3 ed. España:

Pearson

Pecsok, Robert y Shields, Donald. 1970. Modern Methods of Chemical analysis.

Estados Unidos: John Wiley y Sons.
Skoog, D.A. y West D.M. 1999.Química analítica. 7 ed. España: Reverte.

CUESTIONARIO DE PREINFORME E INFORME

Responda las siguientes preguntas en forma concreta, ordenada y con citas
en normas APA:

* Se recomienda realizar los primeros 3 numerales a manera de preinforme, antes

de recibir el video correspondiente a la práctica.

1) Consulte estructuras desarrolladas y la clasificación de los aminoácidos

proteicos desde los siguientes puntos de vista y realice una tabla ilustrativa
clasificándolos en: polares con carga, polares sin carga y apolares

2) Para cada uno de los tres grupos de solubilidad arriba mencionados, de

acuerdo con su polaridad, postule en general si sus valores de RF serán bajos
( se moverán poco) o altos ( se moverán mucho), de acuerdo con la fase móvil y
estacionaria y su polaridad, usadas en la cromatografía en capa delgada en esta
guía.

3) Realice una tabla de composición de aminoácidos en: la espinaca, la

ovoalbúmina y la BSA( albúmina sérica bovina).

4) TABLAS DE DATOS CROMATOGRAFÍA ( * tablas de reacciones de

cromatografía y reacciones/ valor 0,3)

Completa la siguiente tabla de datos para la cromatografia

Cromatografía del extracto etanólico

Compuesto # * Distancia al Distancia al Rf Nombre

centro de la límite del del
mancha solvente compuesto
probable
*Calcule los valores de Rf de todas las señales obtenidas de los patrones y la
muestra.

5) Determine la cantidad de aminoácidos diferentes que encontró por

cromatografía en la muestra de espinaca ( valor 0,3).
6) Compare los valores de Rf de las señales obtenidas en la espinaca con los
correspondientes patrones e identifique hasta donde es posible los aminoácidos
presentes y si estos coinciden con las tablas de composición consultadas en
numeral 3). ( valor 1,0).
7) De acuerdo con las estructuras consultadas en numeral 1) y la clasificación
establecida, establezca cuál fue el orden de migración, es decir ¿cuáles
aminoácidos migraron más, los polares con carga, polares sin carga, o los
apolares y EXPLIQUE por qué cree usted que fue así de acuerdo con las
condiciones de la cromatografía en cuanto a polaridad de la fase estacionaria y
móvil?. ( valor 2,0).
8) Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento, evite limitarse a
escribir tubo 1, tubo 2,etc ( incluya contenido de tubo), describa en forma
organizada las observaciones en cada tubo y si la prueba puede considerarse
positiva o negativa.

PARA CADA PRUEBA DE RECONOCIMENTO DE AMINOÁCIDOS CON UN

SUBTÍTULO ( valor por prueba 0,28, total: 1,12):

9) Describa el fundamento químico de la prueba realizada brevemente

(composición de reactivo, tipo de reación y nombre el o los grupos funcionales que
reaccionan o son los responsables de la coloración positiva en los aminoácidos
que reconoce).
10) EXPLIQUE(NO DESCRIBA) el color de la prueba positiva o negativa
observada en su muestra asignada y compare compare con la tabla de
composición consultada en numeral 3) para su muestra asignada.

11) Enuncie la bibliografía utilizada como apoyo para la elaboración del

cuestionario( valor 0,3)..