CURSO BASICO DE

INMUNOHISTOQUIMICA
Diana Mora T.M, Msc
 INMUNOHISTOQUIMICA
El Principio se conoce dese 1930
Los primeros ensayos se reportaron en 1942 por Coons et al. en la
identificación de antígenos de Pneumococos en tejidos infectados
Desde entonces se han hecho mejoras con la conjugación de proteínas,
la fijación del tejido, marcadores y la microscopía en sí.
La IHQ se ha convertido en una herramienta esencial para los
laboratorios de Patología
Adicion de peroxidase de ¨horseradish¨
Técnica de Peroxidasa anti-peroxidasa en 1979
Uso del complejo Avidina & Biotina en los años 80’s

Diana Mora T.M, Msc

Generalidades

El Principio combina la
histología con la
inmunología y técnicas
bioquímicas para la
identificación de antígenos
específicos en tejidos
Utiliza la reacción antígeno
anticuerpo marcada con un
colorante o cromógeno
visible.
 Que Antígenos celulares pueden
ser detectados?

iytoplasmicos
Nucleares
Membrane celular
Lipidos
Proteinas
Localizacón de las celulas que son señaladas
 Generalidades.

La respuesta del cuerpo a la introdcción

de un agente extraño es conocida como
respuesta inmune, resulta en la
Fab
producción de anticuerpos
region

Paratope
Los Anticuerpos se unen fuertemente y + Epitope
especificamente a los "epitopes"
epitopes
(estructura específica) sobre un
"antigeno"
antigeno (molécula or estructura
extraña).
Ab-Ag complex
Generalidades.
PARTE I

1.CONCEPTOS BASICOS DE LOS ANTICUERPOS

• Generalidades
• Tipos de Anticuerpos según su producción
• Características

2.ENZIMOLOGIA BASICA
Locate cells that are signaling
ANTICUERPOS (Generalidades)

– SON EL EJE PRINCIPAL DE LA IHC Y POR ESO ES

IMPORTANTE CONOCER SU POTENCIAL Y
LIMITACIONES.
– PERTENECEN: GRUPO DE PROTEINAS-
INMUNOGLOBULINAS
– 5 CLases IgG, A,M,D,E
– Dos cadenas pesadas que difieren en estructura y antigenicidad
(determinan las clases y subclases de las moléculas)
- Dos cadenas ligeras(kappa y lambda)
- Puentes disulfuros intracatenarios que estabilizan las moléculas
Tipos de Anticuerpos (producción)

Anticuerpos Policlonales:
– Son producidos en diferentes células por
inmunización antígénica que induce a la producción de Ig por
el estímulo de linfocitos B.
– Animales frecuentemente usados : gallinas, cabra,
hamsters, caballos, ratones, ratas, conejos y ovejas. El conejo
es el mas usado por su fácil cuido y alta producción.
– Reconocen diferentes epítopes del mismo antígeno.
– Los que los hace inmunoquímicamente diferentes
 Tipos de Anticuerpos (producción)

Anticuerpos Monoclonales.
– Producidos por una clona –célula plasmática individual
– Inmunoquímicamente idénticos
– Ratón (económico)
– Reconocen un epítope específico del antígeno
– Ventajas sobre policlonales
alta homogeneidad
ausencia de anticuerpos no específicos
cambio mínimo de variabilidad de lote a lote
Características de los Anticuerpos

AFINIDAD
• Se utiliza para describir tanto la afinidad
intrínseca y funcional de los Anticuerpos.
• La afinidad intrínseca de un Ac reside en la
secuencia de a.a de la región Hipervariable
(la misma que determina la especificidad)
Interacciones iónicas, puentes de hidrógeno
y fuerzas de van der Waals intervienen en las
uniones de Ag y Ac.
Características de los Anticuerpos
AFINIDAD
• La afinidad funcional es definida en IHC como el tiempo
requerido para llegar al equilibrio de la unión del Ag-Ac.
• Las reacciones de Ag –Ac son reversibles cuando:
Hay baja afinidad funcional
Lavados con altas concentraciones de sales, altas
temperaturas y ph muy bajos)
• Ac policlonales: poseen espectros variables de baja y alta
afinidad a diferentes epítopes del Ag.
• Ac monoclonales: poseen afinidad uniforme.
• Excesiva fijación en formalina aumenta las cargas
electrostáticas negativas.(se corrige con la recuperación de
Ag)
Características de los Anticuerpos

REACTIVIDAD CRUZADA.
• Actividad inmunoquímica que puede ocurrir entre un Ac y
uno o dos Ag y viceversa.
• Antígenos humanos con idénticos o similares Ag de otras
especies.

TIEMPO DE REACCION DE AC.

• Depende del tamaño del tejido fijado, concentración del Ac,
temperatura ambiente.
• Los tiempos de incubación pueden llegar hasta 48 horas para
alcanzar la reactividad máxima.
• 10-30 minutos mas utilizado
Características de los Anticuerpos

Otras características Importantes:

• Temperatura de incubación: ambiente, 37°C y 4°C (overnight-
cámara húmeda)
• Estabilidad de los Ac.(concentrados y listos para usar)
• Envases (polipropileno, policarbonato o vidrio de boro silicato)
que eviten la polimerización de las proteínas y la absorción.
• Temperatura de almacenaje: 2-8 °C
• Título de los Ac.
Policlonales: 1:100 a 1:2000
Monoclonales: 1:10 a 1:1000
Características de los Anticuerpos

Otras características Importantes:

• Correctas diluciones
-.Seleccionar un tiempo de incubación adecuado.

-Realizar diluciones experimentales seriadas. Por ejemplo 1:10

y luego sucesivamente diluciones de 1:2.

-Estandarizar la cantidad de sol diluida a ser aplicada en el

tejido (0.1 ml a 0.4 ml)
Características de los Anticuerpos

Otras características Importantes:

• Correctas diluciones
-Escoger un buen diluyente (los Ac monoclonales son
mas sensitivos a los Ph e iones de los diluyentes)
-Un ph de 6.0 para la gran mayoría de los Ac. es
funcional.
-Uso de micropipetas adecuadas y pipetas serológicas
para volúmenes mayores de 1.0ml.
-Cálculo correcto de las diluciones.
ENZIMOLOGIA
– La IHC utiliza reacciones de enzima –substrato para obtener producto
cromogénico.
– Las enzimas poseen una eficiencia catalítica extremadamente alta.
1 mole de enzima puede catalizar de 10,000 a 1 millón de moles
de substrato por minuto.
- La actividad enximática depende de:
- Concentración de la enzima
- Concentración del substrato
- pH
- Concentración de sales en el buffer
- Luz y temperatura
ENZIMOLOGIA

PEROXIDASA DE RABANO PICANTE (HRP)

SUSTRATO:PEROXIDO DE HIDROGENO(CATALISIS-
DONACION DE ELECTRONES)
CROMOGENOS: DAB, AEC(3-amino-9-ethylcarbazole ,
CN,

FOSFATASA ALCALINA DE INTESTINO DE

BECERRO(AP)
SUSTRATO: ESTER NAFTOL FOSFATO(HIDROLISIS)
CROMOGENOS: FAST RED (NAFTOL AS-MX
FOSFATO)
NEW FUCHINA, NBT, INT (iodo-nitrotetrazolium
Violet)
PARTE II

3. FIJACION Y PROCESAMIENTO
• Fijación
• Conceptos Básicos del procesamiento
(deshidratación, parafinización,corte,montaje,
desparafinización )
4. RECUPERACION ANTIGENICA

5. METODOS DE TINCION
FIJACION

• Indicada para prevenir la elución y degradación de los Ag.,

Debe preservar la posición de los Ag.(nuclear, citoplasma,
membrana) y conservar lo más posible las estructuras
secundarias y terciarias de los Ag.
• Relación muestra: fijador (1:20 (15 a 20 veces el fijador)
• Tiempo de fijación apropiado es de 6 horas a 72 horas
(ASCO/CAP) HER2, ER ,PRG
• 24 horas de fijación (70% en ethanol-preservar Ag)

Proteína in vivo proteína fijada

FIJACION

FIJADOR: Formalina-penetra rápido y fija lentamente

FORMALINA BUFERADA NEUTRA 10% A Ph 7.0
excelente fijador para pequeñas moléculas como las hormonas.

Formalina (40% de formaldehído) 100 ml

Fosfato de Sodio Dibásico anhidro 6.5 g
Fosfato de Sodio Monobásico 4.0g
Monohidratado
Agua destilada 900 ml
FIJACION

OTROS FIJADORES:
• B5 Y ZENKER´S (CLORURO DE MERCURIO-
TOXICO)
• FIJADORES ALCHOHOLICOS (CARNOYS, METHACARN)
usados para evitar la perdida de antigenicidad por excesiva fijación
con formalina.
• ACETONA: Tejidos congelados (5 segundos a 10 minutos y
rehidratada en buffer por 5 minutos)
PRINCIPIOS BASICOS EN EL
PROCESAMIENTO

• No procesar los tejidos a temperaturas mayores a los 60°C

• Deshidratar los tejidos en alcoholes
• Infiltrar el tejido en parafina líquida entre 56 a 58°C
• Las secciones de tejido deben ser cortadas de 3 a 4 micrones de
espesor
• Flotar los tejidos en un baño de agua
• Colocar los tejidos en placas cargadas positivamente, silanizadas
o poli-L-lisina.(evita que los tejidos se desprendan)
PRINCIPIOS BASICOS EN EL
PROCESAMIENTO

• Desparafinización.
– Colocar en el horno a 60°C por 30 minutos (suaviza la parafina)
– Baño 1 con Xylol 3 minutos (no mas de 50 placas x 250 ml)
– Baño 2 con Xylox 3 minutos
– Baño 3 Alcohol absoluto(95-96%) 3 minutos
– Baño 4 alcohol absoluto(95-96%) 3 minutos
– Baño 5 ethanol 95% 3 minutos
– Baño 6 ethanol 95% 3 minutos
– Coloque las láminas en agua destilada 30 segundos
– No deje secar y guárdelas en buffer hasta que sean teñidas
RECUPERACION ANTIGENICA

• Es necesaria porque los procesos de fijación, parafinización y

desparafinización enmascaran los epítopes antigénicos.
• Los primeros recuperadores utilizados fueron las enzimas
proteolíticas (pepsina, proteasa, proteinasa K etc) Riesgo de destruir
algunos epitopes.
• Buffer mas comunmente utilizados
Buffer citrato a ph 6.0
tris HCL 0.01 M ph 1-10
RECUPERACION ANTIGENICA

• Aplicación de calor para recuperación de Ag.

-ollas para microondas
-autoclaves
-vaporeras
-baños de agua
-ollas de presión
(mayor producción)
RECUPERACION ANTIGENICA

• Tiempo de recuperación
20-30 minutos de calor
20-30 minutos de enfriamiento

El calor revierte el daño causado

Por la fijación (no se conoce exactamente como)
-bases de Schiff (uniones reversibles)
que reestablecen la propiedad inmunoquimica
METODOS DE TINCION

Los primeros métodos son introducidos en 1968 (sobrepuso los

obstáculos de los métodos con fluorescencia y fue el inicio de
la IHC moderna
METODO DIRECTO
METODOS DE TINCION

METODO DEL COMPLEJO PEROXIDASA ANTI

PEROXIDASA
 METODOS DE TINCION

METODO DE AVIDIN-BIOTIN (1981)

Basado en la afinidad de la avidina (huevo de pollo) y
de la estreptavidina (Streptomyces avidinii) por la
vitamina Biotina
 METODOS DE TINCION
METODO DE ESTREPTAVIDIN-BIOTIN (LSAB)
 , METODOS DE TINCION

METODO DE POLIMERO-ENVISION
ENVISION FLEX Y ENVISION FLEX +
METODOS DE TINCION

METODO DE SEÑAL AMPLIFICADA (TIRAMIDIL) CSA

METODOS DE TINCION

METODO DE SEÑAL AMPLIFICADA (TIRAMIDIL) CSA II

METODO DE TINCION

METODO DE DOBLE TINCION

METODO DE TINCION (No. de etapas
vs sensibilidad)
AUXILIARES

BLOQUEADORES DE ENZIMAS ENDOGENAS.

• Se utilizan para bloquear las enzimas que reaccionan con los
cromógenos. (Peróxido al 3% - Levamisole)
• Pueden colocarse después del anticuerpo primario y antes
del complejo enzimático
AUXILIARES (Bloq. De enzimas
endógenas)
AUXILIARES
AUXILIARES

BLOQUEADOR DE PROTEINA.
• Cuando se presenta mucha tinción de fondo es aconsejable
bloquear posibles uniones inespecíficas con un bloqueador
de proteína
AUXILIARES

BLOQUEADOR DE BIOTINA.
• INHIBE LAS UNIONES INESPECÍFICAS POR
PRESENCIA DE BIOTINA ENDOGENA EN SISTEMAS
QUE UTILIZAN EL COMPLEJO AVIDIN-BIOTIN.
AUXILIARES

DILUYENTE DE ANTICUERPOS
Son fluídos inertes o reactivos usados para diluir un Ac.
Buffer cerca de pH 7.0-7.2.

Tipos de Diluyentes
• Diluyentes con tris HCL, detergente y estabilizantes
• Diluyentes con reductores de backgrouns(BSA, suero normal
o proteínas)
AUXILIARES

BUFFER DE LAVADO
Ideales para remover el exceso de
reactivos o complejos no deseados.
• tris buffer salina (TBS)
• Buffer salina fosfato (PBS)
Almacenaje apropiado : 5 días después
de preparado a 25°C
*También se pueden usar bufferes
especiales para eliminar
background
AUXILIARES

Incrementadores del DAB

• Agua destilada
• Agua de la pluma
• DAB enhancer
CONTROL DE CALIDAD EN IHC

LAS TECNICAS DE LABORATORIO DEBEN SER SIEMPRE CONTROLADAS

PARA EMITIR RESULTADOS AJUSTADOS A LA REALIDAD.

LA IHC NO SE QUEDA ATRÁS:

• MANEJO DE LOS TEJIDOS (ESTANDARIZAR TODOS LOS PROCESOS)
• FIJACION (FIJADOR, TIEMPO)
• TAMAÑO DE LAS MUESTRAS
• PARAFINIZACION
• USO DE PLACAS ADECUADAS
• DESPARAFINIZACION
• PRETRATAMIENTO
• ADECUADA DILUCION DE LOS AC
• ESTANDARIZAR LAS DILUCIONES DE AC INDIVIDUALMENTE
• USO DE CONTROLES ADECUADOS (CONTROLES POSITIVOS)
• USO DE CONTROLES NEGATIVOS
• VALIDACION DE LA TECNICA DE TINCION
CONTROL DE CALIDAD EN IHC

USO DE CONTROLES

CONTROLES DE REACTIVOS.
• Nos permite evaluar el Ac
primario (uniones inéspecíficas)
• Usar un Ac del mismo isotipo de
la misma especie del Ac, que no Ac Ig G (CN)
reaccione con el tejido en estudio.
• Deben ser aplicados en forma
secuencial por cada muestra de
paciente
CONTROL DE CALIDAD EN IHC

USO DE CONTROLES
CONTROLES DE TEJIDO.(deben ser fijados e incluídos idénticamente a
la muestra en estudio)
CONTROLES POSITIVOS
Son tejidos que poseen el Ag en estudio, se corre por Ac
internamente o por separado.

CONTROLES NEGATIVOS
Son tejidos que no poseen el Ag en estudio, se corren por Ac
internamente o por separado
Evalúan especificidad del Ac y uniones inéspecíficas.
CONTROL DE CALIDAD EN IHC

USO DE CONTROLES
CONTROLES INDICADORES DE PROCESOS
Para evaluar principalmente el procesamiento del tejido

USO DE LA VIMENTINA: presente en casi todos los tejidos y

posee epítopes susceptibles a la fijación con formaldehído y puede
funcionar como un reportero para evaluar la calidad de la fijación.
PROCESAMIENTO CORRECTO: distribución uniforme de
la reactividad de la Vimentina en los vasos tisulares y
células estromales.
PROCESAMIENTO INADECUADO: Tinción heterogénea
CONTROL DE CALIDAD
CONTROL DE CALIDAD EN IHC

CONTROL DE LÍNEAS CELULARES (HERCEPTEST)

CONTROL DE CALIDAD EN IHC

PROGRAMAS DE CONTROL
• United Kingdom national External Quality Assesment Service (UK
NEQAS) (cáncer de mama)
www.ukneqas.org.uk

• College of American Pathologists (CAP)

www.cap.org

• Nordic Inmunohistochemical Quality Control (NordiQC)

www.nordiqc.org
Gracias!