PRÁCTICA 5 - SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLECULAS: CROMATOGRAFÍA

Objetivos:

 Utilidad y propósito de purificar proteínas en el mundo actual.

 En base a tu comprensión de las propiedades de las proteínas y del funcionamiento,
podrás elegir la técnica de cromatografía adecuada para una situación.
 Conocer referencias para realizar consultas técnicas sobre cromatografía.

1) Rompes el origen biológico (compleja) las paredes de una bacteria,

2) Centrifugación
3) Sobrenadante (fase soluble)  precipitan están desnaturalizadas
¿Cómo se subiliza un precipitado? Con solvente orgánico
4) Buffer para almacenamiento -> se usa buffer

NOTA: Se destruyen sus estructuras tridimensionales en bajas temperaturas

Como se conservan proteínas

GLICEROL
PRUFICACION DE PROTEINAS:

Una propiedad de las proteínas te dará  una técnica

- Gel de filtración: exclusión por tamaño

- Interacción hidrofóbica: gradiente de que tanto se pegan a la esfera
microesferas que tienen
- Carga eléctrica: Proteínas con más fuerza electrostática, se pegan
- Afinidad especifica por algo: proteínas con un receptor especifico y así se pegan las
proteínas
- ESPECIAL -> CROMATOGRAFIA fase reversa implica tener a las proteínas en solvente
orgánico (no mantiene su estructura funcional) no es bueno para estructuras
complejas, pero si para péptidos porque como son pequeños se pueden Re-naturalizar
con facilidad.

CROMATOGRAFIA

FASE MOVIL: buffer (fase acuosa)

FASE ESTATICA: son esas volitas – las microesferas (en conjunto recina)
ENVASE : recina + buffer

CILINDRO de vidrio:

 ACIDO DEBIL 8 (H2 PO) concentración de 20 a 50 mM (minimolar)

 SAL – NACL O KCL (50 a 500 minimolar)

EXCLUSION O FILTRACION MOLECULAR

 ABSORBANCIA  A280 NM

Buffer:

Cambio de pH en el buffer las proteínas

Punto isoeléctrico: es el punto de pH en que la proteína consigue una carga neta de cero
Gradiente escalonado de salinidad
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

ETIQUETAS  histidina (metal) la recina comercial esta llena de atomos de niquel ionico +2

Los aminoacioacidos de histidina de manera aque tu proteina modificada geneticamente

tendra afinidad por la histidina.

Proteina fusion por la etiqueta de histidina  actuan con el niquel +2

ELECTROFORESIS 

EJEMPLO:

DNA POLIMERASA PHUSION  es practica porque continene frufriding

Tiene fusionado

- Primer cromatografia:
- Segunda cromatografia: productos de PCR – bandas de PCR

una orgnaismos termofimlos,

INFORME

-exclusion de tamaño: cada polimero tienen distintos rangos de poros que van a formar los
cuales van a permitir separar una particula de interes.

-intercambiadores ionicos: depende del pH

* Anionicos: permite interaccionar con una proteina de interes de carga negativa

* Cationicos: permite interaccionar con una proteina de interes de carga positiva

Buffer -  ounto isoelectrico 4.4 en  +

No siempre es conveniente, tambien puedes usar las mismas cargas

CROMATOGRAFIA POR FILTRACION: podemos determinar que tanto

DETERMINAR QUE TIPO DE MATRIZ SE VA A UTILIZAR

Croma

Exclusion de tamaño: no hay mcuha diferencia en el punto isoelectrico