PRACTICA 1: SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE

AMINOÁCIDOS
I. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de aminoácidos
presentes en una muestra biológica.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO:
2.1. AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o
alcalina; se obtiene una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los cuales pueden ser
identificados por métodos cromatográficos.
o Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.
o In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
o El pKa de los grupos carboxilo y amino de los alfa -aminoácidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
o En la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilo habrá perdido un protón y el
grupo amino habrá captado un protón para dar la forma zwitterion.
o La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas, básicas,
neutras) de los aminoácidos les confieren distintas propiedades.
2.2. CROMATOGRAFÍA
Método de Separación
o Permite separar componentes relacionados de mezclas complejas.
o En estos métodos se emplea:
- Fase estacionaria : Sólido/líquido
- Fase móvil: liquido/gas
o “Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria
por medio de una fase móvil que fluye”.
o Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los
componentes de la muestra.

2.2.1.- Cromatografía en Capa Fina

La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla.
La cromatografía en capa fina es una cromatografía de adsorción, que tiene 2 partes: Fase
móvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria, es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido (pueden
ser de celulosa, sílica, óxido de aluminio… etc. )

El soporte poroso está adherido a la base, gracias a la presencia de SO4Ca.

El ZnS de la placa de silica gel, bajo luz UV se torna verde y si hay alguna marcha de la
migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.
En la elección del eluyente influyen varios factores, como. Precio, Pureza.
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez más polares.

La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción de los

componentes de la muestra con la superficie del sólido en la fase estacionaria. La fuerza
con la que es adsorbido un componente dependerá de la polaridad de los componentes, de
la actividad del adsorbente que conforma la fase estacionaria y de la polaridad de la fase
móvil.

Después del desarrollo cromatográfico se aplica una etapa de revelado, ya que los analitos
son incoloros. Se utiliza la ninhidrina como agente de revelado, la cual forma con los
aminoácidos un derivado de color azul-violáceo.
La constante RF (Factor de retardo) es una manera de expresar la posición de un compuesto
sobre una placa, y como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se
define como: 
RF= Distancia de la muestra desde el origen/Distancia del eluyente desde el origen
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la
mancha. El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y
0.7.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con
el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En
este caso no se pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino
indicador ultravioleta.

2.3.- Pasos de la cromatografía de capa fina.

Se realizan los siguientes pasos:
2.3.1. Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.
 En el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y 2 mm de diámetro.
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 5 mm.
2.3.2. Segundo Proceso: Elusión
 Una vez sembrada la muestra se eluye colocando la placa en la cámara
donde previamente se colocó la mezcla fenol agua.
 “El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.
o El solvente comienza a subir por capilaridad.
o Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarán rápidamente otros no.
2.3.3. Tercer Proceso: Visualización o Revelado
El producto puede verse, haciendo el revelado con una sustancia química reveladora
(ninhidrina en butanol, acetona o etanol)
2.3.4. Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo RF

que se define como:
 La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia
patrón en idénticas condiciones.
III. PARTE EXPERIMENTAL:
Observe el video, en el enlace:
https://www.youtube.com/watch?v=6PZGWMc47NA
o Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
o Corrida cromatográfica. Elusión
 Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
 Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación
cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte
superior de la placa.
o Revelado del cromatograma
 Una vez que haya alcanzado el frente del solvente, destapar la cámara y retirar con
cuidado la placa, y secarla.
 Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en solvente sobre la placa. Secar la
placa con una secadora.
 Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a
aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rf de los estándares y
luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
 Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una coloración
azul violeta.
IV. CUESTIONARIO:
5.1. Indique en que caso de la vida diaria, se observa un ascenso líquido eluyente sobre
una superficie sólida, y cuál es la explicación fisicoquímica de tal fenómeno.
5.2. Explique, qué significa el termino eluyente, y si este puede ser sólido, líquido o
gaseoso, para hacer cromatografía de aminoácidos de una muestra de proteínas.
5.3. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y cuáles son sus aplicaciones.
Cuales son similitudes y diferencias con la de capa fina.
5.4. Qué es la cromatografía de intercambio iónico y cuáles son sus aplicaciones.
Cuáles son sus similitudes y diferencias con la de capa fina.
5.5. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para sílica y alúmina.
5.6. Diga que es la ninhidrina, y con qué parte de los aminoácidos puede reaccionar.
5.7. Explique porque todos los puntos de la capa fina, donde hay aminoácidos, aunque
sean de distintos aminoácidos tienen el mismo color.
5.8. Explique cómo se logra identificar los distintos aminoácidos de una mezcla de
muestra problema, si todos ellos tienen el mismo color.