CATEDRA DE BIOLOGA MOLECULAR

PRACTICA N 4
EXTRACCION DE DNA CROMOSOMAL PROCARIOTA
Y RNA DE ROTAVIRUS

1. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
- Realizar la extraccin el DNA cromosomal procariota y RNA rotavirus e
identificar mediante electroforesis.

OBJETIVO ESPECIFICOS
- Obtener el material gentico de la bacteria primero por rotura de la
pared bacteriana.
- Eliminar su forma nativa y posteriormente aislando el DNA.
- Conocer cada una de las funciones de los reactivos utilizados en la
prctica.
- Dar una lectura correcta en la corrida electrofortica del DNA extrado
para llegar a una buena conclusin.

2. EQUIPOS

Microcentrifugadora
o Modelo: sigma 1-14
o Marca: laborzentrifugen
o Volt: 220-240
o Hz: 50 60



3. PROCEDIMIENTO
1. Aadir tres volmenes del cultivo bacteriano


3 volmenes
de cultivo
bacteriano




2. Centrifugar aproximadamente 3 ml de cultivo bacteriano en tubos
Eppendorf, en una microcentrifugadora a 5000rpm/2 min.




Disolver el sedimento en 1ml de agua destilada estril.
Agregar 250ul de SDS al 10% a la suspensin del sedimento


Llevar al bao mara de 60 a 70C por 15min.
Dejar, en bao de hielo por exactamente 15 min.


Centrifugar
a 5000 rpm
por 2 min.

Agregar cuidadosamente a la parte superior del tubo 3ml de alcohol etanol
al 95% o isopropanol. Se presenta 2 fases la interfase se presenta un
precipitado de compuesto de DNA y protenas.




Enrollar por inmersin el DNA con una varilla y depositar en 200ul de tampn TE.


Agregar el mismo volumen de fenol-cloroformo y mezclar y llevar a la centrifuga
Mezclar por
inversin





1) Extraer la fase acuosa en otro tubo y agrgar dos volmenes al alcohol y
mesclar por inmersin y dejar de 5min en -20C.



Centrifugar a 12000 rpm por 10 min y desechar el alcohol por inmersin.
Secar el tubo por 30min y agregar 200ul de tampn TE.
Guardar a 4C para realizar la electroforesis.

RESULTADOS






Centrifugar a
5000 rpm por 2
min.





Se puede observar la extraccin cromosomal pero como se indica tiene mucha
protena las cuales la vuelven pesadas y no dejan que el dna logre su buena
corrida electrofortica para asi identificar sus bandas respectivas.









Discusin
En esta practica como fue el objetivo extraer el dnacromosomal se lo logro pero
con muchas impurezas.
Como se observa en la siguiente imagen debimos obtener una corrida
electrofortica similar pero no fue posible, creyendo que durante el procedimiento
tambin tuvimos una equivocacin al agregar el alcohol absoluto porque lo hicimos
de golpe y no como indicaba el procedimiento.
Segn lecturas de trabajos realizados se podra tratar del uso del alcohol absoluto
porque en muchos de ellos recomiendan el alcohol isoamilico, este, por su
cadena carbonada mayor que del alcohol absoluto ayuda a separar con mayor
efectividad a las protenas y asi podramos contar con un DNA mejor separado.

CONCLUSIONES
CONCLUSION GENERAL:
- Realizamos la extraccin el DNA cromosomal procariota y RNA rotavirus
e identificamos mediante electroforesis.

CONCLUSIONES ESPECIFICA:
- Obtuvimos el material gentico de la bacteria (DNA) primero por rotura
de la pared bacteriana con SDS.
- Eliminar su forma nativa gracias al cambio de temperaturas bruscas y
posteriormente aislando el DNA.
- Conocimos cada una de las funciones de los reactivos utilizados en la
prctica.
- Obtuvimos la interpretacin de la lectura correcta en la corrida
electrofortica del DNA extrado gracias a la grfica.


CUESTIONARIO
1. Por qu se establecen dos fases con fenol?
R. por diferencia de densidades y por su capacidad para degradarproteinas. las
proteinas se eliminan usando fenol (las proteinas pasan a la fase organica y el
DNA a la fase acuosa)
2. Por qu se establecen dos fases con alcohol?
R. Porque el alcohol es polar. El alcohol se utiliza para precipitar el DNA que es
soluble al agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en
la interface entre el alcohol y el agua.

3. Cul es la composicin del shampoo utilizado?

R. Agua desmineralizada
Lauril ter sulfato de sodio
Cocamidopropilbetaina
Cloruro de sodio
cido ctrico
Hidrxido de sodio
Trietanolamina
Formaldehido
Dixido de tianio.

4. Cul es la accin del calor?

El calor ayuda a la accin del SDS sobre las protenas ya que este detergnete
ayuda a que las DNAsas no destruyan al DNA. El calor solubiliza los lpidos y
desnaturaliza las protenas y el frio inactiva a las enzimas.
5. Cul es la accin del SDS sobre las protenas?

R. El SDS acta rompiendo enlaces no covalentes en las protenas,
desnaturalizndolas, provocando que estas molculas proteicas pierdan su
conformacin nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del
polipptido. La repulsin electrosttica creada por la unin del SDS a la protena
es uno de las causas de que la protena pierda su conformacin nativa,
eliminndose de este modo las diferencias en conformacin de las diferentes
protenas que han de ser separadas en el gel.



6. Cul es la accin del SDS sobre los lpidos?
R. El SDS por el hecho de ser un detergente inico acta solubilizando lpidos, al
tener una cadena ramificada.

7. Haga un esquema de una bacteria y seale las estructuras que son
atacadas por los reactivos utilizados en el protocolo.
Triton,detergente ms fuerte que
rompe los puentes disulfuro
Betamercaptoetanol, desnaturaliza
a las protenas y tambin destruye
a las ribosimas

La T de 60 abre la
membrana para que salga el
RNA vrico.








8. Cuntas bacterias por mL tiene un cultivo saturado de bacterias?
R. Sabemos que hay 10E
9
Bacterias en un mL de cultivo saturado.
En la prctica se utiliz 3mL entonces:
10E
9
Bacterias 1mL
X Bacterias 3mL


X=3000000000 bacterias presentes en 3 mL de cultivo saturado

X= 3E
9
bacterias presentes en 3 mL de cultivo saturado

Fenol-cloroformo, arrastrara todas las
protenas como restos celulares y otros
y los precipitara en una fase orgnica

SDS. Saponificara a
los lpidos de la
membrana celular

9. Cuantos gramos de DNA posee una bacteria, y cuantos gramos se
obtendr en el protocolo utilizado?
R. En una Bacteria hay:
=

X= 1,767x10E
-13
gramos de DNA/Bacteria

En el protocolo se utiliz 3mL de Bacterias y se obtendr:

X=5,30x10E
-4
gramos de DNA

10. En el protocolo de extraccin de RNA hay algn paso dnde se separa
el DNA cromosomal?
R.- Esto sucede en el paso 8 cuando se le agrega fenol-cloroformo y
posteriormente se lo centrifuga a 5000 rpm por dos minutos, ya que despus de
ese tiempo se formaran dos fases y el DNA cromosomal se encontrara en la fase
orgnica que precipitara por la accin del fenol-cloroformo, tambin protenas,
restos celulares lpidos y otros.
11. Qu caracterstica le da al RNA rotaviral una gran estabilidad con
frecuencia a otros cidos nucleicos?
R.La estabilidad es debida a la capa externa que posee esta capa externa
depende de la concentracin de Ca
2+
. La incubacin de rotavirus en un medio
caracterizado por concentraciones bajas en Ca
2+
, de 10nM a 1M segn la cepa,
induce la solubilizacin de las protenas externas. Este tratamiento genera
partculas virales de doble capa proteica que no son infecciosas. Una serie de
resultados apuntan a VP7 como el sitio de fijacin de Ca
2+
en la cpside. Por otra
parte, la incubacin del rotavirus en presencia de tripsina induce el clivaje de VP4
en VP5 y VP8 lo cual favorece la infectividad.
No presentan envoltura lipdica y la estructura de su cpside ha sido ampliamente
estudiada por mtodos de cro-electromicroscopa y tratamiento de imgenes. Es
un icosaedro constituido de 6 protenas organizadas en tres capas proteicas
concntricas. El ncleo central est constituido por una capa ms interna formada
por VP2, que encierra 11 segmentos de RNA de doble cadena y dos protenas
minoritarias, VP1 y VP3. La capa intermediaria constituida por VP6 hace contacto
con VP2 por su lado interno y con las protenas externas VP4 y VP7. VP7
representa la proteina mayoritaria de la ltima capa, atravesada por espculas
formadas por dmeros de VP4.


12. Cul es la clasificacin del rotavirus, debido a su perfil electrofortico?
R. Los rotavirus constituyen un gnero de la familia Reoviridae que contienen un
genoma segmentado de ARN de doble cadena. Es un virus no-envuelto que mide
70 nm de dimetro. El nombre de rotavirus viene del latn rota que significa rueda -
por su semejanza a una rueda de carreta al ser observado en el microscopio
electrnico-. El virin de rotavirus tiene una estructura formada por tres capas
concntricas de protenas que encierran al genoma, constituido por 11 segmentos
de ARN de doble cadena (ARNdc). El genoma presenta patrones caractersticos
para cada tipo de cepa (humana o animal), cuando los segmentos son separados
por electroforesis en geles de poliacrilamida y son llamados electroferotipos. La
posibilidad de distinguir aislados de rotavirus por electroforesis ha sido muy
utilizada en estudios de epidemiologa molecular, as como estudios de epidemias
y de brotes de infecciones nosocomiales. La naturaleza segmentada del genoma
de rotavirus ha constituido la base fundamental para el estudio de las propiedades
moleculares de las protenas virales, su caracterizacin y sus funciones. Tambin
constituye la base del mecanismo ms comn de evolucin del rotavirus,
denominado rearreglo gnico o "shift" (intercambio de genes entre cepas) y es la
base para el desarrollo de la primera vacuna que ha salido al mercado y de otras
en desarrollo.
Cada segmento es un gen y codifica para una protena, 6 protenas estructurales y
5 no estructurales. La protena ubicada en la capa intermedia (VP6) presenta
caractersticas antignicas que permiten la clasificacin del rotavirus en 7 grupos
(A hasta el G) que son indistinguibles al microscopio electrnico pero se
diferencian antignicamente por la tcnica de Elisa. Los grupos de rotavirus A, B y
C han sido encontrados en humanos y animales y los grupos D, E, F y G infectan
solamente a los animales (pollos y cochinos), pero el grupo A es el ms comn y
el de mayor importancia epidemiolgica. A su vez, este grupo se clasifica en dos
sub-grupos (I y II) que coinciden con dos tipos de patrones de migracin
electrofortica de sus genes (patrn corto y largo) confirmado por estudios de
hibridacin molecular de ARN. Estos estudios ratificaron la existencia de 2
grandes familias de acuerdo a su homologa gentica:
1. La familia de virus parecidas a las cepas prototipos o estndar DS-1 (sub-
grupo I).
2. La familia de virus parecidas a las cepas prototipos Wa (sub-grupo II).
En la capa ms externa se encuentran las protenas VP4 y VP7 que tienen
actividad neutralizante y definen la clasificacin binaria de los rotavirus del grupo A
en serotipos y genotipos. Hasta el presente se han determinado 14 serotipos G
(por glicoprotena) y 21 genotipos P (por proteasa), de los cuales 10 serotipos G y
7 genotipos P son humanos.


BIBLIOGRAFIA
1. http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico
2. http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleico
3. http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
4. http://www.ferato.com/wiki/index.php/Rotavirus
5. http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-21198-0_309#page-1