ESTABILIZACIÓN

ENZIMÁTICA POR
INGENIERÍA PROTEICA

Teresa de Diego Puente

2007
 ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA
Alumnos: Segundo Curso de la Licenciatura de Bioquímica

TEMA: ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA

PROTEICA

SÍNTESIS BIOCATALÍTICA

BIOQUÍMICA INDUSTRIAL

DEPARTAMENTO
DEPARTAMENTO DE
DE BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA Y
Y BIOLOGÍA
BIOLOGÍA MOLECULAR
MOLECULAR “B”
“B” E
E INMUNOLOGÍA
INMUNOLOGÍA
 ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA

DESCRIPTORES

► Tipos de Biocatalizadores.
► Estabilidad y Estabilización.
► Diseño del Medio de Reacción.

► Aplicaciones en Síntesis Orgánica, Química

Fina y Biomedicina.
Biocatalizador Medio Reactor
 ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA

OBJETIVOS GENERALES

1. Fundamentos de la estructura y estabilidad de los

biocatalizadores.
2. Estabilización de los biocatalizadores.
3. Catalizadores semisintéticos
4. Empleo de Medios no convencionales
5. Diseño de un proceso biocatalítico de intéres
industrial.
 ASIGNATURA SíNTESIS BIOCATALÍTICA

OBJETIVOS GENERALES

2. Estabilización de los biocatalizadores.

Tema 4. Modificación química de biocatalizadores.

Tema 5. Inmovilización de biocatalizadores.
Enzimas. Células. Orgánulos.
Tema 6. Estabilización enzimática por ingeniería
proteica
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

CONOCIMIENTOS PREVIOS

⇒ Conocimientos de estructura de proteínas y función

de enzimas, de termodinámica y de química orgánica.

⇒ Conocimientos básicos de las técnicas de ingeniería

genética o DNA recombinante.
 Estabilización enzimática
por ingeniería proteica.
Primer curso Segundo curso
Metodologías de
Enzimología investigación
bioquímica

Estructura de Dinámica de
macromoléculas Macromoléculas

Técnicas de Bioquímica
experimentación Industrial
bioquímica

Genética molecular e CONOCIMIENTOS

ingeniería genética TRANSVERSALES
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA
OBJETIVOS

1. Definir la estabilización enzimática por Ingeniería de

Proteínas.

2. Conocer las tecnologías que se precisan para el

desarrollo de un proceso de Ingeniería Proteica por
diseño racional.

3. Comprender las bases de un procedimiento de

evolución molecular dirigida de proteínas
termoestables .

4. Aplicaciones y Perspectivas Futuras.

 ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS

ENZIMA
ESTABILIZADA

Ingeniería
Modificación Ingeniería
del Medio Inmovilización
Química Proteica
de Reacción
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILL
TGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLN
DTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGL
MODIFICACIÓN DE
VAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPL
DALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPT SU SECUENCIA
TNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQA
VCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQAR
SADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAA
AMINOACÍDICA
IVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

ENZIMAS
ESTABLES
INTRÍNSECAMENTE
ESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTE
YMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTG
SALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQACGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALR
STTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

ENZIMAS ESTABLES
INTRÍNSECAMENTE
 ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA
MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

Rediseño de Proteínas

I. Diseño Racional por

Mutagénesis dirigida

II. Evolución Molecular dirigida

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS
DNA
ESTRUCTURAL
RECOMBINANTE
1
3

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 4
5
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS DNA
ESTRUCTURAL RECOMBINANTE
1 3

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 5
6
ANÁLISIS ESTRUCTURAL

► Difracción de rayos X

► Resonancia Magnética Nuclear

ESTRUCTURA FUNCIÓN
TRIDIMENSIONAL ESTABILIDAD
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Difracción de rayos X Cristal de la lisozima

Patrón de difracción de Rayos X

 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Difracción de
Rayos X
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Resonancia Magnética Nuclear
► Proteínas en disolución
► RMN multidimensional
► 800 MHz
► [1mM] de proteína
► < 40 kDa

NATIVA DESNATURALIZADA
ANÁLISIS ESTRUCTURAL

Lisozima

Mioglobina
ANÁLISIS ESTRUCTURAL

Cápsida de un Ribozima
Adenovirus humano (2 BVI)
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Banco de Datos de Proteínas
(Protein Date Bank, .pdb)
HYDROLASE (CARBOXYLIC ESTERASE) 11-JUL-95
1LBT LIPASE (E.C.3.1.1.3) (TRIACYLGLYCEROL HYDROLASE) ORGANISM_SCIENTIFIC: CANDIDA
ANTARCTICA;
CRYST1 95.100 50.200 99.500 90.00 90.60 90.00 P 21 4 1LBT 173
ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 1LBT 174
ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000 1LBT 175
ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000 1LBT 176 Información de parámetros
SCALE1 0.010515 0.000000 0.000110 0.00000 1LBT 177 cristalográficos
SCALE2 0.000000 0.019920 0.000000 0.00000 1LBT 178
SCALE3 0.000000 0.000000 0.010051 0.00000 1LBT 179
MTRIX1 1 -0.033200 0.007500 -0.999400 46.86330 1LBT 180
MTRIX2 1 -0.005700 -1.000000 -0.007300 48.28900 1LBT 181
MTRIX3 1 -0.999400 0.005500 0.033200 49.58020 1LBT 182
Información de átomo,
ATOM 1 N LEU 1 -13.383 6.632 8.895 1.00 22.02 1LBT
ATOM 2 CA LEU 1 -12.982 7.995 8.460 1.00 22.02 1LBT
residuo y cadena
ATOM 3 C LEU 1 -13.953 8.446 7.381 1.00 22.02 1LBT
ATOM 4 O LEU 1 -14.331 7.657 6.515 1.00 22.02 1LBT Coordenadas atómicas
ATOM 5 CB LEU 1 -11.563 7.960 7.903 1.00 10.93 1LBT
ATOM 6 CG LEU 1 -10.630 9.123 8.203 1.00 10.93 1LBT Factor de población
ATOM 7 CD1 LEU 1 -10.577 9.382 9.693 1.00 10.93 1LBT
ATOM 8 CD2 LEU 1 -9.251 8.791 7.653 1.00 10.93 1LBT Factor Térmico
ATOM 9 N PRO 2 -14.417 9.706 7.454 1.00 18.56 1LBT
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Banco de Datos de Proteínas

1LBT

Diagrama de Ramanchandran Estructura Tridimensional

 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Banco de Datos de Proteínas

Rayos X RMN
42.668 proteínas
38.253 5.628

>46.000 Totales
5000 Por año

2007 1976
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
Programas de visualización de moléculas

RasMol
http://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm

Protein Explorer
http://proteinexplorer.org

PyMol
http://pymol.sourceforge.net
ANÁLISIS ESTRUCTURAL
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL
MOVIMIENTO : Rotar, trasladar, ampliar, reducir, cortar, etc
FORMA: varillas, bolas, cintas, etc
COLOR
Por
elemento
Aminoácidos

Por cadena, por estructura secundaria

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS DNA
ESTRUCTURAL RECOMBINANTE
1 3

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 4
5
 DISEÑO RACIONAL

OBJETIVO:
ESTABILIZACIÓN DEL
BIOCATALIZADOR

INTERÉS INVESTIGACIÓN
INDUSTRIAL BÁSICA
 DISEÑO RACIONAL

Proteínas Extremófilas:
● Temperatura: termófilos y psicrófilos
• pH: alcalófilos y acidófilos
• [sal]: halófilos
• Presión: barófilos o piezófilos...

Taq Polimerasa

Aislada del hipertermófilo

Thermus aquaticus

Tª óptima: 72-75ºC

Las proteínas son más

compactas
 DISEÑO RACIONAL

REGLAS DE DISEÑO PROTEÍNAS TERMOESTABLES

● Empaquetamiento intramolecular
● Aminoácidos formadores de hélice α
● Pro
INCREMENTO ● Puentes salinos
● Enlaces carga-neutro
● Estabilización de dipolos en hélices
● Estabilización por redes de carga superficial

● Bucles superficiales
DISMINUCIÓN ● Asn
● Movilidad extremo N-terminal
 DISEÑO RACIONAL

Objetivo Estrategia
● Introducción de puentes disulfuro

● Incremento de puentes de hidrogeno

Termoestabilidad ● Incremento de las interacciones hidrofobicas

● Incremento de las interacciones iónicas

● Conversión de Cys por Ala o Ser

Estabilidad frente ● Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu
a la oxidación ● Conversión de Trp por Phe o Tyr

●Conversión de Cys por Ala o Ser

Estabilidad frente ●Conversión de Met por Gln, Val, Ile o Leu
a metales pesados ●Alteración de los grupos carboxilo de la superficie

●Alteración de los grupos cargados de la superficie

Estabilidad frente ●Reemplazamiento interno de la His, Cys y Tyr
al pH ●Reemplazamiento de pares iónicos internos
 DISEÑO RACIONAL
TERMOESTABILIZACIÓN ENZIMÁTICA

ΔG =ΔH-TΔS

ΔH
POR RIGIDIFICACIÓN DE LA
ΔG
ESTRUCTURA ΔS
PROTEICA
 DISEÑO RACIONAL
Bases de datos de proteínas mutadas
http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/ 218,873 entradas
INSTITUTO DE INGENIERÍA PROTEICA (Japón)
Mioglobina (1mlm) .Proteína globular con 153 aa
Afectan a la estabilidad de la proteína frente a altas
presiones
MUTACION [1] Phe 123 Trp –
1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59
60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119
120 PGDWGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

MUTACIÓN [2] Ser 108 Leu –

1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59
60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFILEAIIHVLHSRH 119
120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153 STABILITY

MUTACIÓN [3] Ser 108 Lys

1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59
60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFIKEAIIHVLHSRH 119
120 PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153
MUTACIÓN [4] Ala 130 Lys –
1 MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59
60 DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119
120 PGDFGADAQGKMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153
PREDICCIÓN

BIOINFORMÁTICA
 PREDICCIÓN
Programas de modelado proteico

1ª GENERACIÓN
Fiabilidad: 50-60%

2ª GENERACIÓN
Fiabilidad: 70%

MODELADO
COMPARATIVO
 PREDICCIÓN
Programas de modelado proteico
3ª GENERACIÓN Modelado comparativo y Teoría evolutiva
Fiabilidad: > 70%

Selección evolutiva
de proteínas
PREDICCIÓN
Programas de modelado proteico

z Visualización y manipulación de proteínas y péptidos

z Visualización y análisis de la proteína nativa
z Simulación de la influencia de una mutación concreta sobre el
plegamiento proteico.
z Predicción de bucles en la estructura
z Interpretación de de cambios sobre la dinámica de la proteína
z Comparación de estructuras proteicas
z Cálculo de las interacciones atómicas y moleculares que
ocurren en la conformación de la proteína nativa y mutada
DISEÑO Y PREDICCIÓN

Homología en secuencia primaria

INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS DNA
ESTRUCTURAL RECOMBINANTE
1 2

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 3
4
DNA RECOMBINANTE
Vector de clonación
DNA
Enzimas de restricción
Gen de interés

Ligasas

DNA recombinante
Introducción en una célula
hospedadora
Selección de células
con el gen clonado
Expresión de los fragmentos
clonados:
Proteínas recombinantes
Proteínas recombinantes
mutadas
 DNA RECOMBINANTE
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA (M. Smith, 1993)
AATGCGCGTCTAAGCCGAATA
Objetivo: Ser→Cys TTACGCGCACATTCGGCTTAT
Fragmento
TCT
sintético

TCT
TCT
AGA
AGA
ACA
ACA
PROTEÍNAS
TCT
NATIVAS TCT
TCT
AGA
ACA

TCT
PROTEÍNAS ACA
MUTADAS TGT
 DNA RECOMBINANTE
Secuenciación de genes
 DNA RECOMBINANTE
Base de datos de genes
Base de Datos Internacional de Secuencias Nucleotídicas
DNA RECOMBINANTE

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez /.
 DNA RECOMBINANTE
PubMed All Databases BLAST OMIM Books TaxBrowser Structure

All Databases Go

Centro Nacional de
Search for

SITE MAP Hot Spots

Alphabetical List What does NCBI do?

Información de Resource Guide

About NCBI
Established in 1988 as a national resource for molecular
biology information, NCBI creates public databases,
Assembly Archive

Clusters of

Biotecnología, USA
An introduction to conducts research in computational biology, develops orthologous groups
NCBI software tools for analyzing genome data, and disseminates
biomedical information - all for the better understanding of Coffee Break, Genes
GenBank molecular processes affecting human health and disease. & Disease, NCBI

http//www.ncbi.nlm.nih.gov Sequence
submission support
and software
More... Handbook

Electronic PCR

Literature databases Entrez Home

PubMed, OMIM,
Books, and PubMed Entrez Tools
Central
Gene expression
Molecular databases omnibus (GEO)
Sequences,
structures, and Human genome
taxonomy resources
Genomic biology Influenza Virus
The human genome, Resource
whole genomes, and
related resources
Map Viewer
Tools
dbMHC
Data mining
Mouse genome
Research at NCBI
resources
People, projects, and
seminars
My NCBI
Software
engineering ORF finder
Tools, R&D, and
databases Rat genome
resources
National Center for Biotechnology Information
Education
U.S. National Library of Medicine
Teaching resources
8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894
and on-line tutorials
Copyright, Disclaimer, Privacy, Accessibility
How to reach us
 DNA RECOMBINANTE
» Base de datos de secuencias de DNA y proteínas.
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db/ebi/topembl.html)
PIR (http://www-nbrf.georgetown.edu/)
SWISS-PROT (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)

» Base de datos de estructuras de 3D y análisis de estructuras 3D.

PDBSUM (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/)
SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)
CATH (http://www.cathdb.info/latest/index.html)
DALI (http://www.ebi.ac.uk/dali/)
SWISS-MODEL (http://swift.cmbi.kun.nl/swift/servers/moddssp-ubmit.html)

» Otras bases de datos de interés en ingeniería de proteínas.

PMD (http://pmd.ddbj.nig.ac.jp/)
Brenda (http://www.brenda.uni-koeln.de/)
 DNA RECOMBINANTE
Base de datos de Enzimas
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS DNA
ESTRUCTURAL RECOMBINANTE
1 3

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 4
5
 PURIFICACIÓN

Grado de purificación Aplicación

DNA recombinante:
- Sobreexpresión del gen
- Introducción ligandos
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO RACIONAL

DISEÑO
Y PREDICCIÓN
2

ANÁLISIS DNA
ESTRUCTURAL RECOMBINANTE
1 3

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN 4
5
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN

FUNCIÓN EFECTOS DE LA
ACTIVIDAD MODIFICACIÓN

NATIVA

MUTANTE
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

A280 Proteina Proteína

Natural Mutada 1
Proteína
mutada 2

Fracción desnaturalizada (%)

ΔG
ΔΤm

ΔΤm

Temperatura (ºC)
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

Espectroscopía de Fluorescencia.

( ) Intensidad Fluorescencia ( % )
342
A
Intensidad de Fluorescencia

Imax, λ max
100
B 340

) λ max ( nm )
80 338

60 336

40 334

(
20 332

0 330
300 350 400 40 50 60
Temperatura (ºC)
λ emision ( nm )
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

Dicroísmo Circular.
M1
Mioglobina M2
M3
M1
M2

Δε280 [M-1cm-1]
M3

Temperatura (ºC)
FUNCIÓN Y CONFORMACIÓN
TERMOESTABILIDAD CONFORMACIONAL

Calorimetría Diferencial de barrido

0
Cp (kJºC-1mol-1)

-10

-20

-30
Exo 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperature (ºC)
 DISEÑO RACIONAL

TERMOESTABILIZACIÓN
ENZIMÁTICA

Introducción de Estabilización
puentes disulfuro de la hélice alfa

Lisozima Proteína de
Drosophila
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
1. Conocimiento de estructura, función y el gen
Lisozima del fago T4 (164 aa)
Difracción
de rayos X
1,8Å

164 aa

1L56.pdb
Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. Analysis of the effectiveness of proline
substitutions and glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers
v32 pp.1431-1441 , 1992
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
Lisozima del fago T4
4 puentes disulfuro naturales
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
Lisozima del fago T4
4 puentes disulfuro naturales

2. Modelado Proteico

Ile3 - Cys97

Cys3 - Cys97

3. Mutagénesis Dirigida Oligonucleótido sintético (Ile:TAT)

pAGAATTATGAATTGTTTTGAAATGTTA
Cys
Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and
glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
Lisozima del fago T4

5. Termoestabilidad
Sustrato: Pared celular de M. Luteus (A540) NATIVA = MUTANTE
Actividad Especifica :U/mg enzima

Desactivación termica: t1/2 Nativa: 11min < Mutante: 28 min

Termoestabilidad conformacional Dicroismo circular

Dicroismo Circular
0 .5 6

0 .5 5
Tm ΔΔG
Δε280 [M-1cm-1]

0 .5 4

0 .5 3
(ºC) (kcaL mol-1)
0 .5 2

0 .5 1
NATIVA 65 0
MUTANTE 70 1.2
0 .5 0

0 .4 9
30 35 40 45 50 55 60 65
o
T e m p e ra tu ra ( C )

Nicholson, H., Tronrud, D.E., Becktel, W.J., Matthews, B.W. 1992. Analysis of the effectiveness of proline substitutions and
glycine replacements in increasing the stability of phage T4 lysozyme. Biopolymers, 32, 1431-1441.
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 1
Termoestabilidad: Introducción de puentes disulfuro
Lisozima del fago T4
4 puentes disulfuro naturales
7-97 ILE 7 – Cys 97

9-164 Mutagénesis
Ile-Leu dirigida
21-142 Cys 7- Cys 97
Thr-Thr

Determinación de la temperatura de fusión (DSC)

Tm (ºC) Pares de residuos mutados
Ambiente 7-97 9-164 21-142 7-97 y 9-164 9-164 y 21-142 3-97, 9-164 y 21-
142
Reductor -2 -6 -3 -10 -5 -8

Oxidante +5 +7 +12 +15 +16 +23

Matthews, B.W., Nicholson, H. and Becktel, W.J. 1987. Enhanced Protein Thermostability from Site-Directed Mutations that
Decrease the Entropy of Unfolding. Biochemistry, 84, 6663-6667.
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Amino terminal

N-terminal
His, Lys y Arg

Ser, Thr, Asn o Asp.

C-terminal
Asp y Glu

Carboxilo terminal
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Dominio Proteína de Drosophila: Modelo Todo α

A
Cadena A
Ser 5 ⇒ Glu 5
Leu 8 ⇒ Lys 8
Cadena B B
Thr 22 ⇒ Glu 22
Gln 28 ⇒ CAsp 28
Cadena C
Asn 36 ⇒ Arg 36
Ile 42 ⇒ Arg 42
Marsall et. al., 2002
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Dominio Modelo Todo α Nativa Mutantes
A
A

B
B
C

Marsall et.
Marsall al., 2002
et. al., 2002
 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Dominio Modelo Todo α Nativa Mutantes
A
A

B
B
C

Marsall et. al., 2002

 DISEÑO RACIONAL: EJEMPLO 2
Termoestabilidad: Estabilización de la hélice α
Desnaturalización termal (DC)
Proteína Tm (ºC)
Fracción desnaturalizada

Natural 49
M1 53
M2 72
M3 50
M4 53
M5 68
M6 88

Temperatura
Marshall, S. A., Morgan, Ch. S. y Mayo, S. 2002. Electrostatics significantly affect the stability of designed homeodomain
variants. J. Mol. Biol. 316 (1), 189-199.
 DISEÑO RACIONAL
Diseño Racional: Estabilización de la hélice α
Restricciones
- His, Lys y Arg, (N-terminal) Ser, Thr, Asn y Asp.

- Exclusión de Asp y Glu (C-terminal)

- Fuerzas electrostáticas de atracción o repulsión entre

residuos con grupos cargados que estén adyacentes
(varios residuos de Glu o Lys)

- Volumen estérico de los grupos adyacentes de los residuos

de Asn, Thr, Ser y Leu

- Presencia de residuos de Pro

 ESTRATEGIAS PARA LLEVAR A CABO UNA
MODIFICACIÓN ENZIMÁTICA POR INGENIERÍA PROTEICA

Rediseño de Proteínas

I. Diseño Racional por

Mutagénesis dirigida

II. Evolución Molecular dirigida

 INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN
MOLECULAR DIRIGIDA

DNA SELECCIÓN
RECOMBINANTE 2
1

ANÁLISIS
ESTRUCTURAL
EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
Generación : MUTACIÓN - SELECCIÓN

2ª Generación 3ª Generación

4ª Generación
1a Generación

Millones de años
Evolución Natural
ESCALA TEMPORAL
Evolución Dirigida Semanas o meses
EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA

SELECCIÓN
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN
MOLECULAR DIRIGIDA

DNA SELECCIÓN
RECOMBINANTE 2
1

ANÁLISIS
ESTRUCTURAL
DNA RECOMBINANTE

Generación de librerías de mutantes al azar

A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)

denaturation

extension

denaturation
DNA RECOMBINANTE

Generación de librerías de mutantes al azar

A. ERROR POR PCR o PCR MUTAGÉNICA (Lio and Wise, 1990)

Tasa de mutación (%)

DNA RECOMBINANTE

Generación de librerías de mutantes al azar

B. “DNA BARAJADO” (Stemmer, 1994)

Recombinación aleatoria in vitro

Desnaturalización
Hibridación

DNasa
PCR Producto del
Sin cebadores “barajado”

Elongación
DNA RECOMBINANTE
EVOLUCIÓN
DIRIGIDA Error por PCR DNA barajado

Genes

Librería de genes
mutados Repetición
(opcional)

Transformación
Librería de proteínas Proteínas
mutadas quiméricas

Selección
Nuevos genes con
modificaciones
deseadas
INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN
MOLECULAR DIRIGIDA

DNA SELECCIÓN
RECOMBINANTE 2
1

ANÁLISIS
ESTRUCTURAL
 SELECCIÓN DE LOS MEJORES VARIANTES

Métodos de Selección ~ “Éxito de la evolución”

● Eficaces
iSensibles
iPrecisos
iRápidos: Alta capacidad de procesamiento
iRevelar la propiedad buscada

Métodos colorimétricos Robotización

 Selección de las enzimas termoestables
Esterasa

i i i
i ENZIMAS Tm(ºC)
i
6 generaciones de Nativa 52.5
mutagénesis al azar
1A5D1 57.3
2A12 58.2
i
i 3H5 62
i
i
i i 4G4 64

i 5H8 Sustrato Producto

i 5D4 A405
5E12 64.5
Recombinación
5H1

5H3

6H7 65

i 6sF9 66.5 30º y 50ºC

Giver, L., Gershenson, A., Freskgard, P.O. y Arnold, F. 1998. Directed evolution of thermostable
esterase. Biochem. 95, 12809-12813.
Selección de las enzimas termoestables
5 generaciones de
mutagénesis
aleatoria

Thermus thermofilus Leu-

Librería de genes
Mutantes Sistema de Selección

Selección:

↑Tª
Librería de
mutantes Leu+ ENZIMAS
MUTANTES

Tamakoshi M., Nakano, Y., Kakizawa S., Yamagishi, A. y Oshima, T. 2004. Extremophiles, 5(1), 17-22.
 INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR EVOLUCIÓN
MOLECULAR DIRIGIDA

DNA SELECCIÓN
RECOMBINANTE 2
1

ANÁLISIS
ESTRUCTURAL
 EVOLUCIÓN MOLECULAR DIRIGIDA
CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS MUTADAS
Mutante de lipasa de Rhizopus arrhizus
Glu190 Val190

NATIVA MUTANTE
Niu. W-N, Li Z-P, Zhang D-W, Ming-Rui Yu M-R y Tan T-W. 2006. Improved thermostability and the optimum temperature of
Rhizopus arrhizus lipase by directed evolution. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 43 (1), 33-39.
 INGENIERÍA DE PROTEÍNAS POR DISEÑO
SEMI-RACIONAL

Mutaciones al azar

ANÁLISIS
DNA
ESTRUCTURAL
RECOMBINANTE

FUNCIÓN PURIFICACIÓN
CONFORMACIÓN
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
Y PERSPECTIVAS FUTURAS

INVESTIGACIÓN BÁSICA

BIOCATÁLISIS
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
Y PERSPECTIVAS FUTURAS

INVESTIGACIÓN BÁSICA:
► Estructura - función de las proteínas
► Proceso de Plegamiento Proteico
► Flexibilidad conformacional Nuevos fármacos
► Diseño de enzimas nuevas y/o quiméricas.

BIOINFORMÁTICA

BIOLOGÍA
DE SISTEMAS
APLICACIONES DE LA INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
Y PERSPECTIVAS FUTURAS

BIOCATÁLISIS
Proteínas
Proteínas Proteínas
Recombinantes
Naturales Recombinantes
Modificadas

► Industria Química-Farmacéutica.
Termoestables Propiedades
Especificidad, únicas
Regioespecificidad

► Biomedicina
Nuevos Fármacos
 EJEMPLOS DE ENZIMAS MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

OBJETIVO ENZIMA RESULTADO MÉTODO Referencia

Enantio- Hidrolasa de Error por Van Loo et al.,
↑ 13 PCR + DNA 2004
selectividad epóxido
barajado
Actividad Anhidrasa Mutagénesis Gould and
↑ 40 +Recombina Tawfik, 2005
carbónica
ción
Eficacia N-acetil DNA Castle et al.,
↑10.000 barajado 2004
catalítica transferasa
Temoestabilidad Xilanasa Tm ↑ 35ºC Mutagénesis Palackal et al.,
dirigida 2004

Estabilidad en Subtilisina E Error por Chen and

↑ 170 PCR Arnold,
medio orgánico
(60% DMF) 1993

Regio- Galactoxidasa Oxida Glucosa Mutagénesis Sun et.al.,

especificidad aleatoria 2002
en posición 6
Dependencia Lactato NAD→NADP Mutagénesis Flores and
Ellinngton,
cofactor deshidrogenasa (PCR)
2005
ENZIMAS COMERCIALES MODIFICADAS POR INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

Nombre Principal
Tipo de enzima
comercial aplicación
Aquazym® Ultra Alpha-amilasa Industria textil
Carezyme® Celulasa Industria detergentes
Cellusoft® Celulasa Industria textil
Clear-Lens® LIPO Lipase Limpieza personal
Duramyl® Alpha-amilasa Industria detergentes
Endolase® Celulasa Industria detergentes
Everlase® Proteasa Industria detergentes
Lipolase® Lipasa Industria detergentes
Novozym® 735 Lipasa Industria textil
Ovozyme® Subtilisina (proteasa) Industria detergentes
Savinase® Proteasa Industria detergentes
Termamyl® Alpha-amilasa Industria detergentes
Thermozyme® Alpha-amilasa Industria textil
 Gracias
por su atención.
 PRÁCTICAS

DISEÑO RACIONAL
DE PROTEINAS
TERMOESTABLES

1. Modificación de la Lisozima de pollo

2. Rediseño del núcleo del represor ARC

3. Comparación de la isopropil-malato
deshidrogenasa mesófila y termófila
 PRÁCTICAS
MOVIMIENTO : Rotar, transladar ampliar reducir, cortar, etc
FORMA: varillas, bolas, cintas, etc
COLOR RASMOL
Por elemento

Aminoácidos

Por cadena, por estructura secundaria

 PRÁCTICAS
1. Modificación de la Lisozima de pollo

Met
Lys

MÁS ESTABLE
(4,O kcal/molL)

Yamada et al., 1993. J.Biol. Chem., 268, 10588-10592

 PRÁCTICAS
2. Rediseño del núcleo del represor ARC

Waldburger et al., 1995. Nature Struct. Biol., 2, 122-128.

 PRÁCTICAS
3. Comparación de la isopropil-malato deshidrogenasa
mesófila (Escherichia coli) y termófila (Thermus termophillus)

Kirino et al., 1994. Eu. J. Biochem., 220, 275-281

Numata et al., 1995. Protein Eng., 8, 39-43