QUÍMICA ANALÍTICA II 2023

TP N°8

TRABAJO PRÁCTICO N° 10 – LABORATORIO

SEPARACIÓN DE MACROMOLÉCULAS POR MEDIO DE ELECTROFORESIS

TRABAJO PRÁCTICO INTEGRADOR

CÁTEDRAS: QUÍMICA ANALÍTICA II – FISICOQUÍMICA
CARRERAS: Licenciatura en Biotecnología – Ingeniería Química – Ingeniería en Alimentos –
Profesorado en Ciencias Químicas y del Ambiente.

OBJETIVO
• Instruir al alumno sobre el uso práctico de la electroforesis capilar

INTRODUCCIÓN
El término electroforesis fue introducido por
primera vez en 1907 por Michaelis para definir
el fenómeno por el cual una molécula que posee
carga neta se desplaza en respuesta a la
aplicación de un campo eléctrico. La velocidad
de migración o movilidad a través del campo
eléctrico dependerá de varios factores como
son: la intensidad de dicho campo; la carga
neta, tamaño y forma de las moléculas; así
como la fuerza iónica, viscosidad y temperatura
del medio en el cual las moléculas se están
moviendo. La electroforesis es una herramienta
analítica simple, rápida y muy sensible, lo que
la convierte en una técnica de gran utilidad para
la separación y el estudio de moléculas
cargadas tales como proteínas y ácidos
nucleicos. Existen numerosas variaciones de
esta técnica en función del equipo utilizado,
soporte y condiciones físico-químicas en las Figura 1. Movimiento de las proteínas durante la
cuales se va a llevar acabo la separación. electroforesis.

Las proteínas son biomoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. Debido a su gran
tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre
dispersiones coloidales. Muchas proteínas presentan carga neta si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse
cuando se someten a un campo eléctrico (Figura 1). La velocidad de migración es proporcional a
la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más
rápida será la migración.

Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida
(PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad.
Además, poseen una serie de ventajas tales como: ser químicamente inertes, estables en un amplio
rango de pH, temperatura y fuerza iónica y fácil de generar mediante la polimerización de
acrilamida. En la mayoría de los casos, el gel se dispone entre dos receptáculos independientes y

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separados que contienen tampón de electroforesis y los electrodos positivo y negativo, de forma
que la conexión eléctrica entre ambos receptáculos sólo es posible a través del gel. Una vez que
la electroforesis ha tenido lugar, el gel de poliacrilamida se puede teñir, documentar o incluso se
puede purificar la molécula de interés cortando literalmente el fragmento del gel (Figura 2).

Figura 2. Electroforesis en geles de poliacrilamida.

En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso
electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes:

1) una electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), la más común, es la que somete a las

proteínas a condiciones desnaturalizantes (pérdida de la estructura tridimensional) por medio de
la adición sodiododecilsulfato (SDS), un detergente (Figura 3) y β-Mercaptoetanol (β-Me), un
agente reductor de enlaces disulfuro. En esta situación la migración es proporcional a la carga y
al tamaño de la molécula, pero no a su forma. Las proteínas quedan cargadas negativamente y
migran del polo negativo al positivo durante la electroforesis.

2) una electroforesis nativa (ND-PAGE) es la que somete a las proteínas a migración sin
desnaturalización. En esta situación las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y
de su forma.

Figura 3. SDS-PAGE: Efecto del agente desnaturalizante sobre la proteína.

En ambos tipos de electroforesis es necesaria la incorporación de azul de bromofenol al buffer de

muestra. Este compuesto es un colorante con carga negativa y con una movilidad electroforética
que equivaldría a pequeños polipéptidos. Su función es la de ir por delante de las proteínas para
ir marcando el frente de electroforesis y logremos identificar el final de la separación debido a
que el frente de corrida llega al final del gel.

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La SDS-PAGE se utiliza para determinar el peso molecular de proteínas. Para ello se compara el
Rf de la proteína problema con el de proteínas de referencia cuyo peso molecular se conoce.
Recordemos que el Rf es el parámetro experimental asociado a esta técnica, y se define como:

Rf = Distancia que migra una determinada proteína/ Distancia que migra el frente del gel

CÁLCULO DEL PESO MOLECULAR DE PROTEÍNAS

El cálculo del peso molecular de las proteínas contenidas en las muestras se realiza de la siguiente
manera:
1. En primer lugar, se calculan los Rf de las especies utilizadas como patrón, cuyos pesos
moleculares están exactamente determinados.
2. Realizamos la representación del Log(PM) vs Rf en coordenadas rectangulares y
procedemos a obtener una ecuación de ajuste de dichos datos.
3. Realizamos el cálculo del Rf de las sustancias incógnitas y calculamos los pesos
moleculares utilizando la ecuación de ajuste obtenida a partir de los patrones.

APLICACIONES
- Análisis del grado de pureza de una proteína.
- Determinación de pesos moleculares de proteínas.
- Verificación de la concentración de proteínas.
- Detección de proteólisis.
- Identificación de proteínas inmunoprecipitadas.
- Separación de proteínas marcadas con isotopos radioactivos.

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ACTIVIDAD EXPERIMENTAL

OBJETIVO
• Determinar pesos moleculares de muestras de proteínas purificadas por medio de
electroforesis vertical utilizando geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).
• Interpretar como afecta la concentración de acrilamida en las separaciones
electroforéticas.

DESARROLLO
1) Preparación de los geles de poliacrilamida
Los geles serán provistos por el responsable de la cátedra. Se trabajará con geles de diferentes
concentraciones (12% y 15% de acrilamida). Ver anexo a la presente guía.

2) Preparación de las muestras y patrones

Las muestras proteicas (A y B) serán provistas por la cátedra.

Muestras
A. La muestra A está constituida por un concentrado proteico derivado de la industria
láctea. La misma posee una concentración de 2 [µg/µL].
B. La muestra B es un extracto proteico rico en enzimas proveniente del páncreas porcino.
La misma posee una concentración de 4 [µg/µL].
Patrón
Se utilizarán como patrones de pesos moleculares dos sistemas conteniendo proteínas
purificadas cuyos pesos moleculares se conocen exactamente.
C. P1: Albumina Sérica Bovina (BSA) cuyo peso molecular es de 66 kDA. La misma se
suministrará en una concentración de 1 [µg/µL].
D. P2: Proteínas aisladas del suero de leche (WPI) constituida principalmente por β-
Lactoglobulina (18,4 kDa) y α-Lactalbumina (14,2 kDa).

Tratamiento de las muestras y patrones

Se realizarán diferentes tratamientos a las muestras y patrones:
Tabla 1 – Distribución de muestras y patrones en los pocillos de los geles.
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
BSA WPI WPI WPI M1 M1 M2 M2
D+β-Me D+β-Me D Sin D D+β-Me D+β-Me D+β-Me D+β-Me
NOTA: Pocillos: P1, P2, etc.; BSA y WPI: patrones de pesos moleculares; Muestras
problemas: M1 y M2; Desnaturalización térmica: D; Beta Mercaptoetanol: β-Me.

- En principio debemos preparar el buffer de muestra según indica la información anexa a

la presente guía. El mismo será preparado de dos maneras, con y sin adición de β-
mercaptoetanol.
- En tubos Eppendorf, colocamos 50 µL de muestra o patrón y 50 µL de buffer de muestra,
con o sin β-mercaptoetanol, según corresponda. Colocamos las tapas a los tubos y
homogeneizamos la mezcla por inversión.

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- Los tubos con muestra o patrón que requieran una desnaturalización térmica recibirán
un calentamiento a 100 ºC por 5 min, para lo cual utilizaremos un baño de agua en
ebullición.
- Enfriamos los tubos con muestra o patrón quedando los mismos en condiciones para la
separación electroforética.

3) Preparación de la corrida electroforética

• Se utilizará una cámara de electroforesis
Mini-Protean® Tetra Cell (BioRad), Figura 4.
• Coloque los sándwiches conteniendo el gel en
el soporte correspondiente. Este es parte del
instrumento.
• Quite el peine mediante la colocación de sus
pulgares en las marcas y empujando
(presionando) hacia arriba, con cuidado y
Figura 4. Cámara de electroforesis Mini-
lentamente.
Protean® Tetra Cell (BioRad).
• Coloque el casete de gel en la unidad de
electroforesis en la orientación adecuada. Las
muestras de proteínas no se separarán en geles que no están orientadas correctamente.
• Añadir el tampón de electroforesis 1X dentro de la cámara formada por dos sándwiches
de los geles. Los pocillos de cada gel y la placa interna del sándwich de gel deben estar
sumergidas en el buffer.
• Añadimos el tampón 1X en el exterior de la cámara anterior hasta que el nivel de líquido
llegue a la marca 2 que posee la cuba.
• El gel está listo para la práctica de carga y separación de muestras en los pocillos.

4) Corrida electroforética:
• Colocar con micropipeta 10 µL de las muestras y patrones en el pocillo previamente
designado para cada uno.
• Conectar la tapa conteniendo los electrodos a la cuba electroforética y a la fuente de poder.
• Conectar la fuente de poder al suministro eléctrico y presionar el botón de encendido.
• Correr la electroforesis a 150 voltios hasta que el azul de bromofenol llegue al borde
inferior del gel y presionar STOP.
• Apagar el equipo y desconectarlo del suministro eléctrico.
• Quitar la tapa de la cuba y extraer los soportes de los sándwiches conteniendo los geles
con las muestras y patrones.

5) Revelado de los geles

Para visualizar las bandas correspondientes a las proteínas en estudio es necesario realizar una
tinción o coloración específica, en este caso se utilizará la tinción con azul de Coomasie. Para
lo cual seguiremos los siguientes pasos:
• Extraemos los geles con las muestras corridas de los sándwiches.
• Colocamos los geles en la solución colorante contenida en una placa de Petris grande.
Luego llevamos este sistema a agitación por 45 min.
• Trascurrido el tiempo de tinción, retiramos los geles, los lavamos con agua destilada y se
lo introduce en solución decolorante por 30 min o hasta que observemos un gel
transparente excepto las bandas separadas.

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6) Análisis e Interpretación de resultados

Una vez revelados los geles de poliacrilamida, realizar las determinaciones de los frentes de
corrida (Rf) de cada banda y cuantificar los pesos moleculares de las muestras por medio de
la ecuación de regresión obtenida de representar los datos de los pesos moleculares de los
patrones vs las relaciones de frente de los mismos.

BIBLIOGRAFÍA
- A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. BIORAD.
- Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Descripción del método SDS-PAGE.

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ANEXOS

MODO DE PREPARAR LAS SOLUCIONES

• Buffers:
– TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8:
▪ Peso 18,17 g de TRIS
▪ Disuelvo con 80 mL de agua destilada
▪ Ajusto el pH a 8,8 con HCl
▪ Aforar con agua destilada a 100 mL
– TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8
▪ Peso 3,025 g de TRIS-Base
▪ Disuelvo con 40 mL de agua destilada
▪ Ajusto el pH a 6,8 con HCl 10 M.
▪ Aforar con agua destilada a 50 mL
• SDS 10% (p/v)
▪ Peso 1 g de SDS
▪ Disuelvo con 5 mL agua destilada.
▪ Llevo a volumen en matraz de 10 mL.
• APS 10%
▪ Peso 1 g de APS
▪ Disuelvo con 5 mL agua destilada.
▪ Llevo a volumen en matraz de 10 mL.
• Azul de bromofenol 1%
▪ Peso 0,25 g de Azul de Bromofenol
▪ Colocar en frasco chico (aprox. 50 mL).
▪ Adicionar 25 mL de agua destilada. Agitar.
• TRIS-Glicina pH 8,3
– Tampón de electroforesis 10X TRIS-Glicina pH 8,3 (200 mL de solución)
▪ Pesar 6 g de TRIS base.
▪ Pesar 28,8 g de Glicina.
▪ Pesar 2 g de SDS.
▪ Disolver en 160 mL de agua destilada.
▪ Ajustar pH 8,3 con HCl (c).
▪ Llevar a volumen de 200 mL.
– Tampón de electroforesis 1X TRIS-Glicina pH 8,3
▪ Para preparar 100 mL de solución, tomo 10 mL de solución 10X y lo llevo
a 100 mL en un matraz, con aguas destiladas.
• SOLUCIÓN DE TINCIÓN AZUL DE COOMASSI
▪ Pesar 0,125 g de azul de coomassi.
▪ 25 mL ácido acético.
▪ 125 mL de metanol.
▪ Llevar volumen en matraz de 250 mL con agua destilada.
• SOLUCIÓN DECOLORANTE
– SOLUCIÓN 1:
• 200 mL de metanol.
• 150 mL ácido acético.
• 650 mL de agua destilada.
– SOLUCIÓN 2:
• 220 mL de agua destilada.
• 17,5 mL de ácido acético.
• 12,5 mL de metanol.

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• TAMPÓN PARA LA MUESTRA

▪ TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 → 1 mL
▪ Glicerol → 0,8 mL
▪ SDS 10% → 1,6 mL
▪ Azul de Bromofenol 1% → 0,4 mL
▪ 2-mercaptoetanol → 0,4 mL
▪ Agua destilada → 3 mL

ADVERTENCIA: Preparar el tampón antes de utilizar o sino preparar con todos los reactivos
menos el 2-mercaptoetanol así se puede mantener la solución en el tiempo; antes de usar
agregar el 2-mercaptoetanol.

MODO DE PREPARAR LOS GELES DE POLIACRILAMIDA

• Los materiales necesarios para dos geles idénticos son los siguientes:
o 2 vasos de precipitados de 50 mL.
o 3 pipetas de 5 mL.
o Micropipeta de 100 µL, de 50 µL y de 5 µL.
o 3 Pipeta pasteur.
o 1 vaso precipitado grande para agua destilada.
o 1 piseta.
o Tiras de papel de filtro.
• Armar el dispositivo con los moldes para los geles. Asegurarnos de que queden bien
sellados los fondos de los moldes para que no derramen solución.
• Preparar primero el gel separador, según la concentración a utilizar, de la siguiente manera:

Acrilamida 12%

Agua Destilada 3,3 mL

1,5 M TRIS-HCl pH 8,8 2,5 mL
Acrilamida/Bis-30% 4 mL
10% SDS 100 µL
10% APS 50 µL
TEMED 10 µL

Acrilamida 15%

Agua Destilada 2,3 mL

1,5 M TRIS-HCl pH 8,8 2,5 mL
Acrilamida/Bis-30% 5 mL
10% SDS 100 µL
10% APS 50 µL
TEMED 10 µL

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• Colocar en un vaso de precipitado de 50 mL el agua destilada, el tampón, la Acrilamida/Bis

y SDS.
• Luego agregar el APS y el TEMED.
• Rápidamente cargar los moldes utilizando una pipeta pasteur hasta unos 3 cm antes del
borde superior del vidrio más corto.
• Agregar con otra similar agua destilada sobre el gel para formar una capa sobre la
superficie.
• Dejar que se lleve a cabo la polimerización (tiempo: 45 min a 1 h). La solución sobrante en
el vaso de precipitado nos servirá de control de la polimerización.
• Transcurrido el tiempo, desecho por inversión de la posición de los soportes el agua de la
superficie de los geles con una tira de papel de filtro retirar el agua de la superficie del gel.

- Preparar el gel concentrador de la siguiente manera:

Acrilamida 4%

Agua Destilada 6,1 mL

0,5 M TRIS-HCl pH 6,8 2,5 mL
Acrilamida/Bis-30% 1,3 mL
10% SDS 100 µL
10% APS 50 µL
TEMED 10 µL

• Preparar la solución en un vaso de precipitado de 50 mL de igual manera que en el paso

anterior.
• Cargar la solución formadora del gel sobre la superficie del gel formado con anterioridad
hasta la parte superior del molde.
• Inmediatamente colocar el peine teniendo cuidado de que no queden burbujas de aire.
• Dejar que se lleve a cabo la polimerización (tiempo: 45 min a 1 h). La solución sobrante en
el vaso de precipitado nos servirá de control de la polimerización.
• Luego enjuagar el sándwich, conteniendo el gel formado, con agua destilada.

MODO DE PREPARAR EL BUFFER DE MUESTRA

• TAMPÓN PARA LA MUESTRA
▪ TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 → 1 mL
▪ Glicerol → 0,8 mL
▪ SDS 10% → 1,6 mL
▪ Azul de Bromofenol 1% → 0,4 mL
▪ 2-mercaptoetanol → 0,4 mL
▪ Agua destilada → 3 mL

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