Seminario 2: PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Se lo utiliza para amplificar un segmento específico del ADN.

Lo que se necesita para realizar esta reacción in vitro se necesita:

 Un molde (cadena simple).

 Desoxirribonucleótidos (dNTPs).
 Un extremo 3’ (con OH libre) que pueda elongarse.
 Primers (Cebadores) Determinan que región es la que va a codificarse, se necesitan 2, uno
para cada cadena, por lo que para poder diseñarlos, hay que conocer previamente la secuencia
del ADN.
 Buffer.
 Mg2+ cofactor para que la polimerasa adquieran su morfología adecuada.
 Agua (ya que la reacción tiene lugar en un componente acuoso).

La PCR consta de un ciclo de 3 pasos Se realiza en termocicladores Se realizan 35/40 ciclos

1. La muestra se calienta a 95oC para desnaturalizar la muestra, rompiendo los puentes de H y así
poder separar las cadenas y exponer las cadenas simples para que puedan ser replicadas.
2. Se baja la temperatura (51 – 70oC) para realizar la hibridación de los primers (puedan a unirse a
la secuencia del genoma que se busca replicar).
3. Ocurre a una temperatura de 70 – 75oC y es cuando se polimeriza la secuencia en cuestión por
una enzima (TAQ polimerasa).

Se evita la desnaturalización a altas temperaturas de las polimerasas ya que las que intervienen en este
proceso son las TAQ polimerasas, las cuales son termo resistentes.

La amplificación de este proceso es exponencial, es decir, que en cada ciclo la secuencia que se busca
replicar se va a seguir reproduciendo (haciendo que en cada ciclo sea más elevada la concentración de la
secuencia que se buscaba replicar), cabe aclarar que la única parte que se reproduce del genoma es para
la cual fueron diseñados los primers. No se van replicando infinitamente ya que los sustratos son
limitados.

Cantidad de copias

Cantidad de ciclos
Electroforesis en gel de ácidos nucleicos

Como los ácidos nucleicos tienen una carga negativa (-), mediante esta técnica se busca
separar las moléculas de ADN según su tamaño.
A
Se aplica una carga eléctrica al gel, buscando que el ADN migre hacia el lado positivo. A las
moléculas más grandes en tamaño se les va a dificultar el paso por el gel hacia el lado
B positivo, mientras que a las moléculas más pequeñas no tanto.

Se utiliza un colorante para poder visualizar en que región se encuentra el ADN, ya que este
no es visible a simple vista por el ojo humano (Ej.: Bromuro de etidio).

En el paciente A se encuentra la región que se buscaba replicar, pero no se encuentra en el paciente B.

Control + Paciente A Paciente B

PCR en tiempo real (Cuantitativa)

Se usa un agente fluorescente muy sensible, en el termociclador también se encuentra módulo óptico
que mide en cada ciclo la cantidad de fluorescencia que hay en la muestra. De esta forma, podemos ver
las cantidades aproximadas de pares de bases que se reproducen en cada ciclo. Al valor donde el
módulo óptico comienza a reconocer la fluorescencia se lo denomina Ct o Cq.
 Las moléculas que inicialmente tienen más pares de bases comenzarán a reproducirse de manera
exponencial más rápidamente, sin embargo, aquellas con menos pares de bases tardarán más ciclos en
llegar a su crecimiento máximo. Esto nos permite visualizar que muestra contenía más cantidad de
región que buscábamos replicar, la cual puede ser por ejemplo, producida por un virus. Las
fluorescencias finales no nos permiten visualizar la cantidad de moldes iniciales que tenían las muestras.

RT-PCR: PCR con retrotranscripción Se utilizó por ejemplo en el diagnóstico del SARS-Cov-2

 Permite amplificar moléculas de ARN

Etapa I: retrotranscripción

Se busca generar ADN, a partir del molde de ARN para poder identificarlo. Se realiza a partir de una
retrotrasncriptasa. Estos ADN que surgen a partir de los moldes de ARN se los llama cADN

Etapa II

Se utilizan primers específicos, para replicar los cADN (misma técnica que en los PCR).