PRÁCTICA 6: USO DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN EN INGENIERÍA GENÉTICA

1.Introducción
Las enzimas de restricción son enzimas (nucleasas) que se aíslan de bacterias y que
tienen la capacidad de reconocer una secuencia específica en el ADN de doble cadena y realizar
“cortes” en dicha molécula. Estos cortes que llevan a cabo se basan en la hidrólisis del enlace
fosfodiéster en cada una de las hebras de ADN. Cada una de las enzimas de restricción se
caracteriza por reconocer una secuencia específica de ADN (entre 4 y 6 nucleótidos), lo cual se
conoce como “sitio de restricción” o “secuencia diana”.

Las diversas enzimas de restricción se clasifican en tres grupos distintos en función de

sus propiedades. Las más utilizadas son las del tipo II, las cuáles se usan en las múltiples
aplicaciones que tienen en el ámbito de la ingeniería genética y biotecnología. Tras el corte
algunas enzimas dejan en la molécula de ADN extremos romos, mientras que otras generan
extremos cohesivos. Las enzimas de restricción son una herramienta ampliamente utilizada en
la ingeniería genética, por ejemplo, para llevar a cabo una subclonación de un gen de interés
desde un vector de clonación a un vector de expresión.

Un vector de clonación (vector plasmídico) es una molécula de ADN circular

extracromosómico con capacidad de replicarse de forma independiente al ADN nuclear. Estos
vectores tienen que tener una serie de características:

-Replicación autónoma, para lo cual tienen un replicón u origen de replicación.

-Sitios de clonación (MCS) con secuencias dianas únicas para enzimas de restricción que
permitan introducir un gen de interés.

-Marcadores fenotípicos seleccionables, como, por ejemplo, genes de resistencia a

antibióticos.
 Un vector de expresión presenta todos los elementos anteriores del vector de
clonación, pero también contiene en su secuencia un promotor para permitir la expresión de un
determinado gen de interés.

2.Objetivo
Disponemos de un plásmido de clonación (pGEMT) que contiene un gen de interés, una
ciclina (CCND2), el cual se quiere transfectar en un cultivo celular para sobreexpresar este gen.
Para conseguir que haya una sobreexpresión de dicho gen es necesario subclonarlo en un vector
de expresión con un promotor (sitio CMV).

El objetivo de esta práctica es llevar a cabo un análisis de restricción en el vector de

clonación pGEMT que contiene el gen CCND2 para aislarlo de dicho plásmido y posteriormente
poder clonarlo en un vector de expresión (pcDNA.3.1).

Secuencia diana EcoRI:

Secuencia diana ScaI:

3.Materiales
-Molécula de plásmido pGEMT con el inserto (CCND2)

-Enzimas de restricción ScaI y EcoRI.

-Micropipetas.

-Tubos Eppendorf (1,5mL y 0,2mL)

-Gel de agarosa.

4.Procedimiento
1º Preparar en un tubo Eppendorf de 0,2 mL los reactivos de la reacción:

- 2 µL Buffer Green Fast Digest x10.

- 1 µL enzima EcoRI.
- 1 µL enzima ScaI.
- 3 µL ADN (pGEMT).
- 13 µL H2O.

2º Incubar a 37ºC durante 5-10 minutos.

3º Llevar a cabo una electroforesis en un gel de agarosa.

La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas cargadas por la acción de un
campo eléctrico en función del tamaño de dichas moléculas. Las moléculas de ADN, al estar
cargadas negativamente, al aplicarle un campo eléctrico se van a dirigir hacia el polo positivo
(ánodo).

Aquellas moléculas de ADN que sean de mayor tamaño van a encontrar mayor resistencia para
atravesar el gel de agarosa hacia el polo positivo, de forma que van a correr menos. Sin embargo,
las que son de menor tamaño van a tener menos dificultad para atravesar el gel, por lo que la
distancia que migran va a ser mayor.

El gel de agarosa se preparará al 1%. Para preparar un gel de agarosa al 1%, pesaremos 0,5g de
agarosa y se disolverá en 50mL de tampón TAE. La agarosa se fundirá y se dejará solidificar hasta
obtener el gel. El voltaje aplicado será de 100mV y se dejará correr durante 30 min.

4ºIdentificar en el gel los fragmentos obtenidos.

5.Resultados
Tras correr el gel de agarosa, los resultados esperados
son los siguientes:
Tamaño del vector + inserto: 5428 pb
Tamaño del vector cortado (sin inserto): 4033 pb
Tamaño del inserto: 1395 pb