GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTENAS.

El mtodo de purificacin debe disearse desde un principio teniendo en cuenta la

cantidad de protena que se requiere. Hay etapas de purificacin que se pueden
aumentar de escala fcilmente y otras en que no es posible hacerlo.
El grado de pureza necesario depender del uso que se va a dar a la protena. Para
usos en investigacin, la escala es reducida y es mas importante la pureza que el
rendimiento. Para usos teraputicos la escala es mayor y la pureza requerida es
mxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo
costo y pureza menor.
Si el inters est en la protena y no importa el organismo de origen, conviene
buscar una fuente fcil de obtener, barata, que contenga esa protena en
abundancia. Si existe la posibilidad de partir de organismos enteros o de clulas en
cultivo, esto ltimo es en general preferible. Lo ptimo es producir la protena por
mtodos de DNA recombinante.
Dependiendo de la finalidad, la protena debe ser obtenida en estado nativo o puede
estar desnaturalizada. Para actividad biolgica, debe estar nativa; para determinar
estructura primaria, puede estar desnaturalizada.

Se debe seleccionar un mtodo de determinacin especfico de la protena

en cuestin (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima; unin de ligando a un
receptor; unin de un anticuerpo especfico en un RIA) y un mtodo de
determinacin de la protena total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la
determinacin de protena por anlisis de aminocidos o por peso seco, todos los
dems mtodos son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la
propia protena en estudio. Entre estos mtodos se pueden mencionar 1)
espectrofotometra en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unin peptdica); Biuret
(Cu2+ alcalino); Lowry (Cu2+ alcalino + reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford
(Coomassie Blue); unin de Ag.
La actividad especfica (AE) es igual a la relacin entre la cantidad de
protena que se purifica sobre la cantidad de protena total.
El grado de purificacin es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE
en la etapa 1 (la purificacin global, AE final sobre AE inicial)
Se debe utilizar un mtodo adecuado para juzgar la pureza de la protena
obtenida; actualmente se utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente,
bidimensional. En otras pocas, se utiliz la ultracentrifugacin analtica.
Se debe evitar la protelisis de la protena en estudio durante su
purificacin, utilizando ccteles de inhibidores de proteasas, y trabajando tan
rpido como sea posible y en fro, para minimizar su accin.

Purificacion step

Cell-free extract
ConA-Sepharo se
Mono Q
Mono P

Total
Protein

Total
activity

Specific
Activity

Yield

Purification
factor

mg

unitsa

unitsa/mg

Fold

227.5
5.6
0.67
0.36

56.00
43.75
25.95
14.70

0.246
7.81
38.73
40.83

100
78.1
46.34
26.25

1
31.75
157.44
165.97

ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACION

1) Separacin de las clulas.
2) Si la protena es intracelular, ruptura celular y separacin de restos.
3) Concentracin.
4) Aislamiento primario.
5) Purificacin de alta resolucin.
6) Pulido del producto final.

Problemas a ser resueltos para disear el proceso:

1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoqumicos.
2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada.
3) Disear una secuencia de etapas ptima, con el menor nmero de etapas
posible, lo que aumentar el rendimiento final.
4) Minimizar la desnaturalizacin y efectos de superficie; evitar agregacin:
minimizar la degradacin; cuidar la limpieza y desinfeccin del equipo usado.

METODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL

A menos que se trate de una protena extracelular, liberada al medio, las
clulas o tejidos deben romperse para extraer la protena de inters. Esta
ruptura debe ser slo la necesaria, no excesiva, para evitar la extraccin
intil de protenas contaminantes.
Los distintos tipos de clulas tienen diferente susceptibilidad a la ruptura.
Las clulas animales son muy fciles de romper, pues carecen de pared.
Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su gran tamao
las hace vulnerables a la ruptura mecnica. Las clulas bacterianas son
ms resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram positivas o
Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de las
primeras, las hace mucho mas sensibles a mtodos suaves, como la
digestin con lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los
ms resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienen
hasta 80 - 90 % de polisacrido (quitina y glicanos en hongos, manano y
glucano en levaduras), adems de lpidos y protenas.

ALGUNOS METODOS DE RUPTURA DE CELULAS

1) Mortereado con arena, almina, bolitas de vidrio, carburo de silicio.
2) Molinos de ruptura, por agitacin con abrasivos.
3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas.
4) Sonicacin.
5) Congelacin y descongelacin.
6) Extrusin de lquido o slido (material congelado)
7) Descompresin explosiva.
8) Enzimas lticas, seguido por shock osmtico o tratamiento mecnico.
9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno).
10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la protena.

METODOS DE SEPARACION Y CONCENTRACION

Remocin de agua y molculas pequeas por
1) Agregado de un polmero seco on poros muy pequeos como para
que la protena penetre (Sephadex G-25).
2) Remocin a travs de una membrana semipermeable
(ultrafiltracin). Celdas filtrantes. Dilisis contra polietilenglicol.
Dilisis en vaco.
3) Remocin de agua en vaco: liofilizacin. Buffers voltiles,
como el bicarbonato de amonio.
Cambios de buffer:
1) Dilisis. 2) Filtracin por gel; 3) Diafiltracin.
Purificacin por ultrafiltracin.

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PURIFICACIN Y CONCENTRACION POR PRECIPITACION

1) Precipitacion por aumento de la fuerza inica (salting-out):
Series de Hoffmeister. Sulfato de amonio.
2) Precipitacin por disminucin de la fuerza inica (salting-in)
3) Precipitacin por alteracin del pH (mnima solubilidad en el pI).
4) Precipitacin por solventes orgnicos (etanol, acetona), que
disminuyen la constante dielctrica de la solucin y por ello su poder
de solvatacin.
5) Desnaturalizacin de impurezas por altas temperaturas, extremos
de pH, solventes orgnicos.

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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtencin de un extracto libre de clulas.
2)Precipitacin (sales, pH, alta temperatura, solventes orgnicos).
3)Dilisis o ultrafiltracin. Concentracin.
4)Fraccionamiento cromatogrfico.
Principio de separacin
Forma y tamao
Carga neta
Punto isoelctrico
Hidrofobicidad

Funcin biolgica
Antigenicidad
Contenido en carbohidrato
Grupos sulfhidrilos libres
Capacidad de ligar metales

Tipo de cromatografa
Filtracin por gel
Cromatografa de intercambio inico.
Cromatoenfocado
Cromatografa de interaccin
hidrofbica
Cromatografa en fase reversa
Cromatografa de afinidad
Inmunoadsorcin
Cromatografa con lectinas
inmobilizadas
Cromatografa covalente
Cromatografa de quelatos metlicos

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CROMATOGRAFIA
Separacin diferencial de los componentes de una muestra entre una fase
mvil y una fase estacionaria.
La fase mvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se
eluyen las protenas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).
La fase estacionaria comprende las partculas, en general esfricas, con que
se llena la columna. Estas partculas estn formadas por una matriz y, en
la mayora de los casos, molculas de menor o mayor tamao con las que se
la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos
cromatogrficos.
La matriz es el sustrato slido de la fase estacionaria. Las ms comunes son
celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.
Deben tener buena estabilidad mecnica y qumica, alta capacidad, tamao
y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las
interacciones no especficas, y tamao de partcula adecuado al flujo de
solvente deseado y a la presin operativa.

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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Segn la presin a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:
1.

Corridas a presin normal (LPLC, low-pressure liquid

chromatography). Presin inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de
escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano.

2.

Corridas a presin intermedia (MPLC, medium-pressure liquid

chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid
chromatography). Presin entre 6 y 50 bar. Requiere matrices mas
rgidas. Permite flujos mayores.

3.

Corridas a alta presin (HPLC, high-pressure - o high-performance liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere
matrices de rigidez alta, partculas pequeas y columnas y tuberas de
material altamente resistente a la presin, como el acero inoxidable o
el titanio.

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CARACTERISTICAS TIPICAS DE LPLC Y HPLC.

Caracterstica

LPLC

Tamao de partcula ()

100

Flujo (ml.cm-2.h-1)

10 - 30

Presin de trabajo (bar)

<5

> 50

Tiempo de separacin (hs.)

Hasta 24

1-3

Volumen de muestra

ml - litro

l - ml

Etapa de purificacin

Variable

En general tarda

Buena

Excelente

Resolucin
Dificultades

HPLC
10
100 - 300

Largo tiempo,

Alto costo de equipo,

cmara fra

Posible desnaturalizacin
por presin.

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OTRAS CONSIDERACIONES GENERALES.

El tamao de la columna a utilizar depender del procedimiento
cromatogrfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar.
La aplicacin de la muestra a la columna se hace generalmente a travs de
un loop, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerse
aplicacin manual.
La elucin de las protenas introducidas en la columna puede hacerse sin
cambiar la composicin de la fase mvil (elucin isocrtica) o
cambiandola, por etapas o continuamente (gradientes).
Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada,
dejandola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no
se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agente
conservador, como el etanol al 20 % o la azida sdica, para evitar el
crecimiento de microorganismos.

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METODOS CROMATOGRAFICOS BASADOS EN LA CARGA

DE LA PROTEINA.
Todas las protenas contienen residuos cargados, positiva o
negativamente, y su balance a un determinado valor de pH da
la carga neta de la molcula a ese pH. El valor de pH en el
que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de
la molcula es 0, es el punto isoelctrico de la protena.
Los mtodos cromatogrficos basados en la carga son dos:
1) La cromatografa de intercambio inico.
2) El cromatoenfocado.

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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

La mayora de las protenas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pI
la carga neta de la protena es negativa, y por debajo es positiva.
El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargados
positivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por eso
intercambiadores aninicos, como DEAE-celulosa) o negativamente
(intercambiadores catinicos, como CM-celulosa).
La adsorcin puede hacerse en batch o en columna. Las protenas migrarn
(en condiciones isocrticas) en base a su carga neta a ese determinado pH. Si
se trabaja a un valor de pH tal que muchas protenas se adsorben, la elucin
se har cambiando el pH o aumentando la fuerza inica del buffer.
Los intercambiadores pueden ser dbiles (utilizables cuando la protena tiene
carga elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usar
intercambiadores fuertes para protenas muy cargadas a ese pH, pues la
interaccin ser muy fuerte y la elucin ms dificil.
La regeneracin de la columna se hace con alta fuerza inica (ClNa 1 M,p.ej.).

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GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN

PURIFICACION DE PROTEINAS.
Frmula

Nombre

Abreviatura

Aninico fuerte
- CH2N+(CH3)3
- C2H4N+(C2H5)3

Trimetilaminometil
Trietilaminoetil

TAM TEAE -

Aninico dbil
- C2H4N+H3
- C2H4N+(C2H5)2

Aminoetil

AE -

Dietilaminoetil

DEAE -

Sulfo

S-

Sulfometil

SM -

Carboxi metil

CM -

Catinico fuerte
- SO3- CH2 SO3Catinico dbil
- CH2 - COO-

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI

POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANINICO)

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CROMATOENFOCADO
El cromatoenfocado puede ser considerado como una extensin del
isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografa de intercambio inico.
En IEF las protenas se separan por electroforesis en un gradiente de pH; se
aplica en electroforesis bidimensional.
En cromatografa de intercambio inico se puede eluir con un gradiente de
pH, que se forma fuera de la columna.
En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclando
una matriz de intercambio aninico pre-ajustada a un valor de pH, con un
buffer de pH ms bajo.
La protena al descender en la columna encontrar valores crecientes de pH;
cuando llegue a su pI se volver electronegativa, y se unir a la matriz
positivamente cargada.
Como el buffer sigue corriendo, la protena se
separar y unir sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida
(enfocada) al pH correspondiente a su pI.

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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI

POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)

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PURIFICACION BASADA EN LA HIDROFOBICIDAD

La llamada originalmente cromatografa de particin utilizaba una fase
estacionaria polar y una fase mvil orgnica.
La cromatografa en fase reversa se denomina de ese modo porque utiliza
una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. La fase estacionaria
est en general formada por cadenas alifticas de hasta C18 unidas a una
matriz de silica. La fase mvil es un solvente polar como metanol,
propanol, etanol o acetonitrilo.
Estas condiciones pueden causar la
desnaturalizacin de muchas protenas . Por ello se las utiliza en general en
HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar protenas y pptidos
para su secuenciacin. Se usan contraiones como el cido trifluoroactico
para asociarse con grupos cargados en la protena y aumentar su
hidrofobicidad.
Para purificar protenas en estado nativo se utilizan condiciones mas suaves,
en la llamada cromatografa de interaccin hidrofbica. Se utiliza en
general octil-Sepharosa o fenil-Sepharosa; la adsorcin de las protenas se
hace en general a alta fuerza inica, y la elucin disminuyndola, y, si es
necesario, agregando un solvente como propanol o butanol.

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CROMATOGRAFIA COVALENTE
A pH 8, reaccionan la mayor parte de las protenas que contienen Cys-SH; a pH 4,
slo las que tienen Cys residuos con un pKa muy bajo, como la papana.
La columna se regenera con 2,2-dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm

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CROMATOGRAFIA DE QUELATOS METALICOS (IMAC)

La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el cido
iminodiactico.
Se carga la columna con un in adecuado, que puede ser Zn2+, Ni2+, Cu2+,
Co2+. La protena se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de
His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando el pH a 4 - 6, o
compitiendo con imidazol.
Esta tcnica es muy usada actualmente para purificar protenas
recombinantes, expresandolas como fusiones con un tag de poly-His (en
general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Se
eluyen con imidazol.
Si todo funciona bien, se puede tener protena recombinante pura en un solo
paso de purificacin. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co2+ pueden
catalizar la oxidacin de grupos en la protena, en especial de -SH.
Luego de la purificacin la columna se regenera con un quelante como
EDTA, y para reutilizarla se la debe volver a cargar con metal.

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Se basa en que todas las protenas tienen sitios de unin para algn ligando, ya
sea una molcula pequea (p.ej.: un anlogo del sustrato de una enzima, una
hormona para un receptor) u otra protena (p-ej.: la Concanavalina A para unir
glicoprotenas de alta manosa, o anticuerpos especficos para ligar sus antgenos).
El ligando elegido para la protena que se desea purificar debe inmovilizarse
sobre una matriz adecuada.
La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas
con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADPdependientes). La afinidad de la protena por el ligando debe ser moderada (KL
entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unin y una disociacin ulterior del
complejo en condiciones no desnaturalizantes.
Para desarrollar el material para cromatografa de afinidad, primero hay que
activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material
debera ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilizacin.
Se pueden expresar protenas recombinantes como fusiones que permiten aplicar
cromatografa de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltosebinding protein (MBP) y maltosa-agarosa).

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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE

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CRUZIPAINA

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FILTRACION POR GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

MOLECULAR, O DE TAMIZADO MOLECULAR)
El material cromatogrfico es un gel en partculas esfricas, de porosidad controlada, sin
derivatizaciones. La separacin de las protenas se hace en base a la forma y la masa de la
protena. La elucin es isocrtica. Las protenas que no penetran en absoluto en los poros
del gel son las que salen primero (en el llamado volumen de exclusin o volumen vaco, Vo).
Las dems molculas en la muestra se separan, saliendo ltimas las que penetran por
completo en las particulas de gel. Se usa en general fuerza inica alta, para minimizar las
interacciones de las protenas entre si, y de las protenas con la matriz (en este ltimo caso,
no relacionadas con el tamao de poro).
Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de
agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y
tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb).
En la filtracin por gel es crtica la relacin entre el volumen de muestra y el volumen de la
columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una tcnica que no se puede
aumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de protenas, se admite
hasta un 25 - 30 % del Vt.
Aplicaciones: Purificacin de protenas - Desalado - Determinacin de pesos moleculares
de protenas nativas - Determinacin de constantes de equilibrio de unin (binding).

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Purificacion step

Cell-free extract
ConA-Sepharose
Mono Q
Mono P

Total
Protein

Total
activity

Specific
Activity

Yield

Purification
factor

mg

unitsa

unitsa/mg

Fold

227.5
5.6
0.67
0.36

56.00
43.75
25.95
14.70

0.246
7.81
38.73
40.83

100
78.1
46.34
26.25

1
31.75
157.44
165.97

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PURIFICACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA.

Protenas integrales y Protenas perifricas

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PROTEINAS INTEGRALES

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Para purificar proteinas de membrana, lo mejor es empezar purificando

la membrana. La solubilizacin de las protenas depender de que se
trate de protenas integrales o perifricas.
Protenas perifricas: Buffer con EDTA 0.1 - 1 mM, o alta fuerza inica,
hasta 1 M ClNa o ClK. En algunos casos se requieren condiciones ms
drsticas(urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M). Incluir inhibidores
de proteasas.
Proteinas integrales: Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden
ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con
fosfolipasas o proteasas, segn de qu ancla se trate. Las de Clase I se
extraen por delipidacin con solventes orgnicos, agentes caotrpicos o
detergentes.
Detergentes: Molculas anfiflicas, relativamente pequeas. Por encima
de la concentracin micelar crtica las molculas coalescen a travs de su
parte hidrofbica para formar micelas, en equilibrio con el monmero.

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Cuando se agrega un detergente a una membrana, se particiona

dentro de la bicapa hasta que esta se hace inestable y se desintegra.
Los lpidos forman en general micelas mixtas con el detergente, en
tanto que las protenas hidrofbicas se cubren con una monocapa
del mismo.
Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedad
de ser miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a
20 - 25oC. Las protenas integrales, solubilizadas a baja
temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a 20 25oC.
Existe una variedad considerable de detergentes empleados en
purificacin de protenas de membrana. Pueden ser detergentes
inicos, como el SDS o el CTAB, o no inicos, como la digitonina,
el octilglucsido, el Lubrol, el Triton, y otros.

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PURIFICACION DE LAS PROTEINAS SOLUBILIZADAS.

Las protenas perifricas (o los fragmentos hidroflicos de protenas
integrales) en general se purifican por los mismos mtodos que los
usados para las solubles. Las protenas integrales presentan
problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de
detergentes o solventes orgnicos.
La filtracin por gel puede aplicarse; prcticamente todos los
materiales para esta tcnica pueden usarse en presencia de detergentes
o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (politeres hidroxilados,
dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgnicos. La
cromatografa de intercambio inico y el cromatoenfocado pueden
utilizarse, en presencia de detergentes no inicos. La cromatografa
en fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra
solubilizada en cido frmico al 50 - 70 % en agua. La cromatografa
de afinidad es aplicable en general, requiriendose a veces resinas de
altas porosidad y brazos espaciadores largos.

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PURIFICACION DE PROTEINAS PARA USO TERAPEUTICO.

Lo que se requiere en este caso es la mxima pureza. Por lo dems, los
mtodos usados son como para cualquier protena soluble. La fuente
pueden ser tejidos o sueros animales, sistemas de expresin
procariticos y eucariticos, o hibridomas.
El nivel aceptable de contaminantes se relaciona con la frecuencia de
administracin de la protena, y est regulado por las autoridades
sanitarias. La significacin clnica de los contaminantes es variable: 1)
Antigenicidad: puede dar origen a reacciones de hipersensibilidad. 2)
Transformacin por DNA. 3) Enfermedades transmisibles (virus,
priones). 4) Pirogenicidad por lipopolisacridos de pared bacteriana.
Para insulina, se considera que el nivel de contaminantes por debajo
del cual no se producen anticuerpos es de 10 ppm. Para DNA se
pueden considerar aceptables valores de 10 pg por dosis. Para virus y
priones, ausencia completa.

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Se requieren, por lo tanto, mtodos muy sensibles para la deteccin

de contaminantes. Para contaminantes proteicos, lo mas usados son
los mtodos inmunolgicos. Tambien puede usarse tincin con Ag.
El lmite de sensibilidad es del orden de 5 ppm por inmunoensayo, 25
- 50 ppm por Western blot y de 200 - 400 ppm por tincin con plata.
Para DNA contaminante, se usan tcnicas de hibridizacin. Para
deteccin de virus, hibridizaciones y PCR con oligonucletidos
adecuados. Para endotoxinas bacterianas, gelificacin de lisado de
amebocitos de Limulus polyphemus.
OTRAS APLICACIONES ESPECIALES:
1) SECUENCIACION: Evitar el bloqueo del N-terminal (usar urea
libre de cianato). Usar RP-HPLC o SDS-PAGE y electrotransferencia
para la purificacin final.

2) CRISTALOGRAFIA: La pureza debe ser alta, pero sobre todo

deben evitarse las microheterogeneidades de la propia protena a
cristalizar (en especial la protena desnaturalizada). Es bueno terminar la
purificacion con cromatografa de afinidad.

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PURIFICACION DE PROTEINAS EN GRAN ESCALA.

La escala de produccin de protenas y pptidos por la industria biotecnolgica
es de gramos a kilogramos, y utiliza columnas cromatogrficas en un rango de
volumen de litros a miles de litros.
El aumento de escala es un problema de ingeniera e involucra consideraciones
que no estn asociadas con ciencia pura, como se la considera en el laboratorio.
La operacin en escala pequea busca obtener cantidades limitadas de
protena, con mucha atencin de personal altamente capacitado. En la
operacin a gran escala, se debe minimizar el costo y aumentar al mximo el
rendimiento. Esto implica minimizar la intervencin humana, sobre todo de
cientficos calificados. El proceso debe ser tan sencillo como sea posible. Las
etapas innecesarias son antieconmicas, bajan el rendimieto y multiplican los
problemas. Si el proceso de laboratorio est destinado desde un comienzo a una
aplicacin industrial, el mtodo de purificacin debe ser diseado desde el
principio con miras a su aplicacin en gran escala. Hay etapas de purificacin
que pueden llevarse a una escala industrial y otras que no.
La industria biotecnolgica es extremadamente competitiva, y el factor tiempo
es crtico.

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El manejo de soluciones de protenas en gran escala implica una serie de

problemas tcnicos, como evitar la formacin masiva de espuma (que causa
desnaturalizacin) en el bombeo de las soluciones, necesario para transferirlas
entre etapas, evitar la agregacin de las protenas al aumentar su concentracin,
y evitar escrupulosamente la contaminacin microbiana, que lleva a
degradacin.
Las operaciones a realizar son como en cualquier purificacin en escala normal,
pero con caractersticas especiales.
Separacin de slidos: Se pueden utilizar centrfugas industriales o filtracin.
Las centrfugas de alta velocidad requieren refrigeracin, y contencin
adecuada para evitar la formacin de aerosoles contaminantes del medio
ambiente. El costo aumenta a medida que disminuye el tamao de las partculas
a separar. Los filtros pueden ser los llamados filtros profundos (tierra silcea, 5
a 10 cm de espesor) o membranas (microfiltracin). Los problemas ms
importantes son la floculacin de las protenas, su unin a las membranas y la
desnaturalizacin.

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Ruptura celular: las tcnicas ms aplicables a gran escala son el

homogeneizador y el molino con bolitas de vidrio. Homogenizador: la
suspensin (15 - 20 % de peso seco) es forzada a alta presin a travs de
una vlvula estrecha; es el mtodo mas usado, pero no sirve para
microorganismos filamentosos. Puede procesar hasta 6000 litros/hora.
Los molinos usan como abrasivo bolitas de vidrio, de 0.3 - 0.4 mm de
dimetro. Sirve para microorganismos filamentosos. Acepta 30 - 60 % de
clulas, peso hmedo, en suspensin y procesa hasta 2000 litros/hora.
Tambien puede utilizarse en ciertos casos lisis enzimtica (lisozima, por
ejemplo) o qumica (tolueno, detergentes como SDS o Triton X-100,
agentes caotrpicos como guanidina o urea).

Operaciones primarias de separacin: Incluyen la concentracin, que se

puede hacer por ultrafiltracin o por precipitacin, con sales o solventes
orgnicos. La remocin de cidos nucleicos puede hacerse con nucleasas, o
agentes precipitantes, como la polietilenimina, polmero catinico de peso
molecular 24 kDa. Esta precipitacin remueve adems los restos celulares
(cell debris).

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Operaciones de purificacin de protenas: Se debe buscar un mnimo de

etapas, para disminuir los costos y aumentar el rendimiento. En general,
una etapa preparativa (que debe dar un alto rendimiento, aunque no
purifique mucho, y puede ser una precipitacin salina); una etapa de alta
resolucin, que debe dar un producto altamente purificado, por ejemplo
cromatografa de intercambio inico o de afinidad, o cromatoenfocado; y
una etapa final, de pulido del producto, para eliminar los ltimos
contaminantes; a esta altura de la purificacin, puede emplearse
filtracin por gel. Es lo ms frecuente que el aumento de escala en los
mtodos cromatogrficos se obtenga aumentando el radio de la columna y
manteniendo, o aumentando poco, su altura. Pero esto depender,
naturalmente, del tipo de cromatografa que se use.
Existen columnas con volmenes totales de hasta 2500 litros, con dimetro
de 2 metros y alturas ajustables, hasta alrededor de 80 cm. La elucin
isocrtica es ms frecuente que el uso de gradientes, para simplificar la
operacin.
Se pueden emplear columnas radiales, que constituyen un concepto nuevo
en el campo de la cromatografa en columna.

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Cromatografia de flujo radial.

La muestra se distribuye del encabezamiento

de la columna (6) al canal anular externo (1); de alli difunde a travs de la pared
porosa (5), a travs del material cromatogrfico, pasa luego a travs de la pared
porosa interna (4)y llega al canal interno (2) de donde pasa al colector.

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