PRACTICA Nº 7

EXTRACCIÓN DE ADN

 OBJETIVOS:

 Efectuar una extracción de ADN según métodos expuestos.

 Conocer las propiedades y características propias del ADN.
 Diferencias los distintos métodos de medición ADN.

 INTRODUCCIÓN:

PROPIEDADES DE LOS NUCLEÓTIDOS

Los nucleótidos son ácidos bastante fuertes, en los que la ionización primaria del fosfato se
produce con un valor de pKa de aproximadamente. Tanto la ionización secundaria del
fosfato como la protonación o desprotonación de algunos de los grupos de las bases de los
nucleótidos pueden observarse a valores de pH bastante próximos a la neutralidad. Las
bases son capaces también de experimentar una conversión entre formas tautómeras. Las
formas tautómeras, o tautómeros, son isómeros estructurales que se diferencian en la
disposición de sus átomos de hidrógeno y los dobles enlaces.

Como consecuencia de los sistemas de dobles enlaces conjugados de los anillos de purina
y pirimidina, las bases y todos sus derivados (nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos)
absorben intensamente la luz en la región del espectro del ultravioleta cercano. Esta
absorción depende en parte del pH, debido a las reacciones de ionización de las bases. En
la Figura se presentan espectros representativos de los ribonucleótidos a pH neutro. Esta
intensa absorbancia se utiliza para la determinación cuantitativa de los ácidos nucleicos, ya
que permite medir las concentraciones de ácido nucleico con una detección de
microgramos/mL mediante espectrofotometría. La luz ultravioleta puede tener también
efectos dañinos químicos sobre el DNA que dan lugar, por ejemplo, a cáncer de piel.

 MATERIALES:
  Cloroformo.
 Alcohol isoamilico
 Lauril sulfato de sodio (dodecil sulfato de sodio)
 EDTA
 Baño maría
 NaCl
 Probetas de 50 y 100 ml
 Alcohol isopropilico
 Baguetas
 Alcohol etílico
 Solución salina citrato (NaCl 0.15 mol/l amortiguado con citrato de sodio 0.015 mol/l
pH 7).

 PROCEDIMIENTO:

AISLAMIENTO DEL DNA

 Homogeneizar 3 g de timo de ternera en una licuadora en 30 ml de una solución
salina NaCl 0.15 M más EDTA 0.1 M pH 8.
 Transferir el homogenizado anterior en una probeta de 100 ml y añadir 2 ml de
detergente aniónico (lauril sulfato de sodio al 25 %) mezclar.
 Colocar en baño maría a 60 ºC durante 10 min.
 Añadir 0.3 ml de NaCl 5 M y mezclar.
 Añadir solución de cloroformo – alcohol isoamilico (24:1 v/v) en un volumen igual al
obtenido en la etapa anterior; aproximadamente 30 ml. Agitar vigorosamente por 15
min.
 Centrifugar a 5 000 rpm.
 Separar el sobrenadante (fase superior) con una pipeta con todo cuidado para evitar
que el DNA se desnaturalice y colocarlo en una probeta de 100 ml.
 Se puede agregar más agua y volver a centrifugar hasta obtener un líquido claro.
 Agregar dos volúmenes de alcohol etílico al 95 % al sobrenadante extraído en un
matraz. El alcohol debe añadirse lentamente, mientras que con una varilla de vidrio
se trata de enrollar el DNA y escurriéndolo con cuidado a las paredes de un matraz.
 Colocar la varilla de vidrio con el DNA enrollado en un tubo de prueba y disolverlo en
20 ml de solución salina citrato (0.015 – 0.0015 M). Dejar en reposo 30 min.
 Añadir 2 ml de solución acetato de sodio 3 M a pH 7 la cual contiene 0.001 M de
EDTA.
 Mezclar con varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 0.5 volumenes
(agregue hasta observar precipitación) de isopropanol para precipitar selectivamente
al DNA. Seguir mezclando con la varilla de vidrio tratando de enrollar el DNA.
 Disolver al DNA obtenido en 20 ml de solución salina – citrato.

IDENTIFICACIÓN DE DESOXIRRIBOSA: Reacción de Dische.

Tomar dos tubos de ensayo y marcarlos de la siguiente manera: X (solución de DNA

obtenida en la práctica) y C (control).
 Control Muestra
Solución de DNA obtenida en la práctica --- 2.0 ml
H2O destilada 1.0 ml ---
Reactivo difenilamina en solución ácida 2.0 ml 2.0 ml

Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.

Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa se revela
por aparición de un color azul.

 RESULTADOS:

 CONCLUSIONES:
 El procedimiento no permine una purificación completa del DNA, es más, lo que
observamos no es únicamente DNA sino una mezcla de ácidos nucleicos (RNA y
DNA).
, y se ven los hilitos blancos que son ácidos nucleicos.

 CUESTIONARIO:

 Describa las propiedades fisicoquímicas del ADN.

Los polinucleótidos de DNA y RNA son hidrófilos debido a que se pueden formar
puentes de hidrógeno entre el agua y los fosfatos, o el agua y los OH de la pentosa.
Por tanto, son más solubles que las bases que los forman.

A pH fisiológico, los grupos fosfato presentan dos cargas negativas (el pK más alto es
6), por lo que los polinucleótidos son de naturaleza ácida.

Debido a que los polinucleótidos son moléculas muy largas en relación a su diámetro,
proporcionan soluciones viscosas.

Químicamente son muy estables, especialmente en el caso del DNA por carecer del
2’-OH. Es precisamente este radical el que proporciona las principales diferencias
entre ambos ácidos nucleicos, además de ser el principal responsable de la actividad
catalítica de las ribozimas.

 ¿En qué se diferencia el ADN del ARN?

El ARN se compone de cadenas más cortas de nucleótidos. La columna vertebral del

ADN consiste en azúcar desoxirribosa, mientras que la del ARN contiene el azúcar
ribosa. En el ADN, la complementaria a la adenina (A) es timina (T); mientras que en
el ARN es el uracilo (U).

 ¿Cuántos tipos de ADN existen?

Las bases nitrogenadas del ADN pueden ser de cuatro tipos: adenina (A), citosina

(C), timina (T) o guanina (G), junto a un grupo fosfato.

Tradicionalmente se distinguen tres niveles de esta estructura:

Estructura primaria.
Estructura secundaria.
Estructura terciaria.
Estructura cuaternaria.

 ¿Qué otros tipos de tejido se pueden usar en la extracción de ADN?

-Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un

único tubo.
-Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio.
 -Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio
- Método del CTAB

 ¿Por qué razón se usan 6.3 ml de NaCl 5M en una de las etapas de extracción del
DNA?

Precipitación con etanol helado. El DNA es soluble

en alcohol, pero se torna insoluble en presencia de
sal (NaCl) porque el sodio neutraliza la carga
negativa de los grupos fosfatos. El etanol formará
una capa en la superficie por ser menos denso que la
solución acuosa.

 ¿Cuál es el fundamento de la reacción de DIsche?

Reacción de Dische y Bial con el furfural formado a partir de ribosa. La presencia de

ADN se puede verificar mediante la reacción del Dische o difenilamina, en la cual la 2-
desoxirribosa del DNA reacciona con ácido sulfúrico para producir aldehído
hidroxilevulínico o 4-hidroxipentanal.

 BIBLIOGRAFÍA:

 Bishop Michael (2007) QUÍMICA CLÍNICA PRINCIPIOS PROCEDIMIENTOS Y

CORRELACIONES. Editorial Mc Graw Hill. 4ª edición.
 D’Ocon Carmen (2005) FUNDAMENTOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO.
Editorial Thomson – Paraninfo. España.
 Kaplan Pesce (1986) QUÍMICA CLÍNICA TEORÍA, ANÁLISIS CORRELACIÓN. Ed
Médica Panamericana.
 Sherma Joseph (2003) HANDBOOK OF THIN – LAYER CHROMATOGRAPHY. Ed
Marcel Dekker. New York.
 Jahnke Richard (2008) ENSAYOS DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
VOLUMEN II. Ed GPHF – Minilab. Alemania.