UNIVERSIDAD VERACRUZANA.

FACULTAD DE QUIMICA FARMACEUTICA BIOLOGICA.

PRACTICA No. 6: IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS

POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

ALUMNO (A): YOVAL COLORADO PAOLA.

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.

DR. ALBERTO SANCHEZ MEDINA.

 1. Objetivo.

Que el alumno aprenda el método analítico de cromatografía en capa fina

identificando un aminoácido en una solución problema.

2. Introducción.

El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos,

proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y
purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier
material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para
dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de
técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento fisicoquímico en el
que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio
iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que
se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases). Todas
las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las
distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas
propiedades podríamos citar: a) Diferencias en solubilidad en distintos solventes,
tanto orgánicos como acuosos. b) Diferencias en tamaño y forma. c) Diferencias
en carga. d) Diferencias en afinidad por otras biomoléculas. Todas estas
propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están
influenciadas por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura,
fuerza iónica e hidrofobicidad. De forma general, en las técnicas cromatográficas
existe una distribución de las moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o
parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase móvil que
circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta.

Cromatografía en capa fina.

En la cromatografía en capa fina (CCF), se puede utilizar como soporte cualquier

sustancia que puede dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en
forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de
aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc.) y orgánicas (celulosa,
poliamida, polietileno, etc.). La utilización de soportes hidrófobos facilita la
separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase
estacionaria es una lámina de 0.25-0.50 mm de espesor, extendida de forma
uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. El volumen de
muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación de los
componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del
compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas
bastará una cantidad muy pequeña (rango de µl) para aplicar suficiente cantidad
de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa
cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen
suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o
solutos de interés. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad
provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo
con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Las manchas
correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar
mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha
relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor
de Rf. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf
con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida.
La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas,
como es la de papel, tales como las siguientes: I. Una mayor resolución,
obteniéndose por lo general manchas más pequeñas. II. Una mayor velocidad de
separación. III. Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y
disolventes. IV. Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su
recuperación es muy simple. La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que
pueden formarse partículas muy finas del soporte, por lo que la relación
superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran área superficial por
unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede
aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la
cromatografía en papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad
asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de las moléculas.

Separación de aminoácidos.

Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de

sílica, empleando como fase móvil butano:agua:ácido acético (4:1:1). Las
manchas de los aminoácidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si
después de secarla se asperja con una solución de ninhidrina.

Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente

amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar
con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo obscuro.
Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los
primeros estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido
desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es
más confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos
se detectan por fluorescencia.

Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar

fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada
fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la
proteína debe degradarse hasta liberar los aminoácidos que la componen y luego
esto se separan en una placa de gel de sílica. La placa se gira 90 o y se desarrolla
con un segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse
con un reactivo de ácido fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los
sistemas en los que las plzcas se desarrollan en ambas direcciones (en este caso
se aplica sólo una muestra por placa) se conocen como TLC bidimensional.

3. Material.

 Placa de silica gel para cromatografía en

 capa fina.
  Agitador de tubos.
 Tanque cromatográfico.
 Gradillas con tubos de ensayo.
 Juego de pipetas (0.5, 1, 2, 5, 10, y 25 mL).
 Micropipetas
 Probetas (100 y 250 mL).
 Vasos de precipitado (100 y 500 mL).
 Frasco lavador con agua destilada.
 Recipientes de muestras biológicas de 50 mL.
 Papel de filtro.
 Capilares para aplicar muestras.
 Papel de parafilm.
 Rotulador de vidrio.
 Pipetas Pasteur de plástico.
 Guantes de látex.
 Frascos pulverizadores.
 Tijeras.

4. Reactivos.

 Glutamato.
 Glicina.
 Lisina.
 Prolina.
 Leucina.
 Solución problema de aminoácidos.
 Etanol.
 Hidróxido amónico.
 Ninhidrina.
 5. Metodología.

1. Sobre una placa de silica gel de

20 x 20cm se traza con un lápiz una 2. Sobre esta línea se colocan
recta paralela a uno de los bordes y los diferentes aminoácidos con
a una distancia de éste de 1 cm. los tubos capilares cuidando
que estos no se combinen.

4. Se añade al tanque cromatográfico eluyente 3. Se seca después de

hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que haber aplicado cada gota.
éste alcance la zona de aplicación de las
muestras. Se mete la placa en el tanque, se
tapa y se deja desarrollar la cromatografía
hasta que el eluyente alcance el borde.

5. Se añade al tanque cromatográfico eluyente hasta

una altura aproximada de 1 cm y sin que éste alcance la
zona de aplicación de las muestras. Se mete la placa en
el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografía
hasta que el eluyente alcance el borde
 6. Resultados.

¿Qué aminoácidos hay en la mezcla problema?

En la muestra problema se identificó el ácido aspártico.

En la siguiente tabla anote las distancias recorridas por cada

uno de los aminoácidos y Calcule el Rf.

Aminoácido Distancia recorrida (cm) Rf

Acido aspartico
1.3 0.1
Glicina
1.4 0.2333
Lisina
0.6 0.2166
Muestra problema Metodo de separacion de
1.2
0.2

7. Discusión.

Durante esta práctica utilizamos el método de capa fina para separar los distintos
aminoácidos.
En el resultado pudimos observar que el corrimiento de la muestra problema era
similar al del ácido aspártico.
Se lograron observar puntos de color morado-violeta de la
muestra problema y el ácido aspártico, mientras que los otros
aminoácidos tomaron un color más café- amarillento, esto es
debido a que la nihidrina reacciona con el grupo libre del
aminoácido.
En la revelación con nihidrina notamos que algunos
compuestos corrieron más que otros, esto se debe a que la
silica gel es un componente polar por lo cual aquellas
sustancias de carácter polar quedan más retenidos como
ocurrió con la lisina, debido a la atracción que existe
entre estos, ya que la cromatografía en capa fina es un método
de separación por adsorción.
 8. Conclusión.

Éste tipo de cromatografía nos permite identificar aminoácidos y que se genera

una reacción como consecuencia de la interacción entre la ninhidrina y los
distintos aminoácidos por la presencia del grupo amino, por lo tanto presenta un
color característico como es el morado. La ninhidrina, es el reactivo adecuado y
necesario para aplicar en cromatografía de aminoácidos, puesto que reacciona
con los principales compuestos (aminoácidos), permitiendo el reconocimiento de
los mismos por la coloración denominada púrpura de Ruhemann.

9. Cuestionario.

1. Consulte, en diversos textos, los tipos de cromatografías que existen y

sus aplicaciones.

Tipo de Descripción Aplicaciones

cromatografía
Adsorción Utiliza una fase estacionaria sólida y Separación de
una fase móvil líquida o gaseosa. El biomoléculas polares y no
soluto es adsorbido sobre la polares.
superficie de las partículas sólidas.
Partición Involucra un recubrimiento líquido Determinación de iones
muy delgado sobre la superficie del grandes como los
soporte sólido. El soluto se surfactantes, iones nitrato y
distribuye entre la fase móvil y la clorato.
estacionaria.
Intercambio La f. estacionaria sólida contiene Análisis de aguas;
iónico grupos iónicos tales como –SO3(-), determinación de alcalinos
o -N(CH3)3+ unidos de manera y alcalinotérreos.
covalente. Los iones en el soluto son
atraídos a la f.estacionaria por
fuerzas electrostáticas. La fase móvil
es líquida.
Exclusión Separación con base en el tamaño Separación de especies de
molecular de las moléculas del soluto, las de elevado peso molecular
mayor tamaño atraviesan la columna como polímeros y
más rápidamente. La f. estacionaria proteínas.
contiene poros lo suficientemente
pequeños para excluir moléculas
grandes, pero no las pequeñas.
De afinidad Emplea interacciones específicas Purificación de
entre un tipo de moléculas del soluto polisacáridos, los
y una segunda molécula unida a la glicopéptidos, y los
fase estacionaria. oligosacáridos y las células
que contienen las
estructuras determinadas
del hidrato de carbono.
2. ¿Qué propiedades ácido- base poseen los aminoácidos?

Los aminoácidos son compuestos nitrogenados que se caracterizan por presentar

un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos al mismo carbono.
Estos dos grupos se pueden ionizar en medio acuoso, siendo los responsables del
anfoterismo de los aminoácidos, es decir, pueden actuar como ácidos o como
bases, en función del pH del medio (los compuestos que son capaces de
aceptar o ceder protones se denominan anfóteros o anfolitos): el grupo -carboxilo
se comporta como un ácido débil y el grupo amino, como una base débil. Por ello,
la carga de los aminoácidos varía en función del pH. Además, cinco de los
aminoácidos proteinógenos presentan otro grupo ionizable en su cadena lateral:
Lys, Arg, His (aminoácidos con carga positiva o básicos), Asp y Glu (Aminoácidos
con carga negativa o ácidos).

3. ¿Qué son los péptidos?

Un péptido es una molécula que resulta de la unión de dos o más aminoácidos

(AA) mediante enlaces amida. En los péptidos y en las proteínas, estos enlaces
amida reciben el nombre de enlaces peptídicos y son el resultado de la reacción
del grupo carboxilo de un AA con el grupo amino de otro, con eliminación de una
molécula de agua. Generalmente se considera, según el autor, que los péptidos
no son mayores de 50 o 100 aminoácidos. De manera también general a una
cadena polipeptídica se le considera péptido y no proteína si su peso molecular es
menor de 5.000 daltons.

4. ¿Por qué hay algunos aminoácidos llamados esenciales y cuáles no?

AMINOÁCIDOS ESENCIALES

 Los aminoácidos esenciales no los puede producir el cuerpo. En

consecuencia, deben provenir de los alimentos.
 Los 9 aminoácidos esenciales son: histidina, isoleucina, leucina, lisina,
metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.

AMINOÁCIDOS NO ESENCIALES

 No esencial significa que nuestros cuerpos producen un aminoácido, aun

cuando no lo obtengamos de los alimentos que consumimos.
 Los aminoácidos no esenciales incluyen: alanina, asparagina, ácido
aspártico y ácido glutámico.
5. ¿Cuáles son los elementos de la cromatografía en capa fina?

Se lleva a cabo mediante la preparación de una capa uniforme, generalmente un

adsorbente, el cual se coloca sobre una placa de vidrio o un soporte. Algunos de
los adsorbentes que son utilizados son: la celulosa, el almidón, los azucares,
harina de sílice o silica gel, el óxido de aluminio o alúmina, el carbón activo o
carbón en polvo y Kieselguhr (harina silícea). La celulosa, el almidón y los
azucares son generalmente utilizados para la extracción de componentes poli
funcionales en animales y plantas.

10. Bibliografía

Beyer, H; Water, W.(1987). Manual de Química Orgánica. Reverté. España. Pp

211.

https://www.quiminet.com/articulos/que-es-la-cromatografia-en-capa-fina-
60769.htm

http://www.dciencia.es/aminoacidos-peptidos-y-proteinas/