U.D.1.

BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CITOGENÉTICA
 ÍNDICE:
 1.1. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA.
 1.2. EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
 1.2.1. EL EQUIPAMIENTO.
 1.2.2. LA ESTRUCTURA DEL LABORATORIO.
 1.2.3. EL FLUJO DE TRABAJO.
 1.2.4. LAS CONDICIONES DE TRABAJO.
 1.2.5. EL USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS
 1.3. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVOS CELULARES.
 1.3.1. EL EQUIPAMIENTO.
 1.3.2. LA ESTRUCTURA DEL LABORATORIO.
 1.3.3. LAS CONDICIONES DE TRABAJO: TÉCNICA ASÉPTICA.
 1.4. LA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO.
 1.4.1. BIOSEGURIDAD.
 1.4.2. SEGURIDAD QUÍMICA.
 1.4.3. EQUIPAMIENTO Y NORMAS DE SEGURIDAD.
 1.4.4. EL MANUAL DE SEGURIDAD.
 1.4.5. GESTIÓN DE RESIDUOS.
 1.1. BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CITOGENÉTICA
 BIOLOGÍA MOLECULAR = Parte de la biología que estudia la
composición, estructura y función de las moléculas
biológicamente importantes, así como de los procesos en
los que están implicados.
 Se reserva para el estudio de los ácidos nucléicos.
 El estudio de las proteínas LABORATORIO DE
PROTEÓMICA.
 CITOGENÉTICA = Parte de la genética que estudia la
estructura, función y comportamiento de los cromosomas
en metafase.
 AMBOS SE CONSIDERAN LABORATORIOS DE GENÉTICA.
 Definición de la UNIDAD DE GENÉTICA según RD 1277/2003 =
unidad asistencial que bajo la responsabilidad de un
facultativo con formación adecuada, está dedicada a la
realización de pruebas genéticas y la emisión de dictámenes
correspondientes con fines diagnósticos.

 En ambos laboratorios se van a realizar técnicas complejas

que requieren un equipamiento especializado y costoso, por
eso se estructuran en:
 ÁREAS SUCIAS
 ÁREAS LIMPIAS
1.2. EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR:

 Técnica básica = REACCIÓN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (amplificación del ADN)
 La estructura del laboratorio, los flujos y formas de
trabajo se organizan alrededor de esta técnica.
 LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR (BM)

Técnicas básicas:
– Extracción.
– Purificación.
– Amplificación (PCR) de los ácidos nucleicos
– Análisis. (ADN o ARN)
– Secuenciación.
– Hibridación.
– Clonación

Aplicación clínica:
– Desórdenes genéticos.
– Infecciones (VIH, Hepatitis, Influenza).
– Medicina forense.
– Análisis prenatales.
 1.2.1. Equipamiento

 Equipamiento específico:
 Termociclador.
 Equipo de electroforesis.
 Documentador de geles.
 Aparatos automáticos para procesos
específicos:
 Extracción de ácidos nucleicos.
 Secuenciadores.
 TERMOCICLADOR:

 Aparato en el que se lleva a cabo la PCR.

 Permite realizar un nº elevado de ciclos repetitivos
programables con temperaturas diferentes y distintos
tiempos de incubación controlados por un
microprocesador.
 Partes del termociclador:
 BLOQUE INCUBADOR: Soporte metálico con
múltiples pocillos para colocar los tubos de
reacción de PCR.
 Es capaz de mantener de forma homogénea la
temperatura programada a los tiempos indicados
(4ºC a 96ºC)
 Modelos:
 Sistemas de aire caliente y frio o resistencias
eléctricas.
 Materiales semiconductores (EFECTO PELTIER)
 TAPA DEL BLOQUE INCUBADOR: Tapa
termostatizada a 102ºC-105ºC. Una vez cerrada
entra en contacto directo con la tapa de los tubos
de reacción evitando que el agua de la mezcla de
reacción se evapore.
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR (BM)
TERMOCICLADOR
TERMOCILADOR A TIEMPO REAL
 Termociclador especial el cual además de los
elementos anteriormente descritos incorpora :
 Un sistema de láser y detección de fluorescencia capaz
de excitar y medir la fluorescencia emitida por cada tubo
de reacción individualmente,
 Esta tecnología permite detectar la síntesis de
productos de amplificación en tiempo real.
 EL EQUIPO DE ELECTROFORESIS
 Separar moléculas de ácidos nucleicos de distintos tamaños.
 Analizar los productos amplificados en una PCR.
 Purificar y obtener fragmentos de tamaños concretos de ADN.
 FUNDAMENTO: Se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una
disolución tampón (ph 7,5-7,8) en la que se sumerge una matriz que
contiene las muestras de ácidos nucléicos. Estos migran con mayor o
menor velocidad a través de la matriz en función de la carga neta que
poseen (negativa a ese Ph), su tamaño y su conformación
tridimensional.
http://medmol.es/tecnicas/68/
 Matriz (gel): Gel de Agarosa
 Entre 0,5% y 2%.
 Se utilizan para separar fragmentos de mayor tamaño
permitiendo electroforesis rápidas pero con
resolución limitada.
 La localización de los ácidos nucleicos se realiza
utilizando un agente intercalante fluorescente.
 Gel de poliacrilamida
 Se utilizan para separar moléculas de menor tamaño
con mayor poder de resolución.
 La localización de los ácidos nucleicos se realiza
utilizando un agente intercalante fluorescente.
 Equipamiento que permite realizar la
electroforesis:

 SOPORTE PLÁSTICO: Dónde se hace soldificar el gel

 CUBETA DE ELECTROFORESIS:
 Soporte central para la «cama» con el gel.
 Dos zonas de depósito de tampón de electroforesis en cada
uno de los extremos.
 Electrodo positivo y negativo.
 FUENTE DE ALIMENTACIÓN: suministra corriente eléctrica
continua a la cubeta de electroforesis. Debe permitir
seleccionar voltaje o amperaje y graduar su intensidad.
 DOCUMENTADOR DE GELES:

 Equipo que permite visualizar las bandas de ácidos

nucléicos en el gel después de la electroforesis y obtener
una fotografía de él.
 Transiluminador: fuente de luz ultravioleta (235-365 nm)
situada por debajo de una superficie transparente al UV
donde se coloca el gel. Cuando la luz UV ilumina el gel, el
agente intercalante emite fluorescencia , visualizándose las
bandas.
 Cámara fotográfica o sistema de captación de imágenes: la
visualización se realiza con una cámara acoplada a la parte
superior de la cámara oscura.
 EQUIPAMIENTO GENÉRICO:
 CABINA DE BIOSEGURIDAD.
 SISTEMA DE PURIFICACIÓN DE AGUA.
 ESPECTOFOTÓMETRO.
 MICROSCOPIO DE LUZ TRANSMITIDA Y FLUORESCENCIA.
 AUTOCLAVE,
 INCUBADOR O ESTUFA.
 BAÑO TERMOSTÁTICO, TERMOBLOQUE Y PLACA
CALEFACTORA.
 CENTRÍFUGA Y MICROCENTRÍFUGA.
 NEVERAS Y CONGELADORESDE -20ºc Y -80ºc.
 OTROS: Balanza, agitadores magnéticos, vortex,
phmetro….
 Cabina de bioseguridad:
 Cabina de flujo laminar vertical de
clase II, que protegen de
contaminación a la muestra, a la
persona manipuladora y al medio
ambiente.
 Son muy importantes cuando se
trabaja con:
 ARN por las ARNasas.
 Cultivos celulares.
 Sistema de purificación de agua
 Es necesario agua purificada
tipo II y agua ultrapura tipo
I.
 Existen muchos equipos de
purificación de agua en el
mercado. Se basan en
distintas tecnologías: resinas
de intercambio iónico,
ósmosis inversa, filtración…
 La elección depende del
consumo diario de uno u
otro tipo de agua.
 Espectofotómetro
 Se utiliza para medir la
concentración de ácido nucléico
de una muestra (230-320nm).
 Dado que en ocasiones la
concentración de ácidos
nucléicos es muy pequeña, se han
diseñado espectrofotómetros
específicos para cuantificar
ácidos nucléicos que utilizan
cantidades mínimas de muestra
(1µ) basados en cubetas capilares
Microscopio de luz transmitida y
fluorescencia

 Es imprescindible para interpretar

las técnicas de hibridación in situ
fluorescente.
 Debe estar dotado con los filtros
de fluorescencia adecuados para
los fluorocromos utilizados y es
aconsejable que tenga un sistema
de captación de imágenes.
 Autoclave:

 La mayoría del material que se utiliza en el laboratorio

se puede conseguir estéril pero la utilización del
autoclave puede reducir los costes.
 Incubador o estufa
 Las características dependerán de las muestras que se
estudien y de las técnicas que se utilicen
 Si se usan bacterias se necesitarán estufas de cultivo
de microbiología.
 Si se trabaja con cultivos celulares se requerirán
incubadores con CO2 y humedad controlada
Baño termoestático, termobloque y
placa calefactora
 Es necesario para realizar todo tipo de incubaciones,
digestiones y tratamientos enzimáticos.
 La placa calefactora es necesario que pueda alcanzar
una temperatura estable y homogénea para
desnaturalizar el ADN y tejidos en las técnicas de
hibridación in situ.
 Centrífuga y microcentrífuga
 Tienen que tener rotores que permitan centrifugar
desde tubos de 50 ml a Eppendorf de o,2mL.
 Lo ideal es que alguna sea refrigerada.
 Neveras y congeladores de -20ºC y -
80ºC:

 Es necesario para conservar muestras y

reactivos:
 La mayor parte de los reactivos sobre
todo las enzimas se conservan a -20ºC.
 La conservación de todas las muestras
de ARN y el almacenamiento a largo
plazo de muestras de ADN debe
realizarse a -80ºC.
Otros equipamientos:
 1.2.2 LA ESTRUCTURA DEL
LABORATORIO:
• Condicionada por la técnica principal que se realiza.
• La realización de la PCR implica:
• Preparación de reactivos
• Extracción y purificación de ADN de una muestra
biológica.
• Análisis de los productos de la reacción mediante
electroforesis y documentación en gel.
• Cada una de estas actividades debe realizarse en un
área de trabajo independiente, por lo tanto un
laboratorio de biología molecular debe constar de
cuatro salas independientes como mínimo.
 SALA DE PREPARACIÓN DE
REACTIVOS:
• Se considera el área limpia del laboratorio: sin ADN.
• En ella se preparan todos los reactivos que se van a
utilizar, incluyendo la mezcla de reacción de la PCR.
• Los reactivos no pueden contaminarse esta sala
debe tener presión positiva.
• Debe disponer de una cabina de bioseguridad.
SALA DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y
EXTRACCIÓN DE ADN

• Es una sala sucia.

• Debe tener ligera presión negativa para evitar la
salida de material contaminante.
• Debe contener una cabina de seguridad y un
espectrofotómetro.
 SALA DE PCR:

• Termocicladores.
• Zona de trabajo para añadir las muestras de ADN a la
mezcla de reacción.
 SALA DE POST-PCR:

• Sala sucia, debe tener presión negativa.

• Dispone de los equipos de electroforesis y de
documentación de geles.
• En situaciones especiales puede situarse en
una sala oscura junto con el microscopio de
fluorescencia.
 1.2.3. EL FLUJO DE TRABAJO:
• La estructura parcelada del laboratorio de BM
en salas no es suficiente para garantizar el
resultado fiable de las PCR.
• Es muy importante que el personal técnico
sea consciente de la extrema facilidad con la
que se contaminan las muestras.
• Es muy importante tener presente el flujo de
trabajo.
 Flujo de trabajo:
• Marca el sentido único de los procesos en el circuito
de trabajo.
• Debe ser unidireccional desde las áreas limpias hacia
las sucias:
– Pre-PCR PCR post-PCR.
• Cada área de trabajo debe ser autónoma.
• Cada área debe disponer su propia infraestructura
básica y del material de trabajo.
• No se puede intercambiar el material entre las distintas
salas.
• Material de trabajo:
– Pipetas automáticas.
– Equipos de protección individual: guantes, batas
desechables, gafas de protección….
– Material fungible: tubos, eppendorf, gradillas, pipetas
desechables, puntas de pipeta….
• Se debe evitar el retorno de cualquier material de las
áreas sucias a las áreas limpias.
 1.2.4. LAS CONDICIONES DE
TRABAJO:
• Normas generales de buenas prácticas: no comer, no
beber, no fumar….
• Condiciones de trabajo específicas para impedir o
minimizar la contaminación de las muestras:

TÉCNICA ASÉPTICA
 CONTAMINACIÓN DE LAS
MUESTRAS:
• Introducción accidental en las muestras de
material exógeno que altere su pureza.
• La contaminación causa resultados erróneos
o no interpretables.
• Tipos de contaminantes más peligrosos:
– Ácidos nucleicos extraños a la muestra.
– Enzimas no deseadas que degradan ácidos
nucleicos (nucleasas).
FUENTES DE CONTAMINACIÓN:
• Contaminación cruzada:
– Material no amplificado del medio ambiente o
microorganismos ambientales: aerosoles
– Contaminantes procedentes del personal técnico: células
de descamación, pelo…
– Contaminantes de las superficies de trabajo.
• Contaminación por productos amplificados: generados
en el propio laboratorio por PCR (carryover).
• Contaminación de los reactivos comerciales y del
material fungible: la mayoría de los fabricantes
garantizan la esterilidad pero no la ausencia de ADN o
nucleasas, ARNasas.
NORMAS PARA LA MANIPULACIÓN DE
MATERIALES Y REACTIVOS

• Separación física de las áreas de trabajo.

• Flujo unidireccional de trabajo.
• Usar materiales certificados libres de nucleasas.
• Para evitar la contaminación por ADN realizar un
control exhaustivo de los reactivos y realizar
controles negativos.
• Buenos hábitos de trabajo en condiciones de
esterilidad: TÉCNICA ASÉPTICA.
 TÉCNICA ASÉPTICA:

• Conjunto de actividades encaminadas a prevenir la

contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos
y nucleasas.
• Hay que adaptar el conjunto de actividades al entorno
de trabajo.
• Doble objetivo de estas actividades:
– Prevenir la contaminación de la muestra.
– Evitar la contaminación del trabajador por productos
biológicos y químicos peligrosos
 LAVADO DE MANOS
• Debe ser frecuente.
• Norma de higiene
básica cuando se
manipulan muestras
biológicas y reactivos
químicos aunque se
usen guantes.
 USO DE EPI:

• Guantes sin talco: compaginado

con técnicas que impidan su
contaminación.
– Ejm: centrifugar eppendorfs o
tubos para evitar formación de
aerosoles
• Batas.
 DESCONTAMINACIÓN DE
SUPERFICIES:

• MÉTODOS FÍSICOS: Luz UV

• MÉTODOS QUÍMICOS: soluciones de hipoclorito

sódico al 10% o descontaminantes comerciales (DNA
zap, DNA Remover, DNA Away…)
 PREVENCIÓN DE
CONTAMINACIÓN AMBIENTAL
• Para prevenir la contaminación cruzada ambiental es
imprescindible el uso de:
– Cabinas de bioseguridad de clase II
– Puntas de micropipetas especiales: evitan la
contaminación de las pipetas por formación de aerosoles.
• De desplazamiento positivo: tienen un émbolo o pistón el
cual succiona y expulsa el fluido sin que toque a la pipeta ni
se formen aerosoles.
• Puntas con filtro: tienen un filtro en su interior el cual
impide que los aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.
PREVENCIÓN DE CARRYOVER

• No revertir nunca el flujo de trabajo transportando

muestras amplificadas desde las áreas de PCR o post-
PCR a las zonas de preparación de muestras y
purificación de ácidos nucléicos.
1.2.5. EL USO EFICIENTE DE LOS
RECURSOS:
• El laboratorio de BM es muy especializado con unos
elevados costes.
• Para una eficiente gestión de los recursos es
imprescindible:
– Implantar estándares de calidad adecuados.
– Desarrollar indicadores de calidad que permitan
comprobar que funciona correctamente.
• Seria conveniente que estuviese certificado por una
empresa acreditadora para el cumplimiento de la
norma ISO.
Puntos que se deben contemplar:

• Equipamiento e infraestructuras.
• Reactivos.
• Recursos humanos.
• Técnicas.
• Gestión medioambiental.
 EQUIPAMIENTO E
INFRAESTRUCTURA:

• Se debe contar con un plan de

mantenimiento (diario, semanal,…) y de
revisiones técnicas periódicas.
• El mantenimiento debe incluir las
calibraciones si se requieren y la limpieza de
los equipos.
 REACTIVOS:

• Debe poderse asegurar su trazabilidad desde

la recepción hasta su consumo o caducidad.
• Deben existir:
– Registros de entrada.
– Control de lotes y caducidades.
– Almacenamiento correcto,
 RECURSOS HUMANOS

• Todo el personal de nueva incorporación

debe recibir el adiestramiento adecuado de
sus funciones, así como en materia de
seguridad y gestión de residuos.
• Se debe diseñar un plan de formación
continuada para adecuar los conocimientos
del personal del laboratorio a la evolución de
las tecnologías.
 TÉCNICAS:

• Deben estandarizarse mediante

procedimientos normalizados de trabajo que
incluyan todos los aspectos de la técnica.
• Es imprescindible una buena comunicación
con los clínicos solicitantes de las pruebas
para evitar repeticiones.
 GESTIÓN MEDIOAMBIENTAL

• El laboratorio debe contar con un código de

buenas prácticas medioambientales:
– Intentar reducir en la medida de lo posible
los consumos de agua, electricidad y papel.
– Garantizar el correcto reciclado de los
residuos de tipo urbano,
1.3. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA
Y CULTIVOS CELULARES.

• LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES = Tiene

como objetivo la propagación o crecimiento de
células eucariotas de organismos pluricelulares en
medios de cultivo artificiales en condiciones
controladas
• LABORATORIO DE CITOGENÉTICA = Tiene como
objetivo el estudio de los cromosomas tanto desde
una perspectiva:
– MORFOLÓGICA: Cariotipo
– MOLECULAR: citogenética molecular.
• Ambos laboratorios tienen muchos aspectos en
común
• El laboratorio de citogenética se considera una
ampliación especializada del laboratorio genérico de
cultivos celulares. Engloba:
– ÁREA DE CULTIVO CELULAR: enfocada al estudio de
células en mitosis
– ÁREA DE GENÉTICA: enfocada al estudio de los
cromosomas metafásicos.
• En ambos laboratorios se debe implantar una política
de calidad para el uso eficiente de los recursos similar
a la del laboratorio de BM.
 1.3.1. EL EQUIPAMIENTO:

• Requiere:
– EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CULTIVOS
CELULARES.
– EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA TÉCNICAS DE
CITOGENÉTICA.
– EQUIPAMIENTO COMÚN A OTROS LABORATORIOS.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO
PARA CULTIVOS CELULARES:

– CABINA DE FLUJO LAMINAR.

– INCUBADOR DE CO2.
– MICROSCOPIO INVERTIDO.
– EQUIPO DE CRIOGENIA.
 CABINA DE FLUJO LAMINAR:
• Es la infraestructura en la interior de la
cual se realizan todos los procesos y
manipulaciones de cultivos celulares:
preparación de medios, siembra de los
cultivos, cambios de cultivo,
subcultivos…
• La cabina adecuada es la de clase II.
 Elementos de la cabina de flujo
laminar:
• PANEL FRONTAL TRANSPARENTE: mantiene la
estabilidad del flujo laminar en el interior.
• REJILLA FRONTAL: genera una corriente entrante de
aire que impide el escape de contaminantes
• SISTEMA MECÁNICO: impulsa el aire entrante y el aire
recircularizado hacia la parte superior de la cabina,
• FILTRO HEPA DE GRAN SUPERFICIE: forma el techo de
la cabina. Parte del aire impulsado por el sistema
mecánico se fuerza a pasar a través de este filtro
• SEGUNDO FILTRO HEPA: más pequeño y situado
encima del primero. Elimina al exterior el resto del aire
que es impulsado por el sistema mecánico.
 INCUBADOR DE CO2
• Es el aparato que proporciona las condiciones
ambientales óptimas para el crecimiento de las células
en el medio de cultivo. Dispositivos:
– Control de temperatura: fija y mantiene la
temperatura óptima.
– Recircularización del aire interior: para
homogeneizar la temperatura
– Control de CO2: Se suministra comprimido en
botellas presurizadas, lo mezcla con el aire en
la proporción adecuada (4-7%) y lo inyecta en
el interior.
– Control de humedad: o se pone una bandeja
con agua en el suelo del incubador (riesgo de
contaminación) o el dispositivo inyecta agua
esteril.
 MICROSCOPIO INVERTIDO:
• El control del crecimiento de un
cultivo se realiza por observación
microscópica directa en un
microscopio óptico convencional
invertido.
• Tiene invertidas la posición de la
fuente de luz y el revolver.
• Para ver las células en crecimiento
(vivas, transparentes y sin coloración)
es ideal que el microscopio invertido
esté dotado de un sistema de
contraste de fases.
 EQUIPO DE CRIOGENIA:
• Permite conservar a largo plazo y en forma viable
muestras de células y líneas celulares.
– Tanque o depósito de nitrógeno líquido.
– Nodriza para rellenar el tanque o instalación que lo
conecte con un suministro centralizado de nitrógeno
líquido.
EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA
CITOGENÉTICA:

– EQUIPO DE ANÁLISIS DE IMAGEN: Microscopio

óptico convencional, cámara digital, software
específico y Microscopio óptico convencional de
fluorescencia.
– MICROSCOPIO ÓPTICO CONVENCIONAL.
– MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.
 EQUIPO DE ANÁLISIS DE LA
IMAGEN: (1)
• Microscopio óptico convencional: visualizar las metafases
teñidas con técnicas de bandeo.
• Cámara digital: para obtener imágenes de las metafases
para su posterior análisis.
• Software específico: para análisis de metafases.
– Existen varios programas informáticos comerciales que
analizan las metafases, cromosoma a cromosoma,
permitiendo su reconocimiento con base en el patrón de
bandas y su emparejamiento para obtener el cariotipo.
 EQUIPO DE ANÁLISIS DE LA
IMAGEN: (2)

• Microscopio distinto al del análisis de imagen. Se

utiliza para:
– recuentos de células.
– estudios de viabilidad y morfología celular.
– visualización de preparaciones de hibridación in situ
fluorescente.
– etc.
EQUIPAMIENTO COMÚN:

– EQUIPO DE ESTERILIZACIÓN: Autoclave, Sistema

de filtración.
– SISTEMA DE PURIFICACIÓN DE AGUA.
– NEVERA Y CONGELADORES DE -20ºC Y -80ºC.
– OTROS: Centrífugas, phmetros, agitadores
magnéticos, balanza, pipeteadores automáticos,
placa calefactora…
 EQUIPO DE ESTERILIZACIÓN
• La esterilidad de todo el material y de los reactivos
que estén en contacto con los cultivos es
imprescindible.
– Autoclave para esterilizar todo tipo de material.
– Sistema de filtración con filtros de 0,22 µm para
esterilizar soluciones.
SISTEMA DE PURIFICACIÓN DE
AGUA

• El agua debe ser:

– ULTRAPURA.
– ESTERIL.
– LIBRE DE APIRÓGENOS.
NEVERAS Y CONGELADORES DE
-20ºC Y -80ºC.

• Es necesario para conservar a las temperaturas

adecuadas los distintos reactivos empleados.
Otros equipamientos:
 1.3.2. LA ESTRUCTURA DEL
LABORATORIO:

• La prevención de la contaminación condiciona la

estructura del laboratorio.
• Se aplica el criterio de separación física de:
– Áreas limpias.
– Áreas sucias
• Se divide en tres salas:
– Sala de cultivos.
– Sala de laboratorio convencional
– Sala de frío
 SALA DE CULTIVOS:

• Sala limpia.
• Se realizan todos los procedimientos relacionados
con el cultivo celular.
• Debe estar alejada del paso para evitar turbulencias.
• Debe estar dotada de un sistema que le suministre
aire filtrado.
• Cabinas de flujo laminar, incubadores, microscopio
invertido
 SALA DE LABORATORIO
CONVENCIONAL:
• Sala sucia.
• Se realizan los procedimientos que no estén
relacionados con el cultivo celular.:
– Preparación de extensiones.
– Tinciones.
– Cariotipos.
– Citogenética molecular.
• Contiene el resto del equipamiento menos el de
criogenia y además puede estar dotada de una zona
oscura para el microscopio de fluorescencia
 SALA DE FRÍO:

• Con congeladores y equipo de criogenia.

• Debe estar separada de la sala de cultivos pues los
congeladores crean turbulencias.
• Lo ideal es que sea una sala frigorífica, para minimizar
el consumo de nitrógeno líquido y alargar la vida de
los congeladores.
 1.3.3. LAS CONDICIONES DE
TRABAJO: TÉCNICA ASÉPTICA:

• Estricta técnica que impida la contaminación de los

cultivos celulares por microorganismos.
• Todas las tareas se realizan dentro de la cabina de
flujo laminar.
PROTOCOLO DE TRABAJO EN LA
CABINA DE FLUJO LAMINAR:
• 1.- LAVADO FRECUENTE DE MANOS.
• 2.- USO DE GUANTES Y BATAS DESECHABLES
ESTÉRILES.
• 3.- LA PUERTA DE LA SALA DEBE ESTAR SIEMPRE
CERRADA.
• 4.- USO EXCLUSIVO DE MATERIAL Y REACTIVOS
ESTÉRILES. EL MATERIAL DESECHABLE ESTÉRIL NO
ES INTERCAMBIABLE CON EL DE OTRAS SALAS.
• 5.- NO INTRODUCIR MERCHEROS BUNSEN EN LAS
CABINAS GENERAN TURBULENCIAS QUE ALTERAN
EL FLUJO LAMINAR.
• 6.- COLOCAR EN EL INTERIOR DE LA CABINA EXCLUSIVAMENTE
EL MATERIAL QUE SE VAYA A UTILIZAR.
• 7.- NO SACAR EL MATERIAL ESTÉRIL DE SU EMBALAJE HASTA
EL MOMENTO DE USO, EVITANDO TOCAR CON ÉL CUALQUIER
SUPERFICIE.
• 8.- EL MATERIAL USADO REUTILIZABLE DE VIDRIO SE PUEDE
COLOCAR EN UN RECIPIENTE CON HIPOCLORITO AL 10% HASTA
FINALIZAR LA SESIÓN DE TRABAJO. DESPUÉS SE LLEVA AL
LABORATORIO GENERAL PARA SU LIMPIEZA Y
ESTERILIZACIÓN.
• 9.- EL MATERIAL FUNGIBLE UTILIZADO EN LA CABINA SE
DEPOSITA EN CONTENEDORES ADECUADOS PARA MATERIAL
CONTAMINADO, QUE SE RETIRAN AL FINALIZAR LA SESIÓN DE
TRABAJO.
• 10.- RESTRINGIR EL ACCESO A LA SALA DE CULTIVOS
EXCLUSIVAMENTE AL PERSONAL QUE ESTÉ REALIZANDO
ALGÚN PROCEDIMIENTO. NO SE DEBEN RECIBIR VISITAS.
• 11.- LIMPIEZA DE LAS CABINAS DE FLUJO LAMINAR CON ETANOL
AL 70% O DESINFECTANTE COMERCIAL APROPIADO PARA
CABINAS AL FINALIZAR CADA SESIÓN DE TRABAJO.
• 12.- EN LAS CABINAS DOTADAS DE LÁMPARA GERMICIDA UV,
ESTA SE PUEDE CONECTAR DESPUÉS DE LA LIMPIEZA UN
MÁXIMO DE 30 MINUTOS.
• 13.- REALIZAR UN MANTENIMIENTO PROGRAMADO DE LAS
CABINAS (MÍNIMO ANUAL) QUE INCLUYA COMPROBACIÓN DEL
FILTRO HEPA.
• 14.- LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES CON ETANOL AL
70% O DESINFECTANTES APROPIADOS.
 1.4.- LA SEGURIDAD EN EL
LABORATORIO (BM y CG):
• Hace referencia a la prevención de la exposición del
personal a agentes nocivos y también a impedir la
liberación de estos al exterior.
• Puede ser:
– BIOLÓGICA O BIOSEGURIDAD: Prevención ante
agentes patógenos y toxinas.
– QUÍMICA: Prevención ante la exposición a agentes
químicos.
– FÍSICA: cortes, quemaduras, electrocución…
 1.4.1.- BIOSEGURIDAD
• Engloba todas las normas, técnicas, prácticas y hábitos
de trabajo que intentan evitar:
– La exposición accidental (no intencionada) del personal a
agentes biológicos potencialmente peligrosos (patógenos
y toxinas).
– La liberación al medio ambiente de agentes biológicos
potencialmente peligrosos.
• Cualquier muestra biológica debe considerarse
potencialmente peligrosa y deben adoptarse medidas
mínimas de protección.
• El principal problema de bioseguridad lo plantea el trabajo con
microorganismos y con organismos modificados genéticamente (GMO).
• El Real Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba el
Reglamento General para el Desarrollo y Ejecución de la Ley 9/2003, de 25 de
abril, por la que se establece el régimen jurídico de la utilización confinada,
liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados
genéticamente, en su artículo 12, clasifica las actividades de utilización
confinada de los GMO en cuatro tipos en virtud del riesgo para la salud
humana y el medio ambiente:
– Tipo 1: Riesgo nulo o insignificante.
– Tipo 2: Riesgo bajo.
– Tipo 3: Riesgo moderado.
– Tipo 4: Riesgo alto.
• En el Anexo I del RD se describen los elementos que se
deben tener en cuenta y el procedimiento que se aplica
para realizar la evaluación del riesgo.
• En el Anexo II se establecen las medidas de protección y
confinamiento mínimas según el tipo de actividades
desarrolladas en el laboratorio.
• En los laboratorios de citogenética y cultivos celulares se
deberían aplicar como mínimo las medidas de protección y
contención de nivel 2, excepto que se trabaje con
microorganismos con un riesgo superior. (Doc 1.5)
 1.4.2.- SEGURIDAD QUÍMICA:
• Muchos de los reactivos utilizados en estos
laboratorios son sustancias peligrosas que se
encuadran dentro de distintas categorías y niveles.
• Las buenas prácticas de laboratorio referidas a
seguridad química deben incluir medidas para:
– Prevenir la exposición del personal a estas sustancias,
entendiendo por exposición el contacto con ellas por
penetración cutánea, inhalación o ingestión.
– Su almacenamiento seguro.
– Gestión eficiente de los residuos que generen.
El REGLAMENTO (CE) 1272/2008 desarrolla un nuevo sistema de
etiquetado para las sustancias y mezclas químicas.
Este reglamento se desarrolla en España mediante el RD
717/2010, DE 28 DE MAYO: NUEVO SISTEMA DE ETIQUETADO.
El RD establece los siguientes plazos para que las sustancias y las
mezclas lleven el nuevo etiquetado:
SUSTANCIAS:
•Nuevas puestas en el mercado → 01/12/2010.
•Puestas en el mercado antes del 01/12/2010 → 01/12/2012.
MEZCLAS:
•Nuevas puestas en el mercado → 01/06/2015.
•Puestas en el mercado antes de 01/06/2015 → 01/06/2017.
• El nuevo sistema de etiquetado
establece los siguientes tipos de peligro:
– PELIGROS FÍSICOS.
– PELIGROS PARA LA SALUD.
– PELIGROS PARA EL MEDIO
AMBIENTE.
• Y los divide en:
– Clases: tipos de peligro.
– Categorías: nivel del peligro.
• NUEVA TERMINOLOGÍA:
– Preparados → Mezclas.
– Frases R → Frases H.
– Frases S → Frases P.
• Estas medidas se establecerán con base en el catálogo de
productos utilizados en el laboratorio y de acuerdo con la
Ficha de Datos de Seguridad (FDS) específica de cada
producto.
• La FDS aporta información de hasta 16 apartados relativos a
la composición, manipulación, peligros, vías de exposición,
efectos tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros
auxilios.
• La FDS debe ser suministrada obligatoriamente por el
distribuidor del producto y debe guardarse en el laboratorio
para su posible consulta.
 Medidas genéricas:
• Utilización de los EPI adecuados a las posibles vías de exposición de cada
producto.
• Prohibición de pipetear con la boca.
• Manipulación de productos volátiles en el interior de campanas de
aspiración de gases.
• Manipulación de productos inflamables alejados de fuentes de calor y
llamas.
• Correcto etiquetado de todos los envases que contengan agentes
químicos, incluyendo las soluciones stock y de trabajo preparadas en el
laboratorio a partir de productos puros. El etiquetado debe incluir, como
mínimo, el nombre del producto, la fecha de preparación y el pictograma
de peligro, en su caso.
• Almacenamiento de los productos químicos en armarios adaptados a sus
características de peligrosidad y respetando siempre las
incompatibilidades
Ejemplos de sustancias peligrosas

• INFLAMABLES: alcoholes
• TÓXICOS Y MUY TÓXICOS: acrilamida, bromuro
de etidio…
• CARGINÓGENOS: acrilamida, formaldehido….
• MUTÁGENOS: acrilamida, bromuro de etidio…
• TERATÓGENOS Y O PERJUDICIALES PARA LA
FERTILIDAD: acrilamida, formamida…
 1.4.3.- EQUIPAMIENTOS Y
NORMAS DE SEGURIDAD:
• La distribución del laboratorio, las instalaciones, la
señalización y el equipamiento deben ser los adecuados
para minimizar y prevenir los riesgos comunes a cualquier
laboratorio.
– Deben disponer de instalaciones de emergencia
convenientemente señalizadas, como duchas de emergencia,
lavaojos, extintores, etc.
– Estar dotados con los EPI adecuados, según las muestras que
se manipulen y los procedimientos que se desarrollen,
como guantes, batas desechables, gafas de seguridad,
mascarillas, pantallas, etc.
• Deben tener instalaciones adecuadas para el
almacenamiento de sustancias tóxicas y peligrosas,
como armarios para inflamables y armarios específicos
para sustancias químicas tóxicas y corrosivas.
• Deben tener contenedores adecuados para la recogida
selectiva y la clasificación de residuos.
• Deben disponer de kits para recogida de derrames de
productos químicos y citotóxicos.
• Debe contar con un manual de seguridad y un plan de
gestión de residuos.
NORMAS DE COMPORTAMIENTO
DEL PERSONAL:
• Lavado frecuente de manos.
• Utilización de los EPI adecuados.
• Uso de ropa de trabajo adecuada y abrochada, evitando, en lo posible,
las mangas anchas, los colgantes, los zapatos abiertos y la ropa que deje
al descubierto una parte importante del cuerpo.
• Prohibición de comer, beber, fumar y maquillarse.
• Uso de gafas de seguridad cuando se llevan lentes de contacto.
• Prohibición de pipetear con la boca.
• Recibir la formación adecuada para el manejo de los aparatos.
• Conocer el plan de gestión de residuos y el manual de seguridad del
laboratorio y cumplir las normas de actuación que recogen ambos do
cumentos.
 1.4.4.- EL MANUAL DE
SEGURIDAD:
• Documento de obligado conocimiento de todo el personal
del laboratorio y debe contener:
– Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto de trabajo
en el laboratorio.
– Descripción y normas de utilización del equipamiento de
seguridad del laboratorio (cabinas de bioseguridad, cabinas de
aspiración de gases, EPI, etc.).
– Hábitos de trabajo apropiados para minimizar los riesgos de
exposición.
– Normas de almacenamiento de productos químicos.
– Normas para la eliminación de desechos y gestión de residuos,
incluyendo los derrames.
– Normas de actuación en casos de emergencias, accidentes
biológicos y accidentes químicos.
1.4.5. GESTIÓN DE RESIDUOS:

• El plan de gestión de residuos tóxicos y peligrosos

debe incluir medidas para:
– La recogida selectiva.
– La clasificación.
– El almacenamiento temporal de residuos hasta su
recogida por una empresa gestora.
 MEDIDAS QUE SE DEBEN
ESPECIFICAR:
• Residuos biosanitarios especiales.
– Entre este grupo o clase de residuos se incluyen los
objetos punzantes y cortantes que han estado en
contacto con productos biológicos, cultivos
microbiológicos y material contaminado con los
mismos, cultivos celulares, grandes cantidades de sangre
y otros líquidos biológicos, etc.
• Residuos químicos. Se incluyen los envases que han
contenido productos químicos, reactivos caducados
o innecesarios, los EPI contaminados, los filtros de
cabinas de aspiración de gases, los derrames, etc.
• Residuos citotóxicos. Incluye los restos de productos
carcinógenos, mutágenos y teratógenos, así como
los envases que los hayan contenido.

• Residuos radiactivos.
• Como norma general, los residuos se recogen en:
– Contenedores para los residuos sólidos.
– Garrafas en el caso de residuos líquidos.
• Y deben cumplir con:
– Estar homologados y ser específicos para cada tipo de
residuo.
– Ser diferenciados normalmente por código de color.
– Estar perfectamente etiquetados.
• No se deben llenar más de 2/3 de su capacidad y deben
cerrar herméticamente.
• El plan de gestión de residuos debe especificar las normas
de actuación en caso de derrames.
 DERRAMES:
• Neutralización: Depende de las características químicas del producto
derramado.
• Absorción. El material absorbente que se use dependerá de la naturaleza
del derrame. Algunos ejemplos son:
– Serrín para líquidos no inflamables ni tóxicos ni corrosivos.
– Carbón activo, para líquidos inflamables, tóxicos o corrosivos.
– Absorbentes-neutralizadores comerciales, para cualquier derrame
líquido según indicaciones de la casa comercial.
– Celulosa para absorber directamente derrames de pequeños.
• Eliminación. El residuo se introduce en un envase adecuado y se elimina
en el contenedor específico.
– Los derrames de productos en polvo se recogen directamente, evitando la
formación de aerosoles y de polvo en suspensión.
•
 Durante la realización de la
actuación ante un derrame:

• Debe restringirse el acceso al laboratorio.

• Las personas responsables de la recogida deben
estar equipadas con los EPI adecuados al producto
derramado.
• Se debe tener especial cuidado con derrames de
líquidos inflamables y volátiles.