Métodos en genética

Tema 7: PCR
7.1 Requerimientos y componentes
7.1.1 Requerimientos:
PCR: reacción en cadena de la polimerasa, nos permite la síntesis de ADN en el
laboratorio (in vitro).
Esta técnica fue inventada por Kary Mullis, por la cual ganó un Nobel de Química en
1993, y revolucionó por completo el mundo de la Biología.
Previamente ya se sintetizaba mediante el uso de las polimerasas, pero gracias a esta
técnica es posible sintetizar ADN con cantidades minúsculas de material de partida.
¿Qué necesitamos?
- ADN: muestra de la que partimos.
- dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato): utilizados como sustrato por la
polimerasa.
- Enzima polimerasa (Taq polimerasa): no pueden sintetizar por ella misma,
necesita que los cebadores le aporten el extremo 3’OH.
- Cebadores: sin ellos no hay actividad polimerasa y no hay síntesis.
- Tampón: Tris-ClH, KCl y Mg. Aporta el ambiente óptimo para la polimerasa.
- Aparato de PCR o termociclador: es donde se produce la reacción de PCR,
básicamente sube y baja la temperatura en los tiempos que le indicamos.

7.1.2 Componentes:
➢ ADN:
es una molécula muy estable, lo que nos permite amplificarla desde
condiciones que no parecen óptimas (como sangre seca o un herbario).
Solamente se requieren nanogramos como material de partida, e incluso en
técnicas de PCR muy sensibles se puede amplificar desde órdenes de magnitud
menores.
➢ Polimerasas:
Son enzimas complejas compuestas por muchas subunidades diferentes,
constituyendo una holoenzima. Todas requieren un molde, el cual dirige la
síntesis, que es una cadena en dirección 3’→5’, es decir la síntesis es 5’→3’.
Estas enzimas requieren un extremo 3’OH (al que comenzar a meter
nucleótidos) que les proporciona el cebador, sin que ellos se lo aporten no hay
síntesis.
 Muchas son específicas de ADN, es decir, sintetizan ADN a partir de ADN, por lo
que se llaman ADN polimerasas ADN dependientes.
Otras son capaces de sintetizar ADN reconociendo moldes de ARN, sintetizan
ADN a partir de ARN, son ADN polimerasas ARN dependientes. Comúnmente a
este tipo de enzimas de las denomina transcriptasas inversas (comunes en virus
con ARN como material genético).
Además de sintetizar ADN, también tienen otras actividades diferentes: son
capaces de degradar ADN mediante actividad exonucleasa en dirección 3’→5’
(o sea, la dirección de síntesis, corrección de errores: nucleótidos que se han
añadido mal) y en algunos casos también hay actividad exonucleasa 5’→3’,
degradando nucleótidos que se encuentran por delante (no los que acaba de
sintetizar), relacionada con la eliminación del cebador.
En la PCR utilizamos una ADN polimerasa particular, la Taq polimerasa. Proviene
de una bacteria termófila (Thermus aquaticus), por lo que es capaz de resistir
siendo termoestable hasta los 94oC, aunque su temperatura óptima está entre
los 72 y los 82oC. Tiene como limitación el carecer de actividad correctora de
pruebas, por lo que de media introduce un error por cada 10.000 nucleótidos
que incorpora. Es una ADN polimerasa ADN dependiente.

➢ Cebadores:
Delimitan la región del ADN que se quiere sintetizar. Son los componentes más
importantes para el éxito de la reacción.
Por PCR se amplifican regiones, no genomas enteros, lo que nos interesa son
genes específicos o regiones intragénicas de interés. La amplificación depende
del buen diseño de los cebadores, de hecho, es a lo que más tiempo se le
dedica en el laboratorio durante el proceso.
Son oligonucleótidos monocatenarios, hay que diseñarlos homólogos a las
regiones flanqueantes de la región que queremos amplificar.
La especificidad y estabilidad del híbrido formado entre la hebra molde y los
cebadores son la clave clave del éxito para la reacción de PCR.
Factores a tener en cuenta en su diseño:
1) Longitud: deben de tener entre 20 y 24 nucleótidos. Si fuesen menos el
cebador no sería lo suficientemente estable y si fuesen más se correría el
riesgo de que nuestro cebador se uniese a regiones que no queremos
(uniones inespecíficas).
2) Composición de bases: el contenido de guaninas y citosinas debe de ser al
menos del 50%, esto confiere estabilidad. No debe de haber mas de 3 o 4
bases repetidas, para evitar la formación de estructuras bicatenarias no
productivas. En cada reacción debe de haber dos cebadores, sin regiones
complementarias entre ellos.
3) Concentración: se debe añadir la suficiente concentración de cebadores
para los muchos ciclos que se realizan.
 Para que los cebadores se unan al ADN, este debe de encontrarse
desnaturalizado (se consigue aplicando calor a 95oC). Para que se puedan unir
hay que llegar a la temperatura de anillamiento, que suele estar sobre los 55oC.
Si el diseño es incorrecto no se podrá unir si es pequeño, si es largo se unirá a
los 55oC, pero no de manera específica a la región completamente
complementaria.

7.1.3 Reacción de amplificación:

Es la repetición entre 25 y 30 veces de un mismo ciclo que consta de 3 etapas:
1) Desnaturalización del ADN molde a 95oC durante varios minutos
2) Anillamiento de cebadores a 55-60oC
3) Extensión a 72oC (temperatura óptima para la polimerasa)
Cuando acaban las repeticiones hay un último ciclo extra a 72 oC, para asegurar que se
terminan las polimerizaciones.
Debemos conocer la secuencia, ya que debemos diseñar los cebadores en función a
ella.
En el caso hipotético de que inicialmente sólo tuviésemos una molécula de ADN
tendríamos:
- 1er ciclo: 2 moléculas de ADN
- 2o ciclo: 4 moléculas de ADN
- 3er ciclo: 8 moléculas de ADN
Es decir, para n ciclos sintetizaremos 2n moléculas de ADN.
Producto de PCR: fragmento que incluye los cebadores (al principio y al final, ya que
son ADN) de ADN de doble cadena, damos el tamaño en pares de bases (pb) siempre.

7.1.4 Equipamiento requerido y aplicaciones:

Termociclador: sube y baja la temperatura en los tiempos que especificamos (las
temperaturas que queremos en cada una de las 3 etapas y durante cuánto tiempo)
Visualización de fragmentos: nuestro material amplificado se carga en un gel de
agarosa, donde al tener el ADN una carga siempre negativa, migra de manera
diferencial por su tamaño. Después se hace una electroforesis, en la que apreciaremos
una única banda, ya que hemos amplificado una única región del genoma (un único
tamaño de pb).
Aplicaciones: de la PCR convencional
- Amplificación de secuencias específicas
- Detección de secuencias específicas
 - Producción de sondas: producto que permite seguimiento, por ejemplo, en una
hibridación que hayamos marcado.
- Reconstrucción y amplificación de muestras de ADN parcialmente degradado:
rellena por los huecos que dejan extremos 3’OH libres a los que se unen las
polimerasas
- Producción de secuencias con modificaciones o mutagénesis: metiendo un
único cambio en el medio del cebador, no en el extremo, desde el primer ciclo
el cebador estará incorporando ese cambio.

7.2 RT-PCR:
7.2.1 Amplificación de secuencias de ARN por
retrotranscripción y PCR:
La amplificación de ARN es especialmente interesante para estudiar, no el gen o región
génica del genoma, si no lo que se está expresando. La Taq polimerasa no reconoce
ARN, por lo que no puede trabajar sobre moldes de ARN y no podemos hacer una PCR
directamente desde ARN.
Si queremos saber si un gen se está transcribiendo, primero debemos de sintetizar ADN
desde el ARN y a partir de ese ADN hacer la PCR. Por eso a esta técnica se la llama RT-
PCR, la RT es de retrotranscripción.
RT-PCR:
Primero se debe sintetizar ADN a partir de la muestra de ARN, esto se consigue gracias
a las transcriptasas inversas (son un tipo de ADN polimerasa) mediante
retrotranscripción. (Pregunta de examen: saber que la retrotranscriptasa es una ADN
polimerasa, NO una ARN polimerasa).
Como cualquier otra ADN polimerasa necesita un cebador que le proporcione el
extremo -OH y sintetiza en dirección 5’→3’, formándose una molécula híbrida con una
hebra de ARN y otra hebra de ADN.
Una de las subunidades de la retrotranscriptasa tiene actividad ARNasa H que es capaz
de reconocer y degradar (eliminar) la hebra de ARN. Así, se nos queda una hebra
complementaria de ADN y debemos sintetizar la otra para conseguir un ADN copia
bicatenario, usando dNTPs, cebadores y actividad polimerasa.

7.2.2 Cebadores utilizados en la reacción de

retrotranscripción:
Estos son los cebadores utilizados para la obtención de esa primera hebra de ADN a
partir de la hebra de ARN.
Las ARN polimerasas no necesitan cebador, pero las ADN polimerasas sí y la la
retrotranscriptasa en una ADN polimerasa.
Existen tres tipos diferentes de cebadores que usaremos:
1) Oligo dT: usándolo podremos amplificar todos los ARNm que han transcrito en
ese momento. Es un oligonucleótido de un polímero de timina (T) , como los
ARNm eucariotas tienen una cola de poliadeninas en 3’ eso se puede utilizar
para sintetizar ADN (A-T), haciendo una secuencia de T, esta se une a la cola de
As.
2) Mezcla de oligómeros: cebadores de secuencias cortas y arbitrarias de 6
nucleótidos, formando todas las combinaciones posibles. Así se unirá a
pequeños fragmentos aleatorios del molde desde donde se podrá empezar a
sintetizar.
3) Cebadores específicos: para buscar si se ha expresado un gen en particular
diseñamos un cebador específico. Si está expresado se unirá y viceversa.

7.2.3 Esquema RT utilizando oligo dT: (mirar diapositiva)

- Tenemos nuestra muestra de ARN y mediante el uso de un cebador de tipo
oligo dT y añadiendo dNTPs al medio, el cebador se une a la cola de adeninas y
la transcriptasa inversa (TI) polimeriza la hebra de ADN complementaria en
dirección 5’→3’.
- Una vez tenemos ya nuestro híbrido de una hebra de ARN y una hebra
complementaria de ARN, la actividad ARNasa H de la transcriptasa se encarga
de degradar la hebra de ARN.
- Ya tenemos nuestra primera hebra de ADN sola, a la que se le añade en el
extremo 3’ una secuencia de guaninas. Esto se realiza mediante la actividad
transferasa terminal de dNTT, que mete guaninas de dGTP en el extremo 3’ de
nuestra hebra. En consecuencia, todas acabarán teniendo una cola de
guaninas.
- Por esta cola de guaninas se utiliza como cebador un oligo dC (de citosinas), que
permite sintetizar la hebra de ADN complementario con la TI en dirección
5’→3’.
- Así ya tenemos el ADN copia, añadiendo dNTPs al medio, Taq polimerasa y oligo
dC y oligo dT como cebadores ya se puede realizar la reacción de PCR.

7.3 PCR cuantitativa:

7.3.1 Comparación entre PCR convencional y qPCR:
qPCR: PCR cuantitativa, permite amplificar, detectar y cuantificar secuencias. A la
reacción de PCR convencional se le añaden compuestos como moléculas fluorescentes
que se unen al producto de PCR, lo que nos puede permitir saber, por ejemplo, la carga
viral en una muestra.
Es decir, en la PCR convencional averiguamos si hay o no un producto al final. Con la
qPCR se mide la cantidad de producto que hay en cada ciclo, es más sensible.

PCR convencional PCR en tiempo real

Mide la cantidad de producto
amplificado al final de la PCR
Medida cualitativa
Baja sensibilidad
Aplicaciones: secuenciación, genotipado,
clonación
Mide el producto amplificado en cada
ciclo
Medida cuantitativa porque los datos se
recogen durante la fase exponencial de la
PCR
Alta sensibilidad
Aplicaciones: cuantificación de la
expresión génica y validación de ensayos,
detección de patógenos, detección de
polimorfismos, diagnóstico de tumores…

7.3.2 Fases de la PCR: no son las fases de cada ciclo, es la relación de

cantidad de ADN producido frente al no de ciclos.
1) Exponencial: en cada ciclo se duplica el producto
2) Linear: se han ido gastando los componentes
3) Plateau: no hay más producción de producto, la reacción se para, si quisiéramos
seguir haría falta pones nuevos sustratos.
Figura de la diapositiva: hay una misma cantidad de ADN inicial, pero diferente
cantidad de producto final. Se alcanza el plateau en diferentes momentos, pero no la
exponencial. Por eso lo más fiable es poder visualizar en la fase exponencial, que es lo
que puede hacerse mediante qPCR ya que es mucho más sensible.

7.3.3 Valores usados para la cuantificación:

Queremos contar la fluorescencia que se debe a la amplificación, no el ruido de fondo.
Dentro de la fase exponencial el equipo de PCR en tiempo real calcula dos valores:

• Línea Threshold o umbral: es el nivel de detección en el que una reacción

alcanza una intensidad de fluorescencia por encima del fondo (nivel de
detección debida a la síntesis de ADN).
 • Valor Ct (cycle threshold): ciclo de la PCR en el que la muestra alcanza ese
umbral o se supera la fluorescencia de fondo. Este valor nos sirve para estimar
la carga viral inicial en una muestra. A mayor Ct, menor ADN inicial de partida,
ya que se han necesitado muchos ciclos de amplificación para detectarlo.
El valor Ct se utiliza para la cuantificación o la detección de presencia/ausencia.
La comparación de valores Ct de muestras de concentración desconocida con
una serie de estándares o patrones nos permite la estimación precisa de la
cantidad de ADN en la reacción.

7.3a Métodos de detección qPCR:

7.3.a.1 SYBR green I:
Se añade directamente el fluorocromo al tubo y este se une con el ADN de doble
cadena según se va sintetizando, quedando atrapado entre las dos hebras y emitiendo
fluorescencia a partir de ahí.
Según se van añadiendo nucleótidos se atrapan moléculas del fluorocromo y es el
propio ADN el que lo excite haciendo que se produzca la fluorescencia.
Mediante esta técnica se puede llegar a cuantificar desde cantidades de 0,1
picogramos de ADN inicial, es mucho más sensible que la PCR convencional, aunque
cuanto más ADN inicial antes se alcanza el Ct y la fluorescencia.

7.3a.2 Método de detección de sondas TaqMan

Sondas TaqMan: oligonucleótido complementario a una región particular que se
quiere amplificar (especificidad) con dos moléculas fluorescentes a sus extremos.
La sonda tiene en el extremo 5’ un fluorocromo y en el 3’ otra molécula llamada
fluorocromo receptor que absorbe la fluorescencia.
La Taq polimerasa tiene actividad 5’-3’ exonucleasa, es decir puede eliminar
nucleótidos por delante. A partir del cebador la Taq polimerasa se pone a sintetizar
hasta que se encuentra con la región donde ha hibridado la sonda, con su actividad
exonucleasa la Taq polimerasa es capaz de liberar al fluorocromo del extremo 5’ en el
tubo, emitiendo una fluorescencia que ya no es absorbida porque se ha alejado del
fluorocromo receptor.
Ejemplo de discriminación alélica usando sondas TaqMan específicas de alelos:
Para estudiar patologías producidas por el cambio de un único nucleótido en un gen.
Se diseñan dos sondas diferentes:
1) Alelo 1 con un fluorocromo
2) Alelo 2 con otro fluorocromo
 Una de las sondas es complementaria a la variante (mutación) y la otra es
complementaria a la otra (sin mutación). Observando los resultados de fluorescencia
podemos ver qué sonda se ha unido y por lo tanto qué alelo hay presente en el gen. Si
observamos una sola fluorescencia es homocigoto para ese alelo, si observamos dos
fluorescencias es heterocigoto.

Sondas TaqMan frente a SYBR-green I:

Detección basada en sondas
Uso de una sonda fluorogénica que permite la
detección de un producto de PCR específico
según se acumula
Detecta solo los productos amplificados
específicamente
Ventajas:
- Para generar fluorescencia se requiere
hibridación específica entre la sonda y el
ADN diana, reduciéndose el fondo y los
falsos positivos.
- Se pueden marcar sondas con diferentes
fluorocromos, permitiendo la
amplificación de secuencias distintas en
un mismo tubo de reacción
Inconveniente: se requieren sondas distintas para
cada región que se quiere amplificar.
Detección basada en SYBR-greenI
Usa un fluorocromo de unión a doble cadena de
ADN para detectar la acumulación de producto de la
PCR
Detecta todo el ADN de doble cadena amplificado,
incluyendo productos de reacción inespecíficos
Ventajas:
- No se requieren sondas, disminuyendo el
tiempo de ensayo y costo.
- Muchas moléculas de SYBR-greenI se unen al
producto amplificado, aumentando la
sensibilidad.
Inconveniente: al unirse a cualquier cadena de doble
hélice de ADN se pueden generar falsos positivos.

7.3b Cuantificación y aplicaciones de la qPCR:

7.3b.1 Cuantificación de la expresión:
Método de cuantificación absoluta:
- Relaciona la señal obtenida con el número de copias de un gen (o picogramos o
nanogramos de ADN) utilizando una curva de calibración. Al conocer la
fluorescencia y la cantidad exacta de cada tubo, podremos realizar una curva,
luego podemos interpolar cuál es la cantidad conociendo la fluorescencia de la
muestra problema.
- Hay que asegurarse de que la concentración de la serie de disoluciones está en
rango de concentración del gen cuyo número de copias se quiere estimar (de la
muestra problema).

Método de cuantificación relativa:

 - Compara los valores Ct de una muestra de interés con el obtenido en una
muestra de referencia que usamos como calibrador. Previamente los errores de
muestreo o pipeteo se corrigen comparando el valor Ct de la muestra con el de
un gen endógeno (housekeeping). Este gen endógeno es constitutivo, es decir,
lo vamos a encontrar expresándose de manera constante en todas la células y
tejidos.
- En el ejemplo de la imagen vemos la comparación de dos muestras de un
paciente oncológico antes y después del tratamiento (4 PCRs totales: una para
el gen endógeno y otra para la muestra del paciente, antes y después),
utilizando como calibrador el gen endógeno ADNr 18. Previo al tratamiento hay
menos distancia entre ambos Ct (su nivel de expresión está más cerca), en
cambio tras el tratamiento la distancia entre los Ct ha aumentado, es decir, el
gen marcador tumoral del paciente ha disminuido su expresión (lo que nos
podría hablar de una remisión de la enfermedad).
Método de comparación de Ct:
1) Primero hay que normalizar los errores de pipeteo comparando la amplificación
del gen de interés con la amplificación del gen endógeno en cada una de las
muestras:
Ct gen del marcador tumoral (muestra1) – Ct gen ADNr (muestra1) = ∆Ct muestra 1
Ct gen del marcador tumoral (muestra2) – Ct gen ADNr (muestra2) = ∆Ct muestra 2

2) Una vez corregido los errores, se puede comparar la amplificación del gen que
codifica el marcador tumoral en las dos muestras:

∆Ct muestra 2 - ∆Ct muestra = ∆∆Ct

2-∆∆Ct= No de veces que una muestra se expresa más o menos que la muestra tomada como
referencia

7.3b.2 Aplicaciones:
La PCR en tiempo real tiene muchas aplicaciones en investigación científica y como
herramienta de diagnóstico:

• El análisis de los cambios de expresión génica de células a través de la

cuantificación de su ARNm permite asociar los cambios a estados fisiológicos
celulares, presencia de fármacos, agentes infecciosos…
• En investigación forense y bioseguridad para la identificación con una alta
sensibilidad y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en
el medio ambiente.
• En el campo de seguridad alimentaria para la identificación de organismos
genéticamente modificados en los alimentos o aditivos alimentarios.