Tema 9.

Técnicas de purificación y estudio de

las proteínas.

1. Homogeneización

La homogeneización es un procedimiento que permite la disgregación de tejidos y

liberación de las células o de los componentes celulares. Para su purificación las proteínas
deben ser liberadas de la célula. Sin embargo, es necesario preservar las propiedades de
las proteínas con los tampones de pH y las concentraciones salinas adecuadas.

• Homogeneizadores: De vidrio (émbolo en el que se introducen los tejidos y se

rompen las células), de plástico, teflón, metal, o combinaciones; morteros de vidrio,
porcelana, etc; o aparatos más sofisticados como batidores especiales o sonicadores
(emitien ultrasonidos cuyas vibraciones pueden romper las células). A veces emplean
detergentes para extraer proteínas de membrana (en la bicapa).

Se obtiene un homogeneado extracto crudo.

A veces se emplea el extracto crudo directamente para la purificación de las proteínas.
Otras veces se separan orgánulos antes de purificar la proteína concreta que se busca,
mediante centrifugación diferencial. La célula entera se somete a una como
homogeneización y después a una primera centrifugación lenta para separar los restos de
alto peso molecular (membranas, tejidos conectivos, etc). Después se somete a una
segunda centrifugación a velocidades más altas o durante más tiempo y se obtendrá una
as de purificación y estudio de las proteínas
separación más selectiva.
entrifugación
2. Centrifugación

La centrifugación en vacío provoca un aumento de la velocidad ya que no hay rozamiento

y se puede aumentar la temperatura de la cámara, lo cual puede desnaturalizar el material
que se está tratando.

S=v/ω2x 1S=10-13s
Coeficiente de sedimentación---Svedberg
 Tema 9. Técnicas de purificación y estudio de las proteín

•Centrifugación

• Rotor fijo o basculante: el rotor basculante sirve para

separar las partículas en función de su densidad: en la parte
baja se encuentra la sustancia con mayor densidad y se
alcanza una zona (interfase) en la que la densidad de la
partícula alcanza el valor de la densidad del medio.

Tema 9. Técnicas de purificación y estudio de las proteínas

3. Diálisis y ultracentrifugación
•Diálisis y ultrafiltración

• Diálisis: en la diálisis, la bolsa es capaz de dejar pasar partículas de pequeño tamaño.

Al cabo de un tiempo es homogenizada la concentración del líquido exterior,
disminuyendo así progresivamente la concentración de la bolsa.
• Ultracentrifugación: en la ultracentrifugación, una membrana deja pasar
componentes
Tema de tamaño
9. Técnicas de purificación y estudio de más pequeño, pero no las proteínas. Se ejerce presión para
las proteínas

que los•Diálisis
componentes
y ultrafiltración
pasen. Se emplea para lavar o para concentrar las proteínas.
Tema 9. Técnicas de purificación y estudio de las proteínas

•Precipitación fraccionada

4. Precipitación fraccionada

Las proteínas presentan distintas solubilidades,

dependiendo del medio en el que se encuentran. Si se
purifica la proteína y se introduce en el agua pura, es poco
soluble, pero si se aumenta la concentración salina,
aumenta la solubilidad. Sin embargo, si se aumenta en
exceso la proteína termina precipitando (solubilización y
precipitación por salado). Una sal muy empleada es la sal
de amonio ((NH4)2SO4), debido a que no modifica la
estructura nativa de las proteínas. La precipitación
fraccionada se utiliza como paso previo a otro tipo de
técnicas para separaciones más exactas.
5. Cromatografías

A una sustancia que puede retener ciertos componentes de la mezcla se le hace pasar un
líquido que atraviesa todo lo que no es retenido. Los componentes que interaccionan con
la resina se mueven menos (fase estacionaria).

• De filtración en gel o exclusión

molecular.

• De intercambio iónico:
 • De afinidad:

6. Electroforesis

Método que permite mover moléculas cargadas en un cuerpo eléctrico. Se llevó a cabo
sobre un soporte sólido que permite que al cambiar el campo eléctrico las proteínas
permanezcan. Para las proteínas se usan geles de poliacrilamida. Se consiguen
moléculas de alto peso molecular con entrecruzamientos y con unos tamaños de poro que
dependen de la concentración de la poliacrilamida (- concentración, + tamaño de huecos).

Se introduce el gel y el campo eléctrico, y las proteínas se separan moviéndose hacia un

polo u otro.

• Electroforesis nativa: la movilidad de las proteínas depende de la relación de

carga y masa. + carga, + se muven.

Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares por medio de la
electroforesis con gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes.

La mezcla de proteínas se disuelve en un medio con dodecilsulfato sódico (SDS), un

detergente que separa las proteínas en función de su tamaño. Se lleva a cabo en caliente
y las proteínas son rodeadas por moléculas de SDS formando micelas. Cada dos residuos
de aminoácidos se une una molécula de SDS, por eso el número de cargas de las
proteínas es proporcional al tamaño de la micela.

En los patrones se puede interpolar la movilidad de la proteína para determinar

aproximadamente el peso molecular de la proteína.
oteínas

da • Isoelectroenfoque: (en tubo o en placa) Se introducen anfolitos (cargados

positiva
Tema o negativamente
9. Técnicas según yelestudio
de purificación medio) de
y se
lasdistribuyen
proteínas según los diferentes
puntos isoeléctricos a lo largo de todo el gel. Las proteínas se mueven por el gel
pI)/PM hasta que llegan a un punto donde el pH coincide con él pI (carga neta 0, no se
mueven). •Electroforesis
Permite diferenciar proteínas con pI muy similares.

o))

Isoelectroenfoque

Electroforesis bidimensional(2D-PAGE)
 Tema 9. Técnicas de purificación y estudio de las proteínas

•Electroforesis

• Electroforesis bidimensional:

Combinación de isoelectroenfoque con

SDS-PAGE para obtener separaciones de
alta resolución. la muestra se somete
primero a un isoelectroenfoque y las
proteínas se separan según su pI. después
de solamente a electroforesis SDS-PAGE
que las separa por peso molecular. con
este método bidimensional es posible
obtener la secuencia de proteínas.

Isoelectroenfoque

o de las proteínas

iva de proteínas:
Electroforesis bidimensional(2D-PAGE)
rimétricas
7. Determinación cuantitativa de proteínas: Técnicas basadas en
anticuerpos
dos absorben (a 280 nm), y técnicas
aminoácidos colorimétricas
no frecuentes, absorbancia dependiente de su número
nar la proteína para dar un compuesto coloreado de concentración medible
TÉCNICAS CLOROMÉTRICAS

•
Biuret: en condiciones alcalinas el Cu da un complejo con los N
de las proteínas. La Unión depende del esqueleto (cadena
omplejo de Cu** concarbonada)
los nitrógenos
y nodedelaslasproteínas,
cadenas en medio alcalino.
laterales, por lo tanto, es
queleto no de las cadenas
independiente de la sustancia. Es un método pocola
laterales, por tanto independiente de secuencia
sensible porque
ncia es relativamente la débil
absorbancia es débil (pequeña coloración con respecto a la
concentración de las proteínas) y sufre interferencias.
o del biuret • Lowry: es una modificación del método de Buiret y también está
de Tyr, Trp y aminoácidos
basadapolares reaccionan
en la formación con
de un el reactivo
complejo de2+ Folin-Ciocalteau,
de Cu con los N de las
e absorbe a 750nm proteínas en condiciones alcalinas.
o tiene iguales interferencias además de otras, y además depende de la composición
El cobre de las cadenas laterales de Tyr, Trp y aminoácidos polares reaccionan con
el reactivo de Folin-Ciocalteau, generándose una sustancia azul que absorbe a
te Coomassie Brilliant Blue Aumento
750nm. que absorbede laaseñal,
465 nm;
perounido
dependea proteína a 595 nm
de la secuencia de la proteína que haya
una mayor
a las proteínas por enlaces o menor
diversos señal. Es más sensible que el Biuret pero tiene bastantes
no covalentes
interferencias y además
ero no del todo lineal-necesaria curva patrón. depende de la composición.
 sustancia azul, que absorbe a 750nm
ible que el biuret pero tiene iguales interferencias además de otras, y además depende de la composición

principio, un colorante Coomassie Brilliant Blue que absorbe a 465 nm; unido a proteína a 595 nm
se une fuertemente• Bradford: Emplea
a las proteínas por otro principio,
enlaces diversosun no
colorante Coomassie Brilliant Blue que
covalentes
absorbe
e de la secuencia pero a 465
no del nmlineal-necesaria
todo y esta unido a la proteína a 595 nm. El colorante se une fuertemente
curva patrón.
a las proteínas por enlaces diversos no covalentes independientemente de la secuencia
pero no del todo lineal (es necesaria una muestra patrón de concentración conocida).

TÉCNICAS BASADAS EN ANTICUERPOS

icas de purificación y estudio de las proteínas
• Ensayo del inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA): permite el rastro rápido
y cuantificación de la presencia de un antígeno en una muestra. Utiliza anticuerpos
Determinación cuantitativa de proteínas:
contra proteínas a las que se les ha unido enzimas.
• Radioinmunoensayo (RIA): se marca un anticuerpo radiactivamente. La cantidad
Técnicasdebasadas enesanticuerpos
reactividad proporcional a la cantidad de proteína.

yo del inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA)

oinmunoensayo (RIA)