Aislamiento de clorofila y pigmentos carotenoides a partir de espinacas

Adaptado de: Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., y Engel, R.G. Introducción a las
técnicas de laboratorio orgánico: un enfoque a microescala 3a edición Saunders College
Publishing: Nueva York, NY, 1999.
Habilidades técnicas y teóricas
En esta tarea aprenderás
o Aislamiento de un producto natural.
o Extracción
o Cromatografía en columna
o Cromatografía de capa fina

Introducción
Las hojas de las plantas contienen varios pigmentos coloreados que generalmente se dividen en dos
categorías, clorofilas y carotenoides. Las clorofilas verdes a y b, que son compuestos altamente
conjugados, capturan la energía luminosa (no verde) utilizada en la fotosíntesis. Los carotenoides
son parte de una colección más grande de compuestos derivados de plantas llamados terpenos.
Estos compuestos naturales contienen 10 (= monoterpeno, es decir, limoneno, tujene, careno,
geraniol, mentol, terpineol), 15 (= sesquiterpeno, es decir, zingibereno, farnesol), 20 (= diterpeno,
es decir, taxadieno, esteviol, fitol, retinol), 25 (= sesterterpenos, es decir, geranilfarnesol), 30 (=
triterpeno, es decir, escualeno, lanosterol) y 40 átomos de carbono (= tetraterpeno, es decir,
lipoceno, caroteno), lo que sugiere que hay un compuesto con cinco átomos de carbono que sirve
como su edificio bloquear. Sus estructuras son consistentes con el supuesto de que se hicieron
uniendo unidades de isopreno, generalmente en una moda de "cabeza a cola". Isopreno es el nombre
común para 2-metil-1,3-butadieno. El extremo ramificado es la "cabeza" y el no ramificado es la
"cola". El hecho de que las unidades de isopreno estén unidas de la cabeza a la cola para formar
terpenos se conoce como la regla del isopreno. Licopeno (se muestra a la derecha), el compuesto
responsable de la coloración roja de los tomates (3 mg / 100 g) y la sandía (4,5 mg / 100 g), y -
caroteno, el compuesto que hace que las zanahorias (8 mg / 100 g) y los albaricoques (2 mg / 100 g)
sean de color naranja, son ejemplos de carotenoides. El ote-caroteno que se escinde para formar dos
moléculas de vitamina A cuando se ingiere, es la principal fuente dietética de esta vitamina. Los
carotenoides actúan como antioxidantes y antiinflamatorios en el ser humano. El retinol, también
llamado vitamina A, juega un papel importante en la visión. La luteína y la zeaxantina se asocian
principalmente con la salud ocular.
Las hojas de espinaca, que los estudiantes usarán en esta tarea
este trimestre, contienen clorofila a, clorofila b y -caroteno
como pigmentos principales, así como pequeñas cantidades de
otros pigmentos como las xantofilas. Las xantofilas, que son
versiones oxidadas de carotenos, y feofitinas, que se parecen a
la clorofila, excepto que el ion de magnesio es reemplazado por
dos átomos de hidrógeno. En esta tarea, el estudiante aislará y
separará los pigmentos de espinacas usando diferencias de
polaridad para efectuar la separación. Dado que los diferentes
componentes tienen un color diferente, la separación se sigue fácilmente visualmente.
Estructura molecular y polaridad

Las estructuras de los componentes principales se dan a continuación. Tenga en cuenta que el -
caroteno, que es un hidrocarburo, es no polar. Por el contrario, ambas clorofilas contienen varios
enlaces polares C-O y C-N. y también un ion de magnesio quelado a los átomos de nitrógeno. Las
distinciones entre las clorofilas, que son más polares que el -caroteno, son leves: la clorofila a
tiene un grupo metilo (Y = CH3) en una posición donde la clorofila b tiene un aldehído (Y = CHO).
Esto hace que la clorofila b un poco más polar que la clorofila a. Las feofitinas son moléculas de
clorofila sin los iones Mg2 + y con dos átomos de nitrógeno protonados en su lugar.
Después de extraer la mezcla de pigmento de las hojas en una solución de hexano, aproveche esta
diferencia de polaridad para separar la mezcla mediante cromatografía en columna.
Cromatografía de columna
La cromatografía en columna implica la separación de compuestos por el mismo mecanismo que
otras técnicas cromatográficas, es decir, diferencias en la división entre las fases móvil y
estacionaria (consulte "Cromatografía" en su texto).
La fase estacionaria sirve como un adsorbente a través del cual se pasa la fase móvil. Se pueden
usar muchos compuestos con diversos grupos funcionales como fase estacionaria y varios tipos de
interacciones pueden ayudar a desarrollar la separación deseada (es decir, enlaces de hidrógeno,
dipolo-dipolo, interacciones, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, exclusión por
tamaño, afinidad, etc.) La siguiente secuencia ilustra la afinidad general de los grupos funcionales
hacia una fase estacionaria polar como la sílice:
iónico> ácidos / bases> amidas> alcoholes> cetonas> aldehídos> ésteres> éteres> haluros>
hidrocarburos insaturados> hidrocarburos saturados
Las principales ventajas de la cromatografía en columna son su capacidad para manejar grandes
cantidades de material (en comparación con GC, TLC y HPLC) y la capacidad de cambiar el
disolvente de elución durante el transcurso de la separación. Esto le permite a uno eliminar un
componente mientras que el producto deseado permanece esencialmente inmóvil. Un cambio en la
fase móvil mueve el producto deseado a través de la columna, que puede incluir cambios en la
polaridad del solvente, cambios en el pH o cambios en la fuerza iónica. Los dos últimos se utilizan
en gran medida en separaciones biológicas (proteínas, péptidos).
Al variar la fase estacionaria y al cambiar la fase móvil, se puede lograr una separación eficiente.
En esta asignación, la alúmina sirve como la fase estacionaria, que se considera una fase
estacionaria polar debido a la presencia de oxígeno y grupos hidroxilo en la superficie. Así, los
componentes más polares se sujetan a la alúmina polar con mayor fuerza y, por lo tanto, se mueven
a través de la columna más lentamente. El aumento de la polaridad del solvente mueve todos los
componentes más rápido, pero tiene el mayor efecto sobre los compuestos polares porque su
solubilidad aumenta significativamente.
Finalmente, analizará e identificará las fracciones de pigmento utilizando una cromatografía de capa
delgada, que también se separa por polaridad.
Procedimiento experimental
Período 1: Aislamiento del pigmento de las hojas de espinaca
Pese alrededor de 1.0 g de hojas de espinacas frescas (evite usar tallos o venas gruesas). Corte o
rasgue las hojas de espinaca en trozos pequeños y colóquelos en un mortero junto con 0.5 g de
sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) y 2.0 mL de acetona. Moler con una mano de mortero hasta que
las hojas de espinaca se hayan roto en partículas demasiado pequeñas para poder verlas claramente
y mezclar bien con Na2SO4.
Si se ha evaporado demasiada acetona, es posible que deba agregar una porción adicional de
acetona (0.5-1.0 mL). Usando una pipeta o espátula Pasteur, transfiera la mezcla a un tubo de
centrífuga. Enjuague el mortero y la maja con 2,0 ml de acetona fría, y transfiera la mezcla restante
al tubo de centrífuga. Tapa herméticamente. Centrifugue la mezcla asegurándose de equilibrar la
centrífuga primero (¡Asegúrese de devolver el tubo de centrífuga al TA al final de la reunión!).
Agregue ~ 2.0 mL de hexano al tubo de centrífuga, tape el tubo y agite bien la mezcla. Luego,
agregue 2.0 mL de agua y agite bien con ventilación ocasional. Centrifugar la mezcla para romper
la emulsión, que generalmente aparece como una capa verde turbia en el medio de la mezcla. La
capa de pigmento es la capa superior, que debe ser de color verde oscuro. La mayor parte de la
acetona se disolverá en el agua.
Usando una pipeta Pasteur seca, separe cuidadosamente las capas y transfiera la capa orgánica
superior (una solución de hexano verde oscuro de pigmentos de espinacas) en un tubo de ensayo
limpio. Agregue otro 1.0 mL de hexano al tubo de centrífuga que contiene la capa acuosa, tape el
tubo y centrifugue la mezcla para romper la emulsión. Separe las capas nuevamente y agregue la
capa superior al tubo de ensayo.
La solución de hexano verde oscuro de los pigmentos de espinaca en el tubo de ensayo puede
contener trazas de agua eso debe eliminarse antes de separar los componentes mediante
cromatografía (¿Por qué?). Secar la solución, agregue 0.5 g de sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) a
la solución de hexano. Tapa y gire suavemente para permitir que el sulfato de sodio entre en
contacto con todas las partes del hexano. Después de estar parado por 5 minutos, use una pipeta
Pasteur limpia y seca para transferir el líquido a otro tubo de ensayo limpio. Etiqueta este tubo de
ensayo con una E para extracto para que no lo confundas con los tubos de ensayo trabajando con
más adelante en este experimento.
Agregue aproximadamente 0.5 ml de hexano para enjuagar el sulfato de sodio hidratado y transfiera
este líquido al mismo tubo de ensayo E.
Cromatografía en columna de pigmentos de espinacas
Sujete una pipeta Pasteur limpia y seca verticalmente y presione un tapón muy pequeño de algodón
hasta el fondo de la pipeta. Pesar aproximadamente 1,25 g de alúmina. Empaque la columna con
alúmina y agregue suavemente un poco menos de medio cm de arena de mar hasta la parte superior
de la columna. Toque suavemente para lograr una superficie plana.
Una vez que se inicia el procedimiento, no debe detenerse: la alúmina debe mantenerse húmeda con
solvente todo el tiempo. Dado que la columna no tiene una llave de paso para detener el flujo de
disolvente durante el procedimiento, todos los solventes deben estar en su espacio de trabajo antes
de comenzar el proceso. En recipientes etiquetados separados, obtenga 15 ml de hexano, 15 ml de
solución de 70% de hexano-30% de acetona, 15 ml de acetona y 15 ml de solución de acetona al
80% y metanol al 20%. Además, etiquete seis tubos de ensayo 1 a 6 y un vaso de precipitados como
"disolvente residual".
Primero, transfiera aproximadamente 0.5 ml de su extracto de espinaca (del tubo de ensayo, E) a un
vial pequeño para usarlo más tarde en el análisis de cromatografía en capa fina.
Luego, cuando esté listo para comenzar la separación de la columna, coloque el vaso de
precipitados de residuos debajo la columna y agregue aproximadamente 3.0 ml de hexano a la parte
superior de la columna. A medida que la alúmina se humedece, el hexano fluirá hacia el vaso de
precipitados. Cuando el nivel de solvente drene a la parte superior de la arena, agregue su extracto
de espinacas en la parte superior de la columna.
A medida que el extracto drena sobre la alúmina, los pigmentos deben comenzar a separarse en una
banda de caroteno amarillo y una banda de clorofila verde. Si se observa una separación, agregue 4
ml adicionales de hexano y continúe recolectando solvente en su vaso de residuos de solvente hasta
que la banda amarilla llegue al fondo de la columna y el drenaje del disolvente se vuelven amarillos.
Reemplace el vaso de residuos con el tubo de ensayo # 1. Continúe agregando hexano hasta que la
banda amarilla pase a través de la columna cambiando a los tubos de ensayo # 2, # 3, etc., según sea
necesario hasta que el eluyente amarillo se aclare. Luego, reemplace el tubo de ensayo con el vaso
de residuos.
Si la banda amarilla no ha comenzado a separarse de la banda verde después de que los 4 ml
iniciales de hexano se hayan drenado a través de la columna, agregue 4 ml del siguiente disolvente
más polar (70% de hexano y 30% de acetona). Al cambiar los solventes, no agregue el nuevo
solvente hasta que el nivel del último solvente esté casi en la parte superior de la alúmina. Cuando
se encuentre el solvente apropiado, agregue este solvente hasta que la banda amarilla se elimine por
completo de la columna.
Una vez que la banda amarilla ha eluido de la columna, agregue varios ml del siguiente solvente
más polar cuando el nivel del último solvente esté casi en la parte superior de la arena. Si la banda
verde baja por la columna, continúe agregando este solvente hasta que la banda verde se eluya
completamente de la columna. Si la banda verde no se mueve, cambie al siguiente solvente polar.
Recoja la banda verde en un tubo de ensayo limpio. Cubra y guarde estas fracciones para el
próximo período de laboratorio cuando estudiará el espectro visible y el TLC de las fracciones
verde y amarilla.
Si es necesario debido a limitaciones de tiempo, el vial puede etiquetarse con su nombre, taparse y
almacenarse hasta el próximo período de laboratorio.
Período 2: Caracterización
1. Cromatografía de capa fina:
Antes de poder llevar a cabo la cromatografía en capa fina (TLC) en sus fracciones y extracto
original, debe guardar aproximadamente 3 ml de las fracciones de clorofila y -caroteno para los
espectros UV-visibles. Para el TLC debes concentrar las fracciones separadas. Pase una corriente
suave de aire sobre las soluciones en una campana para evaporar la solución al disolvente
aproximadamente 1 ml de solución amarilla y 1 ml de solución verde. Si tiene varios tubos de
ensayo del mismo pigmento, combine el contenido a medida que se evapora para terminar con solo
un vial de carotenos amarillos y un vial de clorofilas verdes.
Dibuje suavemente una línea de lápiz horizontal a aproximadamente 1 cm del fondo de una
cromatografía de capa delgada (10 cm x 4 cm). Como se muestra en la figura a continuación,
localice sus tres soluciones (E, amarillo y verde) en esta línea. Use un tubo microcapilar separado
para cada solución. Llene cada capilar sumergiéndolo en la solución y toque suavemente la placa
para vaciarlo.
Use varios toques cortos para vaciar cada capilar de modo que las manchas sean pequeñas (1-2 mm
de diámetro). Si las manchas se ven de color claro, vuelva a colocarlas sobre las manchas originales
hasta que estén bastante oscuras. Permita que las manchas se sequen. Obtenga un recipiente de
cromatografía, y agregue aproximadamente 10 ml de disolvente de desarrollo (70% de hexano-30%
de acetona), luego coloque la placa de TLC en el recipiente de desarrollo con el extremo manchado
en el fondo del recipiente y permita que el disolvente se eleve subir la placa sin perturbar hasta que
aproximadamente el 80% de la placa esté húmeda (la línea de inicio debe estar por encima del nivel
de disolvente). Retire la placa y dibuje rápidamente una línea de lápiz a través de la placa para
marcar el mayor alcance del solvente.
Esto se llama el frente solvente. Permita que la placa húmeda se seque en la campana. Encierra en
un círculo los puntos visibles con lápiz, ya que los colores pueden desvanecerse con el tiempo.
Transfiera el diagrama a su computadora portátil de laboratorio y tome una foto con su teléfono
celular también.
Factor de retardo (Rf):
Diferentes compuestos deben moverse diferentes distancias en sus placas TLC; sin embargo, la
distancia exacta que se mueve un compuesto en particular depende de qué tan lejos se permita que
el solvente suba por la placa. Cuanto más se mueve el solvente, más se desplazan los puntos. Para
tener en cuenta esta variación, se calcula y se informa la relación de las dos distancias. Esta
relación, llamada factor de retención (Rf) permite la comparación con los valores informados y el
trabajo de otras personas. Específicamente, el factor de retardo se define como la distancia
fraccional que se mueve el centro del punto en comparación con la distancia recorrida por el frente
solvente. El valor Rf para un compuesto depende del disolvente de desarrollo y la composición del
adsorbente en la placa de cromatografía.

La apariencia de una placa de TLC para la separación de una mezcla de dos componentes.
Para su informe posterior al laboratorio, calcule los valores de Rf para cada punto en su plato. Es
probable que las manchas con los mismos valores de Rf dentro del error experimental y la misma
apariencia sean el mismo compuesto. Consulte el folleto para conocer las pautas específicas para el
informe.
Incluya un boceto de su placa TLC en su cuaderno. Sin embargo, su plato puede ser
considerablemente más complejo en apariencia que el ejemplo anterior.
Dependiendo de la muestra de espinacas, las condiciones del experimento y la cantidad de muestra
que se detectó en la placa de TLC, puede observar otros pigmentos. Estos componentes adicionales
pueden resultar de la oxidación del aire, la hidrólisis u otras reacciones químicas que involucran los
pigmentos discutidos en este experimento. Asegúrese de etiquetar claramente los carriles como
procedentes del extracto, la banda amarilla o la banda verde y etiquetar los colores de la mayor
cantidad posible de puntos separados.
Usando la guía a continuación, identifique tantos puntos en el TLC como pueda. Determine qué
pigmentos estaban presentes en la banda amarilla y cuáles estaban presentes en la banda verde de su
columna.
Pigmentos
Pigmentosen
enlas
lasespinacas
espinacasen
enorden
ordendecreciente
decrecientede
delos
losvalores
valoresde
deRf:
Rf:
Carotenos
Carotenos(1(1punto)
punto)(amarillo-naranja)
(amarillo-naranja)
Feofitina
Feofitinaaa(gris,
(gris,puede
puedeser
sercasi
casitan
tanintensa
intensacomo
comolalaclorofila
clorofilab)b)
Feofitina
Feofitinabb(gris,
(gris,puede
puedeno
noser
servisible)
visible)
Clorofila
Clorofilaaa(azul
(azulverdoso,
verdoso,más
másintenso
intensoque
quelalaclorofila
clorofilab)b)
Clorofila
Clorofilabb(verde)
(verde)
Xantofilas
Xantofilas(posiblemente
(posiblementetres
trespuntos:
puntos:amarillo)
amarillo)
2. Espectros UV-Visibles:

Tome el espectro UV-visible de su clorofila y  – caroteno de  = 400–800 nm.