Taller Técnicas de laboratorio en bioquímica :

PRECIPITACION DE PROTEINAS

MATERIA: Bioquímica

GRUPO : 4

INTEGRANTES:

- Alejo Campos, Silvia Rocio

- García Alpiste, Nayeli Norit
- Monge Aviles, Angye
- Muñoz Sovero, Eliane Anat
- Nakagawa Meza, Hiromi Fiorella
- Solier Lopez, Katherin
- Tirado Bistolfi, Ariadna

Coordinador:

- Zimic, Mirko
 Introducción

La precipitación es un método importante para la purificación de proteínas y es una estrategia

utilizada para estudiarlas y caracterizarlas de manera individual. Cuando una proteína se
solubiliza, pierde la capacidad de unirse a otras proteínas lo cual provocaría su precipitación o
también insolubilización. La solubilidad de las proteínas va a variar dependiendo de algunas
condiciones.

Cuando las proteínas se encuentran en el punto isoeléctrico, tienen una solubilidad mínima. Si
el valor de ph está por arriba del punto isoeléctrico, la proteína tiene carga neta positiva y si el
valor del ph está por debajo del punto isoeléctrico, tiene carga neta negativa. En general. Casi
todas las proteínas son estables en un nivel de ph determinado y se desnaturalizan cuando el
nivel de pH es muy alto o muy bajo.

La solubilidad puede variar dependiendo de la adición de sales neutras y esto es la

consecuencia del efecto salino, que es propio de sustancias poco solubles. Las sales neutras
tienen iones con una molaridad entre 0.5 y 1 M y pueden aumentar la solubilidad de las
proteínas. Los iones disminuyen la atracción electrostática entre las cargas opuestas de grupos
próximos de las proteínas. Por lo tanto, gracias a estos iones, aumenta la solvatación de las
proteínas y también su solubilidad. Si la concentración de las sales neutras es mayor a 1 M, la
solubilidad disminuye y puede conducir a una precipitación.

En una fuerza iónica baja, los iones neutralizan la carga en la superficie de la proteína. La
solubilidad disminuye para las proteínas que poseen una alta incidencia de zonas no polares y
aumenta en las proteínas que no poseen esa alta incidencia. La disminución de la solubilidad
es causada porque aumentan las interacciones hidrofóbicas y es más soluble cuando
desciende la actividad iónica de la molécula.

Para producir la precipitación de las proteínas, existen algunos métodos, como el efecto de las
sales, y pueden ser salting in y salting out; también existe la precipitación por alteración de ph
(Mínima solubilidad de pl); la precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), que
disminuyen la constante dieléctrica de la solución y por ello su poder de solvatación; entre
otros.

En esta práctica de laboratorio, se estudiará el método de precipitación por salting out.

Objetivo

Evaluar y analizar el procedimiento de los protocolos que existen para la purificación de proteínas por
precipitación.

Purificación de IgG por precipitación con sulfato de amonio

Revise el video demostrativo sobre purificación de inmunoglobulinas con sulfato de amonio.

A Ud se le ha asignado la tarea de purificar IgG a partir de suero de conejo inmunizado. Ha recibido
100mL de dicho suero. Ud decide determinar el porcentaje de saturación de sulfato de amonio necesaria
para obtener la mayor pureza de la inmunoglobulina.

Antes de empezar el experimento, Ud debe preparar una solución saturada de sulfato de amonio.
Describa el procedimiento.

En las soluciones saturadas, el solvente ya no puede admitir más soluto, es decir que ya no lo
podrá disolver. Para preparar estas soluciones se debe tener en cuenta la temperatura y la
presión ya que estas tienen efecto en la solubilidad de los solutos.

Para preparar la solución saturada de sulfato de amonio se debe tener en cuenta la cantidad
que se desea preparar, el volumen de agua destilada y peso de sulfato de amonio que se
necesitará. Para hallar dichas cantidades, se emplean tablas Se debe mezclar el soluto y el
solvente, removiendo constantemente y calentando la mezcla. Una vez disuelta, se procede a
enfriar la solución, luego se ajusta el pH a 7. Para lograr esto se agrega NH4OH. Finalmente, si
se observa algún exceso de soluto, se procede a filtrar la solución con un filtrador de 0.2 μ my
se conserva a 4oC (AAT Bioquest, 2021)
Según lo revisado en la bibliografía Ud encuentra que los porcentajes de sulfato de amonio utilizados para este fin
varían de acuerdo al tipo de muestra con el que trabajan (suero, líquido ascítico, cultivo de hibridomas,etc) y de la
especie de donde proviene la muestra (humano, rata, conejo, bovino). Los porcentajes de sulfato de amonio para
purificar inmunoglobulinas varían entre 35 y 50%.

Ud decide probar una saturación escalonada de 30, 40 y 50% de sulfato de amonio utilizando
100 mL del suero. El experimento se realiza en hielo.

Complete la siguiente tabla:

% Volumen inicial % Vol Vol final de la

(NH4)2S de la mezcla (NH4)2S (NH4)2SO4 mezcla
O4 Vim (mL) O4 saturado (mL)
Final inicial (mL)
30 100 0 42.86 142.86
40 142.86 30 23.81 166.67
50 166.67 40 33.33 200

Para calcular el volumen de la solución saturada de sulfato de amonio que tiene que usar puede utilice la
siguiente fórmula:

Vol (NH4)2SO4 saturado (mL)=100 X (S2−S1)/(1−S2)

- 30%
Vol (NH4)2SO4 saturado (mL)=100 X (0.3−0)/(1−0.3)=42.86
Vol final de la mezcla (mL)=100+42.86=142.86
- 40%
Vol (NH4)2SO4 saturado (mL)=142.86 X (0.4−0.3)/(1−0.4)=23.81
Vol final de la mezcla (mL)=142.86+23.81=166.67
- 50%
Vol (NH4)2SO4 saturado (mL)=166.67 X (0.5−0.4)/(1−0.5)=33.33
Vol final de la mezcla (mL)=166.67+33.33=200

S1 y S2 expresados como fracciones de las soluciones saturadas Compruebe sus

resultados con la tabla I

También podría utilizar cristales de (NH4)2SO4 para realizar obtener las fracciones de la purificación.

Calcule la cantidad en gramos de (NH4)2SO4 que tendría que usar en el experimento y complete la tabla.
Utilice el siguiente enlace: http://encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm.

% Volumen inicial g Vol final de la

(NH4)2S de la mezcla (NH4)2SO4 mezcla
O4 (mL) (mL)
Final
30 100 16.98 109.02 mls
40 109.02 6.36 112.40 mls
50 112.40 6.77 115.99 mls
 1)

2)

3)

Ahora con estos datos escriba el protocolo que utilizará para realizar el experimento. Incluya
detalles de volúmenes, concentraciones temperatura, tiempo de incubación, etc.

Precipitación con sulfato de amonio

Se puede mezclar su preparación de proteína con una solución de sulfato de amonio al

100% o puede agregar sulfato de amonio sólido para obtener la concentración porcentual
deseada utilizando el programa anterior. Un protocolo típico es el siguiente:

1. Prepare una solución saturada de sulfato de amonio, por ejemplo ~ 550 g hasta 1 l de
agua destilada.

Calentar suavemente para disolver todo el sulfato de amonio y dejar enfriar a temperatura
de trabajo en un agitador magnético. Deben formarse cristales de sulfato de amonio que
le dirán que la solución está completamente saturada.

2. Agregue el volumen apropiado de sulfato de amonio saturado o sulfato de amonio

sólido a su muestra para obtener la concentración deseada. Revuelva durante 1 hora
para equilibrar completamente.

3. Centrifugar a 10.000 g durante 15 minutos para sedimentar las proteínas.

4. Agregue más sulfato de amonio saturado o sulfato de amonio sólido para hacer la
siguiente concentración, repita la agitación y la centrifugación.

5. Disuelva los sedimentos en PBS para analizar las proteínas. Dependiendo de cuál sea
su próximo paso, puede ser necesario dializar el sulfato de amonio.

Luego de la purificación es necesario eliminar las sales, Ud utilizará la diálisis.

Describa el procedimiento y detalles del tipo de membrana que utilizará (“cut off”).

Al realizar la diálisis vamos a utilizar membranas semipermeables, ya que es un tipo de

filtración molecular. Estas membranas contienen poros, cuyos tamaños son controlados,
estos permiten que moléculas pequeñas (disolventes, sales y metabolitos pequeños) y/o
cuerpos de menor tamaño al de los poros determinados, se difundan a través de la
membrana, pero bloqueando el tránsito de moléculas mayores, como las proteínas.

El proceso se rige por los siguientes pasos:

1. Se posiciona a la membrana semipermeable en una solución de etanol para su
conservación, y posterior limpieza con agua destilada.
2. Cuando ya obtenemos la proteína suspendida, se procede a sellar la membrana
por un solo extremo, permitiéndole un espacio para evitar una lesión.
3. Colocamos la membrana en la solución de intercambio (que depende del volumen
de las concentraciones) con el buffer que contiene una menor concentración de sal.
Esto dará paso a la diálisis, permitiendo la salida del exceso de sales del
contenedor.
4. Procedemos a almacenarla en un congelador con el agitador magnético activado
por alrededor de 24 horas.
5. Se agrega una pastilla magnética para mantener el equilibrio y solubilizar todos los
componentes, buscando una homogeneización.
6. Retiramos la proteína y le permitimos ligeramente secar sobre una hoja de papel
 En la siguiente figura se muestran los resultados análisis por electroforesis en condiciones no
denaturantes de las fracciones obtenidas de la purificación de IgG de conejo con los siguientes
% de sulfato de amonio: carril 1 37%, 2: 40%, 3: 43%, 4: 45%, 5 suero inicial.

Electroforesis:

Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando
se ven sometidas a un campo eléctrico.

Se separan las purificaciones dependiendo del porcentaje del sulfato de amonio utilizado. La idea es ver en
cual de los porcentajes se recupera con mayor pureza la proteína.

Las bandas azules son proteínas con colorante cumazi.

¿En qué porcentaje de saturación Ud observa IgG más pura?

La intensidad de las bandas azules revelan la concentración de proteína con el

colorante cuamatzi. Se puede observar , en la electroforesis se manifiesta el IgG más
pura en la columna número 1 y número 2 ,que posee una saturación de 37% y 40%,
respectivamente debido a que el recorrido de la lámina hay poca presencia de
contaminantes, es decir poca presencia de proteínas diferentes al de IgG ya que no se
encuentran degradadas por algún agente químico.
¿Qué porcentaje de saturación utilizará para la purificación de IgG de todo el lote de
suero?

Se utilizará con un porcentaje de 37% de saturación, columna 1, debido a que hay poca
presencia de contaminantes, de la cual se observa bandas muy claras a comparación
con la columna 2, a pesar que la columna número 2 tenga mayor intensidad de
presencia de inmunoglobulina G.

Cuestionario

1. ¿Por qué el sulfato de amonio es la sal más usada para la precipitación de proteínas?

Esta sal posee un amplio rango de aplicaciones gracias a la facilidad de su accionar (es
altamente soluble) y porque mantiene la cantidad de pasos necesarios en un mínimo,
también por su capacidad de lograr una precipitación estable. Todos los protocolos de
purificación son altamente específicos y parten de un tejido intacto. Este se basa en que las
proteínas pierden solubilidad al incrementarse su concentración, su determinación es
empírica.

2. ¿Cuál es el rol del factor de solubilidad en la precipitación de proteínas?

El factor de solubilidad es el que se altera en los diferentes mecanismos, por lo que es un

factor determinante del proceso.

3. ¿Qué significa “salting in” y “salting out”?

En primer lugar, podemos describir el “Salting IN” como un fenómeno que sucede a bajas
concentraciones, la sal añadida incrementa la solubilidad de las proteínas cargadas en la
solución; ya que, la sal aumenta las interacciones electrostáticas, previniendo la
precipitación. Por otro lado, el “salting out” es el proceso que ocurre a altas concentraciones,
la sal añadida en este caso disminuye la solubilidad de las proteínas porque compite por el
solvente (H2O) necesario para solvatar las proteínas en solución. Por lo que, las altas
concentraciones de sal remueven la capa de solvatación, permitiendo la precipitación.

4. ¿Por qué es menos aconsejable utilizar sulfato de amonio en cristales para la purificación
por precipitación?

Para el proceso de purificación por precipitación en cristales es necesario que su solvente

posea un punto de ebullición relativamente bajo para que pueda ser eliminado fácilmente,
no debe ocurrir interacción química entre el solvente y el soluto, pero si su solvente es
demasiado soluble , es decir, que hay facilidad en su accionar como es el caso del sulfato
de amonio, no es recomendable usarlo para este proceso.

5. ¿Por qué es necesaria la diálisis y qué aplicaciones tendría en el proceso de purificación?

La diálisis es un proceso muy importante en todos los niveles que refiere, cuyo resultado es
la “limpieza” de las soluciones que se ponen en estudio. Una de sus aplicaciones sería en el
ámbito médico, puesto que la usan en el tratamiento de pacientes con insuficiencia renal,
 entre otros. Por otro lado, en el ámbito de la investigación científica, facilita la extracción del
cuerpo deseado de un conjunto de diferentes participantes del sobrenadante.

6. ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la purificación de anticuerpos?

Para empezar, la purificación de anticuerpos implica la separación/aislamiento de diferentes

anticuerpos del sobrenadante del cultivo en estudio el cual es un anticuerpo policlonal
(mezcla heterogénea de anticuerpos).
Sus aplicaciones varían desde diversos tipos de test (de embarazo, identificación de
desórdenes hormonales o para la detección de marcadores tumorales) hasta para
simulaciones con fines de investigación.
Discusión:

En el experimento de precipitación de inmunoglobulinas con sulfato de amonio.

Cuando se agrega una solución de sulfato de amonio las globulinas precipitan, esto es la
sedimentación de las “globulinas”, quienes precipitan con una semi-saturación de la sal de sulfato
de amonio.
El sulfato de amonio es altamente soluble en agua y no tiene efecto sobre la estructura de las
proteínas. Por lo que al usar sulfato de amonio sobre las proteínas, la precipitación puede regresar
a su estado inicial.

Además, la cantidad de precipitado depende de la cantidad y del tipo de proteína globular presente
así como la concentración de la sal (sulfato de amonio) usada, las globulinas son proteínas
insolubles a bajas concentraciones de sales .
Se puede concluir que las albúminas necesitan mayor concentración de sulfato de amonio para
precipitar en comparación de globulinas, añadiendo el dato que el huevo presenta mayor cantidad
de proteínas globulares.

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas, esto desorganiza
la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Además, el aumento de la temperatura
destruye las interacciones débiles y la estructura de la proteína se ve afectada, produciendo la
agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.
Podemos observar la precipitación de las proteínas por el calentamiento, siendo más completa en
un medio débilmente ácido, cercano al punto isoeléctrico, en un medio neutro o más ácido la
precipitación es mas abundante, por el contrario en un medio alcalino no produce una precipitación.
Tomado de Segel 1975

REFERENCIAS:

1. AAT Bioquest, Inc. (2021, October 30). Ammonium Sulfate, Saturated.". Retrieved from
https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/ammonium-sulfate-saturated
2. Briones L., Castillo J., Ramírez A., Ruiz K. (s. f) Solubilidad de proteínas. Recuperado de:
https://xdocs.pl/doc/practica-de-solubilidad-de-proteinas-48ger9j2mdn2