UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA – MICROBIOLOGÍA

INFORME DE PRÁCTICA N° 02

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN PLASMÍDICO

CURSO : Genética Microbiana

DOCENTE : MSc. Rosa María Liñán Abanto

ALUMNA : María Ruiz Cerna

CODIGO : 2018-118003

TACNA – PERÚ

2022
 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN PLASMÍDICO

I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias pueden contener información genética adicional en forma de plásmidos.

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico que se replican de forma

autónoma, es decir, son independientes del cromosoma, se replican a partir de su

propio origen de replicación. La información genética que portan los plásmidos no es

generalmente vital para la supervivencia celular. Sin embargo, en algunos casos

pueden ser portadores de genes de resistencia a antibióticos lo cual los hace

imprescindibles para la bacteria.

La purificación de ADN plasmídico es la base para la biotecnología y clonación

molecular. En general, todos los métodos incluyen tres pasos importantes: (i)

Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plásmido.

(ii) Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido. (iii) Purificación del DNA

plasmídico.

La lisis alcalino es uno de los métodos que más se utiliza para la extracción de ADN

plasmídico, por ser simple, de bajo costo y reproducible. Además, permite aprovechar

las diferencias en el tamaño y la superhelicidad que es el grado de torsión que sufre el

ADN plasmídico en contraste con el cromosomal.

 II. OBJETIVO

- Aislar y purificar el ADN plasmídico resistente a ampicilina de una cepa de E.

coli.

- Verificar la purificación del ADN plasmídico mediante electroforesis.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

- Cepa de E. coli con plásmido resistente a la ampicilina

- Medio de cultivo LB (Luria Bertani)

- Solución I: GTE (Glucosa/Tris/EDTA)

- Solución II: NaOH/SDS. Buffer de lisis

- Solución III: acetato de potasio 5M

- Buffer TE

- RNasa

- Lisozima

- Microcentrífuga

- Vortex

- Cámara para electroforesis

- Transiluminador

- Bromuro de etidio

MÉTODO:

Extracción por lisis alcalina: se fundamenta en que los plásmidos son moléculas

pequeñas y están superenrolladas. Durante el proceso de extracción, se busca

desnaturalizar el ADN plasmídico y el cromosoma y posteriormente renaturalizar, con

el fin de que el ADN cromosoma, no se aparee rápidamente y pueda ser atrapado por
 complejos proteicos, los cuales precipitaron; a diferencia del ADN plasmídico que

rápidamente se renaturaliza y adquirirá su conformación natural.

IV. PROCEDIMIENTO:

1. Inocular la cepa bacteriana de E. coli con el plásmido resistente a ampicilina

en 5ml de medio de cultivo LB más 100 μg/ml de ampicilina, agitar por 14-16

horas a 37°C.

2. Transferir 1.5 ml del cultivo a un eppendorf y centrifugar a 13,500 rpm por

dos minutos para formar un pellet de bacterias.

3. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μl de la solución I

(frío) e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.

4. Añadir 200 μl de la solución II (frío) y mezclar bien invirtiendo el eppendorf.

Incubar en hielo por 5 minutos.

5. Añadir 150 μl de la solución III (acetato de potasio) y mezclar por inversión.

Incubar en hielo por 5 minutos y centrifugar a 13,500 rpm por 5 minutos.

6. Transferir el sobrenadante a un eppendorf estéril y agregar 300 μl de

isopropanol y agitar en vortex. Centrifugar 1 minuto a 13,500 rpm.

7. Eliminar el sobrenadante y agregar dos volúmenes de etanol al 70%. Mezclar

invirtiendo y centrifugar 1 minuto a 13,500 rpm.

8. Descartar el sobrenadante y dejar secar el sedimento no más de cinco minutos.

9. Resuspender el sedimento en 50 μl de TE y añadir 1 μl de RNAasa

10. Guardar a -20°C.

Electroforesis en geles de agarosa

1. Preparar un gel de agarosa al 1 %

2. En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado

anteriormente + 10 μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de

carga”

3. Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1% (éste se ha

colocado con anterioridad sumergido en tampón TBE en una cubeta de

electroforesis).

4. Cerrar la cubeta de electroforesis, colocar los electrodos de tal forma que el

polo negativo quede al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo

opuesto del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente

eléctrica continua de 100-120 voltios.

5. Detener la electroforesis tras unos 60 minutos de corrido y colorear el gel con

bromuro de etidio

6. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador de luz ultravioleta

 V. RESULTADOS

Fig 1. Imagen representativa de electroforesis en geles de agarosa

CARRIL 1 CARRIL 2 CARRIL 3 CARRIL 4 CARRIL 5 CARRIL 6

Dímero
CA

Dímero
CCC

Lineal

Monómero
CA

Monómero
CCC

Cuadro 1. Resultados y verificación de la purificación de electroforesis en geles de

agarosa

VI. DISCUSIÓN

Uno de los objetivos principales del uso de kits y extractores automáticos robotizados

es automatizar el proceso, mejorar la precisión, obtener resultados reproducibles y

reducir el tiempo de extracción, principalmente cuando se requiere procesar una gran

cantidad de muestras.

Existen varios parámetros críticos para obtener un resultado óptimo. Los cultivos en

medio LB deberían ser crecidos hasta 1-1’5 A600 unidades/ml o 1 x células/ml. Las
 columnas no deben ser sobrecargadas con DNA plasmídico, para ello deben de usarse

los volúmenes de cultivo que se indican en el protocolo. Almacenar las columnas y

las soluciones a las temperaturas recomendadas.

La composición exacta de las soluciones utilizadas en los “kit” no se conocen

normalmente. Sin embargo, lo regular es que la solución 1 contiene en un tampón Tris

pH 8 para la resuspensión de las células. La solución de lisis (solución 2) está

compuesta por sosa y SDS. La solución 3 por acetato potásico pH 5,5 que permite la

neutralización del lisado antes de cargarlo en la columna.

VII. CONCLUSIONES

En los resultados vemos reflejado la verificación de la purificación con electroforesis

en geles de agarosa para poder observar las formas que puedan tomar los plásmidos.

Se pudo aislar y purificar de manera satisfactoria el ADN plasmídico resistente a la

ampicilina con lo que respecta a una cepa de E. coli. A su vez se verificó la

purificación del ADN plasmídico mediante electroforesis, y este a su vez mostró los

resultados de los carriles que tenemos para observar las diversas formas que toman los

plásmidos.

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

Velázquez, L. P. A., MdCA, M., & Romero, A. C. (2014). Extracción y purificación

de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos

y prácticos, 1.

Repullo, J. L. C., Moyano, E., & Muñoz, J. 38. Purificación de ADN plasmídico y

electroforesis del mismo en gel de agarosa.

Coll, P., Coque, M. T., Domínguez, M. A., Vázquez, J., & Vila, J. (2005).

Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad

Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica: métodos

moleculares de tipificación epidemiológica en Bacteriología.