DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA ANIMAL

BIOQUÍMICA

INVESTIGACIÓN EN PROTEÍNAS

Purificación de proteínas.
❑Precipitación salina.
❑Diálisis.
❑Cromatografía. Tipos.
❑Electroforesis.
❑Evaluación cuantitativa de la purificación de una proteína.

Dr. Marco Salazar Castillo

Para entender los procesos biológicos que se producen en el nivel
molecular es necesario identificar las proteínas que participan en dichos
procesos, aislarlas y analizar su:

❑ Función
❑ Secuencia aminoacídica
❑ Estructura espacial
CONDICIONES GENERALES A EVALUAR

Calidad: % de pureza del producto de acuerdo a mis objetivos.

❑ Secuenciación, cristalización
❑ Ensayo de actividad, productos alimenticios médicos

Cantidad: técnicas de alta capacidad y de baja capacidad.

❑ Preparativas
❑Analíticas

Costos
 Pasos a seguir en una purificación

• Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad

1 biológica) (específico, sensible, rápido y barato).

Elegir la fuente (matriz biológica).

2

Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o extracelulares).

3

Estabilización de la molécula.
4

Aislamiento y concentración (fraccionamiento).

5

• Determinar la pureza y calidad del producto final.

6
 ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Cantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.

Este cambio puede ser:

• Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)
• Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una reacción)

De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológica como:

Una unidad de Actividad Biológica es la cantidad de proteína que produce una
determinada cantidad de “efecto”.

1. Toxina
Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la muerte del
23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones…)

2. Enzima
Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98 moles de
producto en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)
 Elección de la fuente

Matriz donde se encuentra la proteína de interés:

• Concentración
• Accesibilidad
• Costo
• Facilidad de la extracción

Extracción de la proteína de la fuente

Lisis osmótica: técnica muy suave. Uso de sn hipotónicas + fuerzas mecánicas. Para
bacterias y células vegetales: lisozimas u otras enzimas.
Molienda: a. Morteros b. Batidoras. Uso de sustancias abrasivas.
Ultrasonido: Sonicador. Eleva mucho la temperatura de la muestra.
 Estabilización

Factores a tener en cuenta en cada etapa del fraccionamiento:

1. pH

2. Grado de oxidación (-SH)

3. Presencia de Metales pesados. Sustancias Contaminantes

4. Polaridad y fuerza iónica de la solución

5. Presencia de proteasas

6. Temperatura

7. Actividad de la molécula
 Aislamiento y Concentración

Fraccionamiento del extracto crudo

Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades
fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés para separarla del resto
de las moléculas.

Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el

rendimiento en la purificación, pureza y actividad específica de cada fracción
obtenida.
Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general se
recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con las de baja
capacidad.
En general se desea obtener una gran pureza (según los objetivos)
acompañada de un gran rendimiento.
Métodos de rotura celular y extracción de proteínas

Actividad vs. Actividad específica

 Fraccionamiento por desnaturalización
(Precipitación Diferencial)
Salting-out (Precipitación salina):
o Sultafo de amonio
o Fosfato de potasio

Formas de obtener la precipitación

✓ En forma de producto seco
✓ En forma de sn saturada de la sal

Tanto si se trabaja con el precipitado o con el sobrenadante esta técnica en general va seguida de una
técnica de “de-salado”.

Uso de solventes orgánicos: modifican D (constante dieléctrica) e hidratación.

• Etanol
• Acetona
• Butanol

→ Producen algo de desnaturalización. Requieren de bajas temperaturas.

DIALISIS
Las proteínas se pueden purificar de acuerdo con su solubilidad, tamaño, carga y afinidad

La obtención de una proteína determinada dependerá de sus propiedades fisicoquímicas y

biológicas. Existe una serie de técnicas de purificación que se pueden utilizar:

Precipitación salina: Concentraciones elevadas de sal, vuelven insolubles a las

proteínas (favoreciendo su precipitación). La concentración de sal a la cual
precipita una proteína, varía de una a otra. Esta también es útil para concentrar
disoluciones diluidas de proteínas.

Diálisis:
Para su purificación, las proteínas deben liberarse de las célula:

Centrifugación diferencial
 La ultracentrifugación es valiosa para separar las biomoléculas y
determinar sus masas moleculares.

Una partícula se desplazará en un medio líquido cuando se someta a una fuerza

centrífuga.
CENTRIFUGACIÓN ZONAL
 CROMATOGRAFÍA

• La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes

presentes en una misma muestra.
• El método está basado en la circulación de una fase móvil (que arrastra a la mezcla de
compuestos a separar), a través de una fase estacionaria.
• Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos
compuestos presentes en la mezcla resultará su separación.

Las columnas son tubos de vidrio, metal o
plástico, según la técnica empleada, de
diámetro constante y preferentemente de un
material biocompatible; es decir, que no
cambie la función biológica del material en
estudio ni interacciones con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la
separación se dan sobre la matriz o soporte
y pueden ser de diversa naturaleza. Así se
tiene la cromatografía de intercambio iónico,
de interacción hidrofóbica, de filtración o
exclusión molecular, de afinidad, etc.
 Cromatografía de Intercambio Iónico
La matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar con la macromolécula en
estudio de forma que se une a ella por interacciones electrostáticas. Los grupos iónicos se
hallan unidos a la matriz.

Una característica importante es su

capacidad. La capacidad es mayor cuanto
más sustituida esté la matriz, más fuerte sea
la interacción con la macromolécula y mayor
sea el tamaño de poro de la matriz.
 CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR

Las biomoléculas de diferente naturaleza y

tamaño pueden separarse en base a su tamaño
en columnas de filtración molecular o filtración
en gel. Las biomoléculas pasan a través del gel
y tienen a su disposición caminos de diferente
longitud de acuerdo con su tamaño.

Las moléculas pequeñas capaces de penetrar

los poros de la matriz se verán retardadas en
comparación con aquellas de mayor tamaño,
que son excluidas del interior de la partícula y
por lo tanto verán su tránsito acelerado a través
de la columna.
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR
 ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual
finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo
de la técnica que se use.
Electroforesis en papel
Electroforesis en geles de poliacrilamida
 Electroforesis bidimensional
Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente
complejas.

La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es

decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos.

Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de

mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición proteica de un determinado
orgánulo o tipo celular (metabolómica).
DETERMINACIÓN TOTAL DE PROTEÍNAS
 DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
Western Blot (Electroforesis + Inmunodetección)
El protocolo de purificación de proteínas se puede evaluar cuantitativamente
DETERMINACIÓN ESPECÍFICA DE PROTEÍNAS
ELISA
GRACIAS POR
SU ATENCIÓN