CÓDIGO: FO-DOC-112

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

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PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016
LABORATORIO DE QUIMICA

UNIDAD Departamento de Biología y Química

ACADEMICA:
CURSO: Bioquímica

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE SUERO

PRACTICA Nº 025:
SANGUÍNEO PARA ELECTROFORESIS

1. OBJETIVOS

- Extraer el suero de la sangre para una posterior separación por electroforesis de acrilamida
- Cuantificar el contenido de proteínas del suero de la sangre usando un lector UV de Elisa.

2. FUNDAMENTO TEORICO

Las proteínas son las moléculas orgánicas más diversas y abundantes en la célula, Cada tipo de célula
tiene un rol específico determinado por su composición proteica. La variedad proteica permite funciones
tan refinadas como las de las enzimas que permiten el metabolismo celular. Una bacteria puede tener
cerca de 1000 proteínas diferentes y en una célula humana puede haber más de 10.000 proteínas
distintas. Esta composición depende del conjunto de genes que se estén activados, lo que está
relacionado directamente con las señales que recibe la célula, de su micro ambiente y de las
características celulares que le son propias. Esta expresión diferencial de proteínas puede ponerse en
evidencia mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida. Para esto es necesario extraer las
proteínas de las células que constituyen los tejidos u órganos. Los métodos más utilizados se basan
esencialmente en la homogenización de los tejidos mediante procedimientos mecánicos y/o químicos.
Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo.

Existen distintos métodos colorimétricos que permiten medir el contenido de proteínas de una muestra.
Los cuales involucran la adición de un reactivo químico que es capaz de reaccionar con determinados
residuos de aminoacídicos presentes en las cadenas polipeptídicas del extracto de interés. El cambio
de color en la solución, es medido en un espectrofotómetro usando para la curva de calibración una
proteína estándar, generalmente albúmina sérica bovina (BSA bovine seric albumin), cuya
concentración inicial es conocida.

Los ensayos colorimétricos más utilizados son:

- Lowry (750 nm): Reacción de redox entre los enlaces peptídicos y los aminoácidos Tyr, Trp y Cys.
Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Como desventaja, es afectado por un amplio rango de
compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritón X-100.
- BCA (Bicinchoninine acid assay, 562nm): Es más sensible que Lowry y puede realizarse en un
amplio rango de temperaturas, es sencillo, pero requiere de tiempos de incubación un poco más
largos siendo la coloración mucho más estable. Aunque es altamente susceptible a interferencias,
no interfiere con detergentes y lípidos.
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- Bradford (595nm): Es el doble de sensible que los dos anteriores. Es un método rápido y muy
sencillo y además no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el ß-
mercaptoetanol, que sí interfieren con los anteriormente mencionados. La desventaja es que es
altamente sensible a detergentes y lípidos.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivos Materiales Equipos

Coomassie Brilliant Blue G-250 Micropipeta 200 y 1000 µL Centrifuga
Espectrofotometro
Etanol placa de Elisa
de Elisa
Acido fosfórico al 85% Geringa desechable 10mL
Albumina
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
HCl

4. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA

Tratamiento de la muestra: En un tubo de centrífuga limpio y seco recoger de 10 a 20 mL de sangre

de un donante. Dejar en reposo unos 15 min, hasta que coagule completamente. Centrifugar para
separar el plasma por 10 min, a 5000 rpm. Transferir la mayor cantidad posible de sobrenadante a un
tubo ependoff.

Reactivo de Bradford: 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 se disuelven en 50 ml de etanol y

100 ml de ácido fosfórico al 85%. Se ajusta el volumen a 1 litro con agua y se filtra. Estable por 2 meses.

Cuantificación:

- Preparar 5 diluciones de albumina 0,05 mg/mL a 1,0 mg/mL a partir de una solución de 10 mg/mL

- Para las muestras (suero) realizar primero 2 diluciones seriadas 1/10 en PBS (NaCl 8,0 g/L, KCl
0,2 g/L, Na2HPO4 1,44 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, ajustar pH a 7.4 con HCl antes de aforar).

- Blanco: PBS

5. En la placa de Elisa de 96 posos agregar 10 µl de cada dilución del estándar, banco y cada
muestra con sus diluciones todo por duplicado. Por último, colocar 200 µl del reactivo de
Bradford a cada pocillo que tienen blanco, albumina y muestra. Incubar a temperatura
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ambiente por 5 minutos (No pasar de 1 hora la lectura) y medir a 595 nm en un lector de
microplacas.
6. CONSULTA PARA EL INFORME

1. Plantee una metodología que permita separar y cuantificar el contenido proteico de

organelos celulares tales como citoplasma, núcleo, mitocondria, retículo endoplasmático,
etc.

2. Describa la metodología para la cuantificación de proteínas por el método de BSA y Lowry.