Alumnos:GRANADOS RIVAS BRENDA ________________ Grupo: 3FM1

¿Qué es un Plásmido?

Los plásmidos son moléculas circulares de DNA circular, extracromosómico que se replican
de manera independiente al cromosoma de la célula hospedera, tienen uno o más genes
que codifican proteínas que les confieren resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se
encuentran en las bacterias en diferentes tamaños que oscilan entre 2,000 y hasta 400,000
pb. Pueden ser introducidos en las células bacterianas por un proceso denominado
transformación. Las células y el plásmido se incuban juntos a 0°C en soluciones de CaCl2,
posteriormente se da un incremento de temperatura al medio de entre 37°-43 °C, se puede
utilizar un choque de corriente eléctrica en una técnica llamada electroporación; este
fenómeno permite que las células incorporen a los plásmidos. (Figura 1)

Figura 1. La imagen muestra el DNA cromosómico y el DNA plasmídico.

El plásmido que se utiliza para realizar clonaciones y el que mejor se conoce es el pBR322.
Éste fue el primer plásmido artificial en donde un investigador mexicano, el Dr. Francisco G.
Bolívar Zapata participó en su construcción (Bolívar et al., 1977) y se convirtió en una de las
primeras herramientas para la introducción de genes específicos en una bacteria. El
plásmido pBR322 (4,361 pb) contiene un origen de replicación, un gen de resistencia a la
ampicilina y uno a tetraciclina, los cuales le confieren a las bacterias portadoras la capacidad
de crecer en medios de cultivo en presencia de dichos antibióticos. (Figura 2) El trabajo
consistió en introducir el gen que se quería producir (ejemplo el gen de la insulina) en el
interior del gen de resistencia a la ampicilina, reemplazándolo, de tal manera que si el gen
nuevo estaba presente, la bacteria perdería la capacidad de crecer en el medio con el
antibiótico y, por lo tanto, señalaría que es portadora del gen de interés. Esto es llamado
“selección negativa”, porque se busca que la colonia de bacterias pierda una función; en
este caso, la de resistir a la ampicilina. Esto permitió separar a las células que poseen el gen
de insulina de las que no lo incorporaron.
Figura 2. Mapa de restricción del plásmido pBR 322 de Escherichia coli. Se muestra (1) la secuencia rep pMB1,
responsable de su replicación; (2) el gen rop, que codifica una proteina que estabiliza los complejos RNA I –
RNA II; (3) el gen bla (AmpR) que codifica a la proteína beta-lactamasa, que confiere resistencia al antibiótico
ampicilina; (4) el gen tet, (TcR) que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina. La numeración de los 4361
pb sigue el sentido de las manecillas del reloj, donde el número 1 se ubica entre los genes de resistencia a
antibióticos.

Para realizar el crecimiento de las bacterias se utiliza el medio de cultivo denominado LB

(Luria/Bertani), cuyo nombre se debe a sus creadores, Salvador Luria y Giuseppe Bertani,
que contiene los nutrientes necesarios para promover el crecimiento de las bacterias,
incluyendo péptidos, aminoácidos, vitaminas y minerales. Contiene tres ingredientes
principales: triptona, extracto de levadura y cloruro de sodio. La pri-mera provee la fuente
de carbono y nitrógeno (en forma de péptidos de diferentes longitudes), el segundo
componente es rico en vitaminas y elementos traza, mientras que el último aporta los iones
de sodio nece-sarios para el balance osmótico. Para promover un crecimiento más rápido
se puede suplementar el medio con glucosa, como fuente de carbono.

Ejemplo de la extracción de DNA plasmídico en un gel de agarosa teñido con bromuro de

etidio. (Figura 3)
Figura 3. Se muestra un gel de agarosa con 4 carriles, cada carril muestra diferentes isoformas de extracción
de DNA plasmídico. Carril 1, muestra la isoforma super enrrollada y circular. Carril 2, isoforma lineal. Carril 3,
superenrrollado y circular. Carril 4, sólo lineal.

Ejercicio de extracción de DNA plasmídico.

Con base en los videos y la información presentada, debera contestar las

siguientes preguntas.

pUC19 is one of a series of plasmid cloning vectors created by Joachim Messing and co-workers. The
designation "pUC" is derived from the classical "p" prefix (denoting "plasmid") and the abbreviation for the
University of California, where early work on the plasmid series had been conducted. It is a circular double
stranded DNA and has 2686 base pairs. pUC19 is one of the most widely used vector molecules as the
recombinants, or the cells into which foreign DNA has been introduced, can be easily distinguished from the
non-recombinants based on color differences of colonies on growth media. pUC18 is similar to pUC19, but the
MCS region is reversed.

Components

It has one ampR gene (ampicillin resistance gene), and an N-terminal fragment of β-galactosidase (lacZ) gene
of E. coli. The multiple cloning site (MCS) region is split into the lacZ gene (codons 6–7 of lacZ are replaced by
MCS), where various restriction sites for many restriction endonucleases are present.

The ori site, or origin of replication, is derived from the plasmid pMB1. pUC19 is small but has a high copy
number. The high copy number is a result of the lack of the rop gene and a single point mutation in the ori of
pMB1. The lacZ gene codes for β-galactosidase. The recognition sites for HindIII, SphI, PstI, SalI, XbaI, BamHI,
SmaI, KpnI, SacI and EcoRI restriction enzymes have been derived from the vector M13mp19.
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué aplicaciones tiene el DNA recombinante?

Pequeñas moléculas de ADN con capacidad de replicación, de manera autónoma, de esta

manera para el estudio

2. ¿Qué es la purificación de plásmidos?

Proceso para la recolección de plásmido bacteriano, eliminando otras sustancias y proteínas

con agua y sal.

3. ¿Cuál es una de las aplicaciones de los plásmidos?

Generando grandes cantidades de proteína, así como la clonación de DNA Y observar la

resistencia de las bacterias ante los antibióticos.

4. ¿En qué consiste la electroforesis en agarosa de DNA?

En hacer pasar una pequeña cantidad de corriente pulsante a través de una placa de gel
(agarosa), para la separación por los poros del gel, mediante polos opuestos, donde estos
son atraídos al polo positivo grupo fosfato (negativo)

5. ¿Por qué se llama pUC19?

Llamado así por la obtención de plásmidos de la universidad de california, 10 proviene del

componente M13mp19
 6. En la imagen 2 Localice y marque: A) sitio de origen, B) el operon LacZ, C) gen de
resistencia a la ampicilina, y D) MCS.

A
B

7. ¿Cuál es el tamaño de este plásmido?

2686 pares de bases

8. ¿A qué antibiótico es resistente?

a través de un medio de cultivo, la replicación del plásmido y su reparación por

electroforesis.
 9. De acuerdo al protocolo que siguió en laboratorio ¿Cómo extraería el DNA
plasmídico pUC19?

• Inocular 3 mL de medio de cultivo e incubar por 12 horas

• Transferir 1.5 mL del cultivo a un tubo
• Centrifugar
• Desechar el sobrenadante
• Resuspender el botón celular en 100 µL de TE glucosa en un vortex. TE: 10 mM Tris
ph 7.5 y EDTA 1 mM, glucosa 50 mM
• Adicionar 200 µL de NaOH 100 mM/SDS 0.5% y agitar por inversión
• Transferir el sobrenadante a un tubo eppendoff
• Adicionar 150 µL de Acetato de sodio 5 M, pH 4.8 y agitar por inversión.
Iincubar 5 min sobre hielo
• Centrifugar
• Transferir el sobrenadante a un tubo
• Adicionar al sobrenadante 500 µL de 2-propanol frío agitar.
• Centrifugar
• Resuspender en 20 µL de agua ultra pura libre de nucleasas

10. Describa el uso cada reactivo.

• El SDS. Es un detergente que rompe las membranas bacterianas y desnaturaliza
proteínas
• PROPANOL. Precipitación de proteínas.
• BROMURO DE ETIDIO. Revelar las bandas de plásmidos.
• GTE. solución para la elución en la electroforesis.

11. ¿Cómo comprobaría las isoformas una vez terminada la extracción del DNA
plasmídico pUC19??

De acuerdo al grosor de cada una de las bandas revelada en la placa de electroforesis.

 12. ¿Qué función tiene el bromuro de etidio?

Revelar de manera fluorescente las bandas de plásmidos.

13. Dibuje en el gel de agarosa las isoformas correspondientes a la extracción de DNA

plasmídico.

CIRCULAR

LINEAL

SUPER ENRROLLADO