UVM México Escuela de Ciencias de la Salud

Universidad del Valle de México

Práctica número 2: Electroforesis de Proteínas.

Areli Cabrera Sánchez, Saúl Días Cabrera José Antonio Robledo Cruz, Yaél Sebastián Blancas.
Asignatura: Biología Molecular.
Licenciatura Q.F.B.T.
Periodo 2018-1
Fecha de Entrega: 28 de Febrero del 2018.
Docente: Dra. Marcela Gonzales Montoya.
RESUMEN
Se preparó el gel de poliacrilamida a base de acrilamida y buffers, el cual sirve de soporte para estabilizar a la
muestra y esta pueda separarse de la mejor forma, para esto es necesario de agentes estabilizantes que le
permitan a la proteína separarse, como es la implementación de buffer para estabilizar su carga y el SDS que es
de suma importancia ya que esta solución le dará una carga negativa homogénea a toda la muestra, del mismo
modo es necesario prepara la muestra desnaturalizando con acaso sulfúrico. Obteniendo como resultado la
separación de la muestra ras un tiempo de corrida de aproximadamente 90 min. Observando que la presencia
de proteínas ligeras es abundante en la misma.
Palabras Clave:
Cromatografía, técnica analítica, electroforesis, poliacrilamida, buffer superior, inferior de corrida, staking,
Introducción
Para muchas aplicaciones proteómicas, la
Tecnología de la proteómica electroforesis en una dimensión es el método de
elección. Las proteínas se separan de acuerdo a su
El desarrollo de la proteómica se debe en parte a los masa y como las proteínas son solubilizadas en
avances importantes realizados en la tecnología de dodecil sulfato sódico (SDS), no suele haber
proteínas. Sin embargo, la metodología disponible problemas de solubilización. Es una técnica
tiene sus limitaciones y actualmente todavía no es sencilla, reproducible y permite la separación de
posible realizar muchos tipos de proteómica. Es proteínas de 10-300 KDa. Una de las aplicaciones
necesario mejorar algunas de estas limitaciones y más comunes de la 1-DE es la caracterización de
desarrollar nuevas tecnologías para conseguir el proteínas después de realizar algún tipo de
máximo partido. Las cuatro plataformas de la purificación previa.
tecnología proteómica son:
La electroforesis bidimensional 2D-PAGE permite
• Preparación y manejo de la muestra separar hasta miles de proteínas en un solo
experimento, y constituye actualmente el método
• Determinación de la información de la
secuencia parcial de aminoácidos más eficiente para la separación de mezclas muy
complejas de proteínas. Está basada en una
• Identificación y cuantificación de separación de proteínas en función de la carga,
proteínas seguida de una separación de las proteínas en
función de su masa molecular. La separación de la
• Mapeo celular primera dimensión se realiza mediante
isoelectroenfoque, durante el cual las proteínas son
Separación de proteínas separadas en un gradiente de pH hasta alcanzar una
posición en la que su carga neta es cero, es decir,
La tecnología más usada para la separación de su punto isoeléctrico. En una segunda dimensión,
proteínas es la electroforesis en geles de las proteínas son separadas mediante electroforesis
poliacrilamida. Esta técnica es la más eficaz para en presencia de SDS. La alta resolución de la
resolver mezclas complejas de proteínas. técnica se basa en que las dos separaciones se basan
en parámetros independientes. La innovación clave
para la 2D-PAGE fue el desarrollo de geles con un

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gradiente de pH inmovilizado (IPG). El gradiente
de pH inmovilizado elimina los problemas de
inestabilidad del gradiente y baja capacidad de
carga que iban asociados a los gradientes de pH
preparados con anfolitos acarreadores. En los geles
IPG, el gradiente es generado por las llamadas
“inmobilinas” y está con-polimerizado con la
matriz de acrilamida del gel.
La aplicación principal de la 2D-PAGE es la
proteómica de expresión. En esta aproximación, la
expresión de proteínas de dos muestras se puede
comparar de forma cuantitativa. La aparición o
desaparición de manchas proporciona información
sobre la expresión diferenciadle proteínas y la
intensidad de las manchas permite conocer los
niveles de expresión. Para realizar estos estudios se
pueden utilizar organismos completos, líneas
celulares o fluidos biológicos. Se pueden comprar
tejidos normales con tejidos enfermos, o células
tratadas con drogas o diferentes estímulos
FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
La electroforesis es la migración de solutos iónicos
bajo la influencia de un campo eléctrico; estas
partículas migran hacia el cátodo o ánodo
(electrodos - y +), en dependencia de una
combinación de su carga, peso molecular y
estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analítica, los métodos
electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de
resolución y versatilidad, y sirven como método de
separación de mezclas complejas de ácidos
nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde
aportan un potente criterio de pureza. Se pueden
conocer también mediante estas técnicas, las
características ácido-básicas de las proteínas
presentes en un extracto crudo, lo que da la
información necesaria si se pretende realizar una
separación cromatográfica basada en diferencias de
carga. Es útil además para determinar otros
parámetros como peso molecular, punto
isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de
las proteínas.
Para llevar a cabo una separación electroforética
zonal se necesitan los elementos mostrados en la
Fig. 1:
• Fuente de alimentación. Proporciona el
campo eléctrico mediante dos electrodos,
uno positivo (ánodo) y otro negativo
(cátodo) entre los que se establece una
diferencia de potencial.
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• Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se
sitúan los electrodos.
• Soporte electroforético.
Fig. 1 Equipo electroforético. La cubeta tiene en sus extremos los
reservorios para el tampón de electroforesis. En el centro se aloja el
soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.
Tipos de soporte
Soportes no restrictivos tipo I
Tamaño de poro no opone impedimento al paso de
las moléculas. El agar es el ejemplo más
representativo y se obtiene a partir de algas marinas
y está formado por dos tipos de polisacáridos: la
agarosa y la agaropectina; ésta última posee varios
grupos cargados (grupos carboxilo y sulfato), lo
que la hacen inadecuada como soporte
electroforético por el efecto electro endosmótico
que produce. La agarosa (Fig. 2) se utiliza
ampliamente sobre todo para la separación de
ácidos nucleicos y para el análisis de proteínas. Los
diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su
punto de fusión (entre 35-95°C), su resistencia
física y el grado de electro endósmosis.
Fig. 2 Estructura química de la agarosa, polisacárido lineal formado por
la repetición de la estructura básica (agarobiosa), con un peso molecular
medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las
características de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la
naturaleza de los diferentes radicales
Soportes restrictivos tipo II
El tamaño de poro opone resistencia al paso de las
moléculas. El ejemplo característico son los geles
de poliacrilamida, que no sólo evitan la convección
y minimizan la difusión, sino que además
participan en el proceso de separación. Estos geles
son medios porosos en los que el tamaño de poro
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es similar al de las proteínas, de tal modo que existe
un efecto de tamizado molecular y la separación
electroforética depende de la densidad de carga de
las moléculas y de su tamaño.
Factores que afectan la electroforesis
El resultado de una electroforesis depende de
numerosos factores y es necesario conocerlos para
lograr la máxima resolución.
Campo eléctrico
Es un gradiente de potencial que posibilita que
haya electroforesis. A su vez, depende de diferentes
parámetros:
• Diferencia de potencial (V). Se mide en
voltios y es lo que define el campo
eléctrico. Cuanto mayor sea, mayor será la
velocidad de migración. Las electroforesis
se consideran de bajo voltaje si se realizan
entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto
voltaje si se realizan entre 500-10,000
voltios.
• Intensidad (I). Se mide en amperios y
cuantifica el flujo de carga eléctrica. Está
relacionada con la diferencia de potencial
por la Ley de Ohm: V=IR y para una
diferencia de potencial dada, su valor
(normalmente entre 5-50mA) viene
determinado por la resistencia del soporte,
por lo que, en última instancia, da cuenta
de la distancia recorrida por las moléculas.
• Resistencia (R). Se mide en ohmios y
cuanto mayor sea la resistencia del
soporte, menor será la movilidad
electroforética (ya que la intensidad ha de
ser menor para que se cumpla la Ley de
Ohm). Depende de la naturaleza del
soporte, sus dimensiones (anchura,
longitud y sección) y de la concentración
del tampón de electroforesis.
• Temperatura. Por el efecto Joule, el paso
de una corriente eléctrica produce calor, y
este efecto será tanto mayor cuanto mayor
sea la diferencia de potencial y la
resistencia del sistema. Debe controlarse
de forma estricta, puesto que puede afectar
a la muestra (desnaturalizándola), al
soporte e incluso al equipo electroforético.
Todo esto justifica, por sí solo, la
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necesidad de un sistema de refrigeración
en las cubetas de electroforesis.
Muestra
La movilidad electroforética de una molécula es
tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye
según aumenta su tamaño, ya que mayor es la
fricción de la molécula con el medio y menor es su
carga por unidad de superficie. Por esta razón, las
moléculas globulares se mueven con mayor
facilidad que las alongadas, ya que la esfera
presenta la mínima superficie a igualdad de
volumen. Así, moléculas del mismo tamaño y
carga, pero de diferente forma, pueden tener una
movilidad electroforética diferente y ser, por tanto,
separables mediante una electroforesis.
Tampón
Durante una electroforesis, se produce una
electrolisis del agua por acción del campo eléctrico,
lo cual genera protones en la proximidad del ánodo
e iones hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por
esta razón, esencial durante la electroforesis para
evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga
más básico, pero no debe afectar a las moléculas a
separar.
Además, la fuerza iónica condiciona la movilidad
electroforética de las substancias a separar, ya que
influye en su esfera de solvatación y en la
conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es
necesaria una fuerza iónica suficiente para
mantener el pH y la conductividad durante todo el
proceso, pero no muy elevada, ya que llegaría a
interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas
iónicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la
característica que debe ser más controlada, puesto
que determina la carga de la muestra.
Conviene señalar también que atendiendo a la
distribución del tampón, los sistemas se clasifican
en continuos cuando se emplea un único tampón en
el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al
menos, dos tampones de pH y composición
diferentes.
Soporte
La simple presencia del soporte en una
electroforesis hace que se presenten una serie de
fenómenos de elevada trascendencia para el
resultado del proceso:
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• Adsorción. Es una retención inespecífica
de las moléculas de la muestra sobre el
soporte, por lo que afecta negativamente a
la resolución, ensanchando las bandas de
migración.
• Electro endósmosis (EEO). Es un fenómeno que
se da en algunos soportes (sobre todo en los no
reductivos tipo I), en los que aparecen cargas
negativas, debido a grupos carboxilo o sulfato, al
estar en contacto con una disolución iónica. Al
aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas
se desplazan según su carga, pero en su migración
se encuentran con un flujo de cationes
desplazándose sobre la superficie del soporte y otro
de aniones haciéndolo por el centro de los poros
(Fig. 3). Este flujo orientado se llama flujo electro
endosmótico. El EEO va en contra de la resolución
de una electroforesis, ya que las bandas de la
muestra se ensanchan y se distorsionan; sin
embargo, la EEO contribuirá a una mejor
resolución en las inmunoelectroforesis y en la
electroforesis.
Fig. 3 Efecto electroendosmótico en la superficie de un soporte
cargado negativamente. Los aniones migran desplazándose por
el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la
superficie.
Tamizado molecular.
Es un efecto debido al mayor o menor reticulado
de los soportes; cuanto más tupida sea la red de
fibras, menores serán los poros. El movimiento de
las moléculas a través del soporte es más o menos
fácil en función de su tamaño respecto al de los
poros; aquellas moléculas cuyo tamaño se
aproxime al del poro, verá impedido su avance
respecto a aquellas cuyo tamaño sea muy inferior.
Por esta razón, el soporte actúa como un cedazo que
separa o tamiza las moléculas en función de su
tamaño.
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
La poliacrilamida es un soporte empleado
frecuentemente en electroforesis en gel, es
químicamente inerte, de propiedades uniformes,
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capaz de ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma, además, geles transparentes
con estabilidad mecánica, insolubles en agua,
relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante tiempo
prolongado. Además tiene la ventaja de que
variando la concentración de polímeros, se puede
modificar de manera controlada el tamaño del
poro.3
Formación del gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la
polimerización vinílica del monómero acrilamida y
del monómero entrecruzador N, N'-metilen-bis-
acrilamida (Fig. 4). La polimerización se inicia con
la formación de radicales libres del monómero, que
se producen por radicales libres de oxígeno, por
causa de la acción de iones per sulfato. Las aminas
terciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-di
amina (TEMED) se emplean como catalizadores de
esta reacción, porque causan la formación de
radicales libres del per sulfato. Esta reacción es
fuertemente inhibida por altos niveles de oxígeno,
por lo que la solución debe ser des gasificada para
lograr una formación de gel reproducible. Hay
muchos factores que desempeñan una función
importante en la separación electroforética, como
son pH, fuerza iónica, gradiente de potencial,
tiempo de corrida, concentraciones de acrilamida y
bis-acrilamida, etc. Las condiciones óptimas de una
buena separación, en la práctica se determinan
experimentalmente, con el análisis de cómo
influyen los diferentes factores en la electroforesis
en cuestión. La naturaleza de la muestra sirve de
guía para alcanzar las condiciones en la que se
deben obtener los mejores resultados.
Durante la polimerización del gel a temperaturas
inferiores a 17 ºC, la iniciación del control
catalítico y el tiempo de elongación de la cadena
comienzan a ser diferencialmente controlables.
Fig. 4 Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y
poliacrilamida
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La concentración de acrilamida (% T) representa el
porcentaje en peso del monómero total empleado
(acrilamida + entrecruzador en gramos por 100
mL) y determina la longitud promedio de la cadena
del polímero. La concentración de bis acrilamida
(% C) representa el porcentaje de este monómero
en el gel y determina el grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 %
T; 0,2-5 % C. Los factores que gobiernan la talla
del poro del gel son complicados, pero en general
el tamaño del poro disminuye con el incremento del
% T. Las proporciones en que ambas se encuentran
determinan las propiedades físicas del gel como su
densidad, elasticidad, resistencia mecánica y el
tamaño del poro. En general se recomiendan
valores de T de 5 a 15 % y de C de 2 a 4 %. Para
separar moléculas por tamaño, es necesario tomar
en cuenta la relación entre el poro efectivo del
medio y el tamaño de la molécula que se pretende
separar. Si el poro del medio es significativamente
mayor que la molécula, la separación
electroforética será sobre la base de diferencias de
carga y el tamizaje molecular será mínimo. Al
aplicar muestras biológicas en un gel con gradiente
de acrilamida, todas las macromoléculas
comienzan su migración a bajo porcentaje y en la
medida en que avanzan se encuentran con poros
más pequeños que retardan su movimiento. Las
moléculas menores comienzan a tener alta fricción
cuando los poros son más pequeños, mientras que
las grandes comienzan la fricción en los poros de
mayor tamaño.
Una modalidad de la electroforesis vertical es la
realizada con geles en gradiente en los que la
concentración de acrilamida (%T) aumenta
progresivamente desde la parte superior del gel
hasta la inferior, es decir, el tamaño de poro decrece
de forma inversa. Este gradiente de concentración
de acrilamida puede ser lineal o no (cóncavo, en
pasos, etc.), aunque los primeros son los más
utilizados. Con estos geles el intervalo de tamaños
de proteínas que pueden separarse se incrementa
considerablemente frente a los geles homogéneos y
presentan una mayor resolución. Además, las
moléculas de la parte delantera de la banda se
frenan más (encuentran antes los poros más
pequeños) que las moléculas de la parte trasera, con
lo que las bandas se estrechan, concentrándose
sobre su parte delantera, produciendo bandas muy
finas y con una gran resolución.
En la cubeta, el tampón del reservorio superior
cubre el gel y los pocillos en los que se ha de cargar
la muestra. Con el fin de que ésta, disuelta en el
mismo tampón, no difunda al depositarla en los
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pocillos, se le puede añadir un compuesto que
aumente su densidad (normalmente, glicerol o
sacarosa). El volumen de muestra que puede
aplicarse a cada pocillo depende del tamaño de la
propia muestra y del pocillo, pero oscila entre 10-
100µL con un máximo de 200µL. En el tampón de
la muestra, también se añade el marcador
electroforético (el más utilizado es el azul de bromo
fenol) para poder determinar el final del proceso.
Fig. 5 Preparación del gel para una electroforesis en placa. Elementos
para ensamblar el molde. Los espaciadores (sujetados con pinzas de
presión) colocados sobre los cristales forman el molde. Adición de la
solución de monómeros. Colocación del peine en la parte superior. El gel
formado presenta los pocillos donde aplicar la muestra. Las dimensiones
habituales de los geles son: 10-20 cm (L) x 10-15 cm (A) x 0.5-1.5 mm
(E).
Tipos de monómeros
La bis-acrilamida es el agente entrecruzador más
comúnmente empleado en este tipo de
electroforesis. O Gaal et al. (1984), plantearon que
la bis-acrilamida puede actuar como terminador de
la cadena en el proceso de polimerización y
concentraciones altas pueden disminuir el tamaño
de poro máximo de gel.
Se han reportado otros agentes entrecruzadores
como: la N, N´-diallitartar diamina (DATD) que da
un tamaño de poro mayor que el obtenido con bis-
acrilamida; la N, NC-bisacrililcistamina (BAC)
cuyo gel resultante se une por los grupos bisulfuro,
lo que hace que pueda disolverse en soluciones de
reactivos tiólicos yel N, N´-(1,2- dihidroxietileno)
bis-acrilamida o DHEBA forma geles de poros
altamente hidrofílicos.
Catalizadores empleados en la formación del gel
de poliacrilamida
La polimerización se lleva a cabo con la utilización
de sistemas catalíticos redox como por ejemplo: •
Per sulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED
como agente reductor. Per sulfato de amonio y 3-
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dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN). • Peróxido
de hidrógeno, sulfato de hierro y ácido ascórbico.
La polimerización no ocurre a bajo pH, ya que
requiere radicales de monómeros libres formados
por catálisis básica de radicales oxígeno del per
sulfato.
La foto polimerización con riboflavina no es
inhibida por el oxígeno; sin embargo, en ambos
casos el TEMED actúa como agente reductor suave
y acelera la polimerización.
Sistemas de tampón que se emplean en la
electroforesis en geles de poliacrilamida
La fuerza iónica (m) determina el potencial
electrocinético ya que reduce la carga neta de los
grupos con cargas efectivas. Se ha determinado que
la movilidad de las partículas cargadas es
inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la
fuerza iónica, a baja m se eleva la velocidad de
migración y es menor la difusión, de manera que la
zona de separación es más ancha y mayor la
resolución.1 Con el aumento de la m, se incrementa
el desprendimiento de calor y la evaporación. En la
electroforesis, los efectos de absorción de agua, no-
homogeneidad del material, intercambio iónico con
grupos cargados del soporte y electro endósmosis,
pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la
separación. La electro endósmosis generalmente
ocurre porque grupos cargados del soporte se
ionizan en soluciones tampón neutras o ácidas y los
contra iones libres hidratados.
(H 3O+) migran hacia el cátodo, esto provoca un
movimiento relativo del solvente respecto al
soporte sólido y que las moléculas no cargadas sean
transportadas hacia el cátodo a pesar de no tener
grupos ionizados.
La electroforesis en geles de poliacrilamida puede
realizarse en el rango de pH de 2 a 11, sin embargo
la desaminación de las proteínas o las reacciones
hidrolíticas pueden ser severas a valores de pH
inferiores a 3 y superiores de 10. La mayoría de las
proteínas con puntos isoeléctricos comprendidos
entre pH 4 y 7,5, son separadas en geles con pH
entre 8 y 9.
La fuerza iónica del sistema tampón debe
mantenerse a un nivel adecuado para garantizar la
solubilidad de la muestra y suficiente capacidad
amortiguadora. Es usual utilizar concentraciones
de tampón en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L,
pero pueden emplearse concentraciones sobre 0,5
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mol/L en sistemas fuertemente ácidos, pues a bajos
valores de pH muchos ácidos débiles (que son los
más empleados) están débilmente ionizados y es
necesaria una alta concentración para obtener la
adecuada capacidad amortiguadora.
PAGE-SDS
Permite el cálculo de parámetros moleculares (al
contrario que el resto de los tipos de electroforesis),
pues los complejos SDS-proteína se separan
estrictamente según su tamaño molecular. El SDS
interacciona con las proteínas formando complejos
de características comunes independientemente de
las de cada proteína.
Las proteínas unen una molécula de SDS por cada
dos aminoácidos, lo que implica que las cargas
propias de las proteínas quedan enmascaradas o
anuladas; asimismo, la molécula de SDS
proporciona una carga negativa, por lo que los
complejos SDS-proteína están cargados
negativamente de forma uniforme (la carga por
unidad de masa es prácticamente constante para
todos los complejos).
Como ya se ha comentado, la movilidad
electroforética en una PAGE es función del tamaño
y de la carga por unidad de masa; como ésta es
constante para todos los complejos SDS-proteína
(que, además, tienen la misma forma elipsoide),
esta movilidad es solamente función de la masa
molecular, es decir, cuanto menor sea la masa
molecular de la proteína, mayor será la movilidad
de la misma y viceversa. En resumen, la SDS-
PAGE es la electroforesis más utilizada para el
análisis de proteínas debido a:
• La gran mayoría de las proteínas son
solubles en SDS.
• Todos los complejos SDS-proteína
tienen carga negativa y migran,
por lo tanto, en el mismo sentido.
• Su densidad de carga es muy elevada,
por lo que su velocidad de
migración también lo es y las
electroforesis son muy rápidas.
• La separación depende de un parámetro
físico-químico, como es la masa
molecular, que se puede calcular.
• Los complejos SDS-proteína se tiñen
fácilmente.
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La preparación de la muestra es de la máxima
importancia para asegurar que todo lo comentado
anteriormente se cumple. Al tampón en el que va
disuelta la muestra (Tris HCl; 0.05M, pH = 6.8) se
añade un exceso de SDS (2% p/v); para facilitar la
unión del SDS a las proteínas, la muestra se calienta
a 100°C durante al menos 3-5 minutos y,
opcionalmente, se añade ß-ME (5% v/v) o DTT (20
mM) si se requieren condiciones reductoras. Para
incrementar la densidad de la disolución de la
muestra, se añade glicerol o sacarosa al 10% (p/v)
y como marcador azul de bromo fenol al 0.001%
(p/v). La cantidad de muestra que se añade depende
de la sensibilidad de la tinción posterior que se vaya
a utilizar, pero como regla general y para geles de
20×20 cm de 1.5mm de espesor y tinción con azul
de Coomassie, se suele añadir entre 1-10µg de
muestra (más de 100µg de proteína supone una
sobrecarga del gel).
El SDS debe incluirse en el tampón de los
reservorios, en los de los geles (de concentración y
de resolución) y en el de la muestra para mantener
las condiciones desnaturalizantes. La PAGE-SDS
puede realizarse en condiciones reductoras o no
reductoras; la ausencia de reductores se traduce en
que si las proteínas poseen puentes disulfuro, el
SDS sólo producirá una desorganización parcial de
la estructura (Fig. 15). Si son dos o más las cadenas
unidas por puentes disulfuro intercatenarios, en
presencia de SDS, quedarán más o menos
desplegados en función de la posición de los
puentes disulfuros (Fig. 6).
Fig. 6 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforética de proteínas
monoméricas. En una proteína nativa de 25 kDa, carente de puentes disulfuro, el
tratamiento con SDS ( ) ó SDS+DTT ( ) producen idéntico resultado. La proteína con
un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se desnaturaliza
parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El
tratamiento con SDS+DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total
de la proteína.
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Una vez finalizada la PAGE, se separa el gel de las
placas de vidrio haciendo palanca con una espátula
y se visualiza con un colorante; el más utilizado es
el azul de Coomassie con el que se pueden
visualizar 0.1-0.5 µg de proteína por banda. Otro
método de tinción es con sales de plata, que tiene
como principal ventaja su elevada sensibilidad
(hasta 0.1ng de proteína por banda), aunque tiene
como desventajas que es muy laboriosa y cara,
presenta elevado background, baja
reproducibilidad, algunas proteínas no se tiñen y,
sobre todo, no es totalmente específico de
proteínas, ya que algunos lipopolisacáridos, ácidos
nucleicos y polisacáridos también se tiñen.
Una vez teñido el gel de poliacrilamida, la imagen
que se obtiene es un conjunto de bandas coloreadas
sobre un soporte transparente. Su análisis permite
identificar el número mínimo de componentes
(bandas) de cada muestra. Cada banda se
caracteriza por su movilidad electroforética relativa
(“Ur”).
Ur = Lmuestra/Lmarcador
Donde:
Lmuestra = Longitud recorrida
por la muestra
Lmarcador = Longitud recorrida
por el marcador
Es importante señalar que la relación lineal entre
logM y Ur se mantiene para una concentración
dada de poliacrilamida (%T) y sólo en un corto
intervalo de peso molecular. De forma general, en
geles del 15%T la relación lineal es válida para
proteínas comprendidas entre 12 y 45 kDa; en geles
del 10%T, el intervalo lineal va entre 15 y 70 kDa,
y en los del 5%T, entre 25 y 200 kDa. Hay
proteínas con un comportamiento anómalo en
SDS-PAGE; en las glicoproteínas y las
lipoproteínas, que llevan unidos azúcares o lípidos,
la parte no proteica no une SDS y puede impedir el
acceso del mismo a la proteína. Por ello, las
glicoproteínas y lipoproteínas unen menos SDS
que la mayoría de las proteínas; esto hace que la
relación carga/tamaño sea menor y, por lo tanto,
tengan menor movilidad electroforética y se
comporten como si tuvieran mayor tamaño.
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PLANTEAMIENTO DEL PRBLEMA RESULTADOS

Separación de proteínas en una muestra mediante

la técnica de electroforesis

OBJETIVOS

General

Separar proteínas en una muestra mediante

electroforesis

Específicos

 Elaboración de gel de Poliacrilamida

 Preparación de los reactivos necesarios
para la elaboración de poliacrilamida 4 3 2 1
 Tratamiento de la muestra
 Correr electroforesis

METODO ANALISIS DE RESULTADOS

Se puede observar patrones muy similares en las

muestras 1 y 2 (de derecha a izquierda), en donde
es muy evidente 3 agrupaciones en el primer grupo
de corrida se manifiestan 4 franjas que indican la
presencia de proteínas muy pesadas, las más
pesadas de la muestra analizada, el siguiente grupo
el intermedio muestra en su agrupación dos franjas
de intensidad media y gruesas, lo que nos indica la
presencia de proteínas con un punto isoeléctrico y
peso molecular muy similares entre sí; el último
grupo contra de dos franjas muy bien marcadas la
superior es la ms gruesa indicando la presencia de
proteínas de punto isoeléctrico y peso molecular
similares y es en donde se presenta el mayor
número de proteínas de la muestra, la última franja
presenta una intensidad muy marcada pero es más
delgada indicando una baja densidad de proteínas
presentes en la muestra con un punto isoeléctrico
similares y las más pesadas de la muestra.
en estas dos franjas se puede observar un espectro
en la corrida de la muestra esto se debe a que la
muestra no se preparó de la mejor manera, es difícil
identificar la falla dado que es un procedimiento
muy extenso pero lo más probable es que el SDS
estuviera mal preparado impidiendo la
generalización de la carga negativa en toda la
muestra y adicional a esto no presento una buena
desnaturalización ya era a la cantidad de S o al
tiempo de exposición, este mismo error es evidente
en las franjas 3 y 4.
En las franjas 3 y 4 se puede observar el mismo
patrón de corrida entre ellas por lo que se puede
decir que en estas dos franjas la muestra fue la
misma siendo la antepenúltima franja la más densa

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la más intensa, por lo que es donde mayor número
de proteínas del mismo punto isoeléctrico y peso
molecular está presente de la muestra
CONCLUSIONES
La tecnicina cromatografía de electroforesis es un
método analítico muy sensible que nos permite la
separación de muestras complejas; es un método
sensible que tiene sus deficiencias, debido a que
existen demasiadas posibilidades de cometer algún
tipo de error en la preparación en alguno de sus
múltiples componentes, el soporte, el buffer, la
muestra, , etc. esta sometida a múltiples variaciones
que pueden interferir en la interpretación de los
resultados.
Se pudo observar de una buena forma la corrida de
la muestra en el gel de poliacrilamida, y se puede
inferir que tanto la preparación del soporte como de
todos los reactivos, que implican su preparación se
elaboraron de manera correcta, así como la
preparación de la muestra que se analizó.
La muestra de los pasillos 1 y 2 contienen una
diversa presencia de proteínas 4 son de puntos
isoeléctricos y pesos moleculares altos muy
similares, en baja concentración, se observan en la
parte superior, 2 mas son de peso molecular y punto
isoeléctrico similares pero mas altos que las
primeras 4, se observan en la parte inermedia de
ambos carriles. y finalmente existe una alta
concentración de proteínas de punto isoeléctrico y
peso molecular muy alto, se observa en la parte
inferior del carril.
las muestras de los posillos 3 y 4 contenía una gran
concentracion de proteínas con puntos isoeléctricos
y pesos moleculares bajos, las bandas están muy
…Areli
….Sebas
…Lolo
…Antonio
Escuela de Ciencias de la Salud
bien marcadas, se observaron en la parte inferior de
gel.
REFERENCIAS
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