UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE
PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERÍA QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA
BIOQUÍMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos
Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
2
 PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto

de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioquímica
aplicada en el laboratorio.

Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano

tienen como base el desarrollo de la biología molecular, lo que a su
vez ha generado el desarrollo de la bioquímica como consecuencia
natural.

La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica han

determinado el gran impulso que la bioquímica aplicada ha dado a la
nueva tecnología de los bioprocesos.

Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el

conocimiento previo de la biología y de la bioquímica aplicada.

La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de

Ingeniería Química las destrezas básicas para el empleo de los
diferentes instrumentos requeridos para el estudio práctico de la
bioquímica.

Los Autores
 ÍNDICE

PROLOGO

ÍNDICE

Págs.

PRÁCTICA 1 SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS................3

PRÁCTICA 2 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS

PROTEÍNAS...................................................................................................................11

PRÁCTICA 3 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS........................16

PRÁCTICA 4 CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DIÁLISIS.......................22

PRÁCTICA 5 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL..............................25

PRÁCTICA 6 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS...............................30

PRÁCTICA 7 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.................................35

PRÁCTICA. 8 INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE

ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA. ¡Error! Marcador

no definido.

PRÁCTICA 9 EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES..............................................................41

PRACTICA 10 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.........................46

PRACTICA 11 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.....................................................................51

PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO....................................................57

 PRÁCTICA 1
PRÁCTICA 1

SEPARACIÓN EN CAPA FINA

SEPARACIÓN EN CAPA FINA
DEUNA
DE UNAMEZCLA
MEZCLADE
DEAMINOÁCIDOS
AMINOÁCIDOS

3
I. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la
identificación de aminoácidos presentes en una muestra biológica.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una
hidrólisis ya sea ácida o alcalina; éste proceso rendirá una mezcla
de sus aminoácidos constituyentes, los cuales pueden ser
susceptibles de ser analizados o identificados por métodos
cromatográficos.
 Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que
se cambian para formarlos son los a -aminoácidos.

 Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus

cadenas laterales.
 In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
 El pKa de los grupos carboxílo y amino de los alfa
-aminoácidos es aproximadamente 2 y 10
respectivamente.
 Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo
carboxilato habrá perdido un protón y el grupo amino
habrá captado un protón para dar la forma
ZWITTERION.
 En los genes, de todos los organismos están codificados
20 aminoácidos que se incorporan a las proteínas.
 Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
 Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay
aminoácidos modificados que se hallan en las proteínas.
 La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas,
hidrófobas, ácidas, básicas, neutras) permite una gran
complejidad funcional en las proteínas.

4
CROMATOGRAFÍA
Método de Separación
 Permite separar, aislar e identificar componentes
estrechamente relacionados presentes en mezclas
complejas.
 En estos métodos se emplea:
- Fase estacionaria : Sólido/líquido
- Fase móvil : liquido/gas
 “Los componentes de una mezcla se transportan a través
de una fase estacionaria por medio de una fase móvil que
fluye”.
 Las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migración entre los componentes de la
muestra.
Cromatografía en Capa Fina
 Tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
 El soporte o Fase Estacionaria.
Es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido
pueden ser.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias

a la presencia de SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

5
 El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay
alguna marcha de la migración de muestra o estándares esta
marcha ya no es verde sino violeta.

III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar
bastante fino.
 Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener
una mancha entre 1 y 2 mm de diámetro.
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-
7mm aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusión

 Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil
con la ayuda de un solvente de elusión.
 Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

“El solvente debe estar por debajo del sembrado de la

muestra”.
 El solvente comienza a subir por capilaridad.
 Las muestras se comportan diferente según el solvente
utilizado y sus componentes algunos migrarán
rápidamente otros no.

Tercer Proceso: Visualización o Revelado

6
El producto puede verse:
 Por sí mismo porque tiene color.
 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple
vista.
 Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dónde está la
mancha dando coloraciones amarillas profundas.
 Usando métodos químicos, usando una sustancia química como
revelado, ( en este caso ninhidrina en butanol)

7
 Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su

factor de retardo RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente

con la de una sustancia patrón en idénticas condiciones.
“La razón de estas distancias se designa por Rf”

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

 Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
 Corrida cromatográfica. Elusión
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la
separación cromatográfica, hasta que el solvente haya
alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa.
 Revelado del cromatograma
- Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.
- Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. -
Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello.

8
 - Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol
sobre la placa. Secar la placa con una secadora.
 Identificación
Luego proceder a identificar las manchas existentes que
deberán corresponder a aminoácidos para ello se deberán hacer
los cálculos de los Rfde los estándares y luego los Rf
correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a
través de una coloración azul violeta.

V. CUESTIONARIO:
5.1. Haga un esquema de los resultados observados.

5.2. Calcular los Rf de los estándares y muestras.

5.3. Identificar que aminoácidos están presentes en las muestras

problemas.

5.4.

9
5.5. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la
cromatografía de intercambio iónico y cuáles son sus
aplicaciones.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________

5.6. Qué métodos existen para el análisis de aminoácidos de las

proteínas.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.7. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto

para silica y alúmina.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.8. Haga el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los

aminoácidos.

5.9. La cromatografía en capa fina separa las sustancias según su

peso molecular.? Fundamente.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

10
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

11
VI. OBSERVACIONES

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____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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____________________________________________________________________
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____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES

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____________________________________________________________________
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____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
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VIII. BIBLIOGRAFÍA

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12
 PRÁCTICA 2

PRÁCTICA 2

DETERMINACIÓNDETERMINACIÓN DE LAS
DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS
DE LAS PROTEÍNAS
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS
PROTEÍNAS

13
 PRACTICA II. PROPIEDADES QUIMICAS DE PROTEINAS

I. OBJETIVOS:
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de describir y
demostrar de manera cualitativa las propiedades químicas de las
proteínas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las proteínas.
Las propiedades electroquímicas de las proteínas.
El efecto ácido-básico en la solubilidad de las proteínas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de proteínas.
3. Propiedades fisicoquímicas del agua.
4. Ecuación de Henderson-Hasselbach.

III. INTRODUCCIÓN:
Se considera a las proteínas como polímeros biológicos de
aminoácidos. En las proteínas existen 20 tipos de aminoácidos
diferentes los cuales están en un número y secuencia
determinados por el código genético.
Con respecto a su tamaño, las proteínas van desde un peso
molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una
considerable variación de formas y estructuras. Para su estudio se
consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la
más simple la estructura primaria y la más compleja la estructura
cuaternaria cuya conformación depende de diferentes fuerzas
químicas de atracción y repulsión que son ejercidas sobre la
estructura molecular de la proteína y por lo tanto son
responsables de su estabilidad.
Por convención se acepta dividir a las proteínas en dos grupos:
proteínas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias
en sus propiedades químicas y físicas. Sin embargo, para los fines
que se persiguen en esta práctica se les mencionara en forma
general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína
son: La fuerza iónica del medio, el pH. la temperatura y la
constante dieléctrica del solvente. Cuando hay un cambio de
cualquiera de estos factores, la proteína responde con una
intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la
estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan
drásticamente que desnaturaliza a la proteína. Por fortuna, en
nuestro organismo, la variación de tales factores es mínima por lo
que son imperceptibles los cambios en la proteína.

14
IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla

V. METODOLOGÍA:
En esta práctica se trata de provocar cambios de solubilidad en
proteínas que se encuentran en el organismo, mediante la
modificación las propiedades de los solventes, para establecer
una relación con los efectos que se pueden presentar en el
organismo.
Fundamento Químico:
Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo
del pH de la solución en la cual se encuentran; cuando se
neutralizan, se presenta precipitación proteica.
La adición de una sal a una solución proteica modifica la
constante dieléctrica del solvente permitiendo una mayor
solubilidad de la proteína. Sin embargo, cuando se añade exceso
de una sal, se neutralizan las cargas de la proteína y ésta tiende a
precipitar. Este mismo efecto ocurre al añadir sales metálicas
cargadas electropositivamente. Con la adición de un ácido o una
base a una solución proteica se alcanza un estado en que hay el
mismo número de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza
la carga de la proteína y tiende a precipitar. El pH que determina
el número igual de cargas de signos opuestos se denomina punto
isoeléctrico.

Experimento No. 1
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición
de un ácido.
Preparar una solución de caseinato de sodio, tomando 250 mg de
caseína, 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N. Cuando la
solución sea perfecta, se agregan 5 ml de ácido acético 1 N.
Mezclar bien, diluir a 50 ml con agua destilada. Si la solución no
está suficientemente clara, se puede filtrar.
• Preparar los siguientes tubos como se indica a continuación

Tub p Agua Ac. Ac. Ac. Casein

o H destilad Acético Acético Acético ato de
a 0.01N 0.1 1.0N Sodio
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0

15
 4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0
10 5.8 0 0 3.2 1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que

presente la solubilidad de la caseína en cada tubo. Reportar el
punto isoeléctrico correspondiente al tubo donde se presenta la
mayor precipitación.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Hendersosn-
Hasselbach.
Experimento No. 1
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición
de un ácido.
Tubo pH Solubilidad

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína ?

____________________________________________________________________

VI. CUESTIONARIO:
6.1. De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el
agua.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.2. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca la

adición de un ácido o una base fuerte.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

16
 _______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.3. Explique cómo afecta un cambio en la constante dieléctrica

del agua a la solubilidad de una proteína.
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_______________________________________________________________
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_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.4. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden

promoverlo.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.5. Qué es el Saltingout y qué tipo de compuestos pueden

promoverlo.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.6. Qué relación existe entre el punto isoeléctrico y la solubilidad

de una proteína.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.7. Qué es la ecuación de Henderson-Hasselbach y en que casos

está indicado utilizarse.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

17
 6.8. Mencione que propiedades fisicoquímicas de la albúmina le
permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto
incluyendo hidrofóbicos a través de un medio acuoso.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

VIII. CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

IX. BIBLIOGRAFÍA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

18
 PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN
PRÁCTICA 3
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
PROTEÍNAS PROTEÍNAS

19
 PRACTICA 3. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE
PROTEÍNAS

I. OBJETIVO
Determinar la concentración de una solución de proteínas mediante
la reacción de Biuret y el espectrofotómetro.

II. FUNDAMENTO:

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar

mediante la reacción del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4
en solución alcalina. La reacción se basa en la formación de un
compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo
de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos.

Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen

un color violeta
característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4)
en solución alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir
enlaces químicos entre los pares de electrones libres del átomo de
nitrógeno presente en los enlaces peptídicos de las cadenas
proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu+2

y las diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo
tanto, se puede utilizar una proteína como patrón de calibración.
La curva de calibración obtenida por este método, se hará
utilizando como patrón solución de extracto de levadura, cuya
concentración es de 8 mg/ml preparada con agua destilada.

Espectrofotometría. Principios básicos

La reacción de biuret es cuantificable, es decir a mayor
concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta, estas
reacciones en las que el color formado es proporcional a la cantidad
de sustancia se llaman reacciones colorimétricas.

20
Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración
de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas
fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide
sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una
medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de
forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se
diferencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide
en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre
380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoíris, de tal
forma que cada color corresponde a una radiación con una longitud
de onda específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara
que emite luz monocromática, de una longitud de onda
determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y
de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida
por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la
radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz
( a la longitud de onda de máxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de

luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la
concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por
la luz. La relación entre luz incidente (Io) y la reflejada (I) dará una
idea de la cantidad de radiación que ha sido absdorbida por la
muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs) ó
Densidad Optica (DO)

La ley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Siendo e el coeficiente de extinción molar (específico para cada

sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones
determinadas (M-1, cm-1), C es la concentración de la muestra a
medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayoría de los
espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de
espesor, por lo que 1 se puede ignorar. Así la concentración
desconocida de la sustancia será:

C = Abs /e

III. MATERIALES Y EQUIPO

 Espectrofotómetro
 Gradilla para tubos de ensayo
 Tubos de ensayo
 Vasos de precipitado
 Probetas, Pipetas
 Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret

21
IV. PROCEDIMIENTO

Realización de una curva patrón: Como se desconoce el

coeficiente de extinción molar (€) de las proteínas coloreadas con el
reactivo biuret, se procederá a construir una curva patrón,
midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones
conocidas de proteína, para sobre ella interpolar el valor de Abs de
la solución problema y determinar su concentración gráficamente y
también por regresión lineal. Para ello se dispone de una solución
de 10 mg/ml de proteína (extracto de levadura) a partir de ella se
realizan diluciones conocidas aplicando la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf
Dónde:
Ci = concentración de la solución madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial
Cf= concentración final de la solución a preparar
Vf= volumen total final de la solución a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre
(Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.

Conc. Volum Volum Volume Volum Abs.

Final. en en n Rx. en 570n
Sol. a Sol. agua Biuret Final m
preparar Madre
inicial
Tubo Mg/ml ml ml ml ml
Blanc 0 0,0 4,0 4 8
o
1 0,5 3,5 4 8
2 1,0 3,0 4 8
3 1,5 2,5 4 8
4 2,0 2,0 4 8
5 2,5 1,5 4 8
6 3,0 1,0 4 8
7 3,5 0,5 4 8
8 4,0 0,0 4 8
Mues 4,0 0,0 4 8
tra

Al añadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la

absorbancia.
Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de máxima
absorbancia para la reacción del biuret)

22
 b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo
blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el
espectrofotómetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la
absorbancia de las soluciones de los otros tubos, comenzando
por el de menor concentración.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs
del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco
(Abs=0), se construye una recta en papel milimetrado,
representando las concentraciones en el eje de abscisas y las
Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y
calcular su concentración.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional
a la concentración y que la relación es lineal: Y = a + b X
(Y = A + B x Conc.). Utilizando regresión lineal se obtiene
el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar
concentración que en este caso es de la muestra desconocida.

V. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la concentración de proteínas de la muestra?

5.2 ¿Se podría determinar la concentración de cualquier

muestra de proteínas con esta curva patrón?

5.3 ¿Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la

reacción del Biuret?

23
 5.4 Investigue si existe alguna proteína en la que no esté
presente ninguna aminoácido con anillo bencénico en su
cadena lateral, e indique que consecuencias tendría sobre la
determinación espectrofotométrica

VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________

24
 PRÁCTICA 4

CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS
PRÁCTICA
PROTEICOS POR DIÁLISIS 4
I. OBJETIVO
Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o
solución que las contenga.

II. FUNDAMENTO
CONCENTRACIÓN DE
EXTRACTOS PROTEICOS POR
La diálisis es una técnica que separa las moléculas de acuerdo a
su tamaño usando membranas semipermeables que contienen
poros de dimensiones menores que las macromoléculas que se
deseen separar como las proteínas, los poros permiten la difusión
de las moléculas de solventes, sales y otras moléculas pequeñas,
pero bloquean el paso de proteínas por su gran tamaño.
Se usan membranas de celofán (acetato de celulosa),
nitrocelulosa, colodión, u otras de naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusión por
diferencia de concentración.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 01 pliego de papel celofán.
 1Kg de azúcar.
 Solución de extracto proteico al 0.5%.
 Pipeta de 10 ml.
 Vaso de precipitados.
 Piceta.
IV. MÉTODO
 Preparar una bolsa con el papel celofán, de modo que no se
presenten fugas al llenarla con una solución.
 Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solución de
proteína al 0.5%.
 Comprobar la concentración de proteína con el
espectrofotómetro a 280 nm.
 Llenar la bolsa de celofán con 50 ml de solución proteica,
usando para tal fin la pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa
de modo que no presente fugas.
 Preparar un tazón con azúcar, y colocar allí la bolsa de celofán
conteniendo la solución proteica.
 Untar toda la bolsa de celofán, con el azúcar, cubriéndola por
completo.
 Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azúcar, observando
los cambios ocurridos.
 Medir el volumen de líquido que quedó en la bolsa de celofán
y comparar con el volumen inicial.

25
  Mediar nuevamente la concentración de proteínas en el
espectrofotómetro a 280 nm.

V. CUESTIONARIO
Señale las principales técnicas de separación de solutos por
membrana, y las principales aplicaciones de cada una de ellas.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________

Investigue la composición química de la membrana utilizada y

explicar las razones de su porosidad.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________

Efectúe los cálculos de variación en el volumen y la concentración

de la proteína en solución.

Indique el principio y la ecuación básica del transporte de

solventes por osmosis.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solutos

por difusión debida a diferencias de concentración.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
________________________________________________

VI. OBSERVACIONES

26
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

27
 PRÁCTICA 5

DETERMINACIÓN
PRÁCTICA 5
DE PROTEÍNAS
POR MICRO-KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-
KJELDAHL

28
I. OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en
una muestra desconocida.

II. FUNDAMENTO
El método de micro-kjeldahl es una simplificación hecha por
HACH en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo
análisis en un tiempo corto y con pequeñas muestras.
Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las
proteínas a nitrógeno inorgánico. Para ello se siguen tres etapas
claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por acción del ácido
sulfúrico en presencia de oxidantes fuertes (peróxido de
hidrógeno), de esta manera todo el carbono presente se libera
como CO2 y nitrógeno como NH3, luego este se combina con
el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la
acción de un álcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se
recibe en una solución de ácido débil en presencia de
colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte
cuantificando el nitrógeno presente.
Luego se aplica la relación siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dónde: ml.N.fc.meq = peso de nitrógeno en la muestra
ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml)
N. normalidad del ácido
Fc. Factor de corrección del ácido
meq.= peso del miliequivalente del nitrógeno
Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples
con 16% de N, el porcentaje de proteínas será:
Proteína = 6.25xN

III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinación se hace en tres etapas:

DIGESTIÓN.
 Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es sólido) y
colocar en el matraz de digestión
 Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz

29
  Verificar que el control automático del digestor este en
440ºC y que haya succión en la columna de
fraccionamiento.
 Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado
la temperatura indicada.
 Añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 50% a la
muestra a través de un embudo de la columna de
fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, añadir
porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se
aclare.
 Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar
la columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre
un bloque y tapar hasta que se haya enfriado.
 Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.

DESTILACIÓN
 El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un
balón de destilación.
 Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de
ácido borrico al 4% ( en volumen) adicionándole indicador
azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloración
violeta.
 El balón de destilación que contiene el digesto se añade
13 a 15 ml de hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3
granallas de zinc.
 Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto
durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor
tenga una coloración verdusca y su volumen sea más o
menos 3 veces del volumen inicial)

TITILACIÓN.
 Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y
valorizarla.
 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de
verde a violeta

IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________

30
Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas
simples y dos proteínas conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las

etapas durante el proceso de determinación del nitrógeno

Efectué los cálculos y determine el contenido de proteínas en la

muestra

Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante

la etapa de digestión

Explique el objetivo de la etapa de destilación.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

Explique porque la titilación se hace con ácido sulfúrico y no con

un álcali.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

31
 ___________________________________________________________________

V. OBSERVACIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________

VII. BIBLIOGRAFÍA

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

32
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

33
 PRÁCTICA 6
PRÁCTICA 6
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
DE CARBOHIDRATOS

34
I. OBJETIVOS:
 Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.
 Diferenciar experimentalmente monosacáridos, disacáridos y
polisacáridos.
 Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono
en reductores y no reductores.
 Estudiar las propiedades del almidón.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Se denominan carbohidratos o glucósidos los derivados
aldehídicos cetónicos, reales o potenciales de alcoholes
polivalentes o sus productos de condensación según la cantidad
de glucósidos o azúcares sencillos que se obtengan por hidrólisis
de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacáridos (celulosa, almidón)
Trisacáridos (rafinosa)
Disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacáridos
Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o
cetosas por el. número de átomos de oxigeno, pueden ser
hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa
(arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones
carbonilo y oxhidrilo y, además, algunas específicas. Todos son
óptimamente activos. Por el calor y la acción de ácidos fuertes se
deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono más abundantes de la biósfera están
constituidos por el almidón y celulosa que son polímeros de
glucosa presentes en plantas.
El almidón está distribuido ampliamente en las plantas que lo
almacenan en granos y en tubérculos como reserva alimenticia
para el momento de la germinación. Todos los tipos de almidón
producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador
cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidón.
La hidrólisis del almidón catalizada por ácidos lo convierte en
varias clases de dextrinas, en maltosa y por último en D (+)
glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la
hidrólisis puesto que la coloración va cambiando de azul a rojo a
medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgánico.
Los grupos funcionales existentes en el almidón y en la celulosa
son los grupos hidroxilo y acetal. Estos polisacáridos tienen
diferente configuración, siendo el almidón un glucósido y la

35
 celulosa un f -glucósido. También difieren en el tamaño teniendo
lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del
almidón.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

 Reactivo Molisch  Tubos de ensayo
 Reactivo Fehling  Pipetas
 Reactivo Tollens  Baño de agua hirviente
 Reactivo Seliwanoff  Pinzas
 Reactivo Barfoed  Baño hirviente
 Sol. glucosa 1%  Vaso de precipitados
 Sol. fructuosa 1%  Luna de reloj
 Sol. sacarosa 1
 Sol. lactosa 1%
 Sol. almidón 1%
 Sol. sacarosa 5%
 Sol. HCl 10%
 Sol. NaOH 10%
 Sol. yodo - yodurado

IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genéricas de los carbohidratos
 Reacción de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una
solución de glucosa al1%, 1 ml. de solución de fructuosa o
levulosa al 1%, 1 ml. de una solución de sacarosa al 1%, 1 ml.
de una solución de lactosa al 1%, 1 ml. de una solución de
almidón al 1% y en el último 1 ml. de agua (testigo). A cada
una agréguele 2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por
las paredes 2 ml. de ácido sulfúrico concentrado.
Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase
entre los dos líquidos. Anote aquellas soluciones que den
positiva la prueba.
Reacciones Específicas
 Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solución
A de Fehling con 0.5 ml. de la solución B de Fehling,
agrégueles 1 ml. de la solución de los carbohidratos utilizados
en el experimento anterior.

36
 Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay
cambios de color, formación de precipitados.
 Reacción de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de
Tollens recientemente preparado, añadir a cada uno 2 ml. de
las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay
formación de espejo de plata y cuales carbohidratos dan
negativa esta reacción.
Realice una comparación de estos resultados con los de la
prueba de Fehling.
 Reacción de Seliwanoff
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff,
luego añada 3 gotas de solución de los carbohidratos
utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a baño
hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el
color adquirido.
 Reacción de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego
añada 1 ml. de solución de los carbohidratos utilizados
anteriormente, luego llevar los tubos a baño hirviente y
observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo,
lo que indicará la presencia de monosacáridos.
Los disacáridos también precipitan óxido cuproso, pero muy
lentamente.
 Hidrólisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solución de sacarosa al
5%, llévelos a baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes
iguales de agua para el primer tubo, ácido clorhídrico al 10%
en el segundo tubo, e hidróxido sódico acuoso al 10% en el
tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a
continuación la reacción de una porción de cada mezcla con la
solución de Fehling. ¿Qué conclusiones deduce?
 Ensayo del Almidón frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al
1%, añada una gota de solución de Iodo - lodurada, observe el
color de la solución. Luego caliente la solución coloreada a
ebullición y observe el efecto, observe también qué efecto
produce el enfriamiento de la solución.
 Hidrólisis del Almidón
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de
almidón al 1%, añada 1 ml de ácido dorhídrico concentrado.

37
 Hierva la solución y retire muestras de Y ml. a intervalos
próximos, ensayando su reacción frente al iodo. Anote el color
en los diferentes ensayos.
Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo,
neutralícela y ensaye la reacción de una muestra frente al
Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la
hidrólisis del almidón (un disacárido y un monosacárido).

V. CUESTIONARIO:
5.1. Indique la composición de los reactivos utilizados en la
práctica (R. Molish, R. Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de producción de

la glucosa a nivel industrial.

5.3. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras
de almidón?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

5.4. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis

del almidón?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

VI. OBSERVACIONES

38
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________________________________________________________

39
 PRÁCTICA 7

METABOLISMO
PRÁCTICA 7 DE
CARBOHIDRATOS:
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.
FERMENTACIÓN.

40
 MATABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

I. OBJETIVOS
1.- Observar experimentalmente los fenómenos de respiración
celular anaeróbica (fermentación) en levaduras.
2.- Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la
respiración celular.
3.- Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos,
inhibidores no competitivos, oxido-reducción, modificación de pH e
inhibidores en la interpretación de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces
cerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas,
por lo que se puede medir la fermentación por la producción de
CO2.

III. PROCEDIMIENTOS.
3.1. Complete la siguiente batería de tubos:

Tubos 1 2 3 4
Suspensión 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
de levadura
7%
Sol. 0 1 ml 1 ml 1 ml
Glucosa
Sol. NaF 0 0 1 ml 0
Agua 2 ml 1 ml 0 0
destilada(4
3°C)
Sol.Rojo 0 0 0 1 ml
Neutro

Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada

tubo.
3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido,
presionándolo girar rápidamente de manera que el tubo
quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la
burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un

41
 elástico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un baño de agua
a 43°C.
3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solución en el
tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con
agua.
3.4. Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.
3.5. Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:

1. Solución de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de

levadura en 10 ml de agua destilada a 43°C y completar a 100
ml con agua destilada a 43°C.
2. Solución de glucosa 0,1 M
3. Solución de NaF0,1 M
4. Solución rojo neutro 0,02 M

IV. CUESTIONARIO.
1.- Explique, cual es el objetivo de los tubos 1 y 2
……………………………
………………………………………………………………………………………..
2.- Cuál es el objetivo de los tubos 3 y 4?
………………………………………
……………………………………………………………………………………….
3.- Explique el efecto del NaF.
………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………
4.- Presente la via metabolica de generación de etanol
completa ……………..
……………………………………………………………………………………….
5.- explique la conversión del piruvato en etanol
………………………………..
……………………………………………………………………………………….
V. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

42
______________________________________________________________________
__________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFÍA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

43
 INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS

I.- OBJETIVOS
1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3) Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto
de la fermentación

II.- ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomyces
cerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la
reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO 2 es liberado como gas,
por lo que se puede medir la fermentación por la producción de
CO2 y por la concentración del producto formado o por la
disminución de la concentración del sustrato (en grados Brix)

III.- MATERIALES.

- Material biológico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas

- Reactivos: Agar-agar, solución de glucosa 5%
- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodérmicas de
20cc, espátulas, picetas, papel toalla.
- Equipos: Balanza, refractómetro, baño maría.

IV.- PROCEDIMIENTO

Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua
destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada,
con calentamiento y agitación constante.
Calibrar el baño de maría a 40ªC, para mantener dentro del agar
licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla
en refrigeración (aproximadamente 4ªC), por 30 minutos.
Inmovilización de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar
licuado y homogenizar.
Tomar con una hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y
dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal
refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con
movimientos rotatorios suaves.
Secar los pellets en papel toalla.

44
Obtención del mosto de uva:
Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en
el refractómetro.
Obtención de etanol:
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de
uva, (o 50ml de una solución de glucosa al 5%). To0mar una alícuota,
considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o
porcentaje de azúcar en el refractómetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alícuotas cada 15 minutos.
Leer los grados brix en el refractómetro para cada alícuota.
V .- CUESTIONARIO.

1.-explique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o

células.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
2- Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
3.- Explique las características coagulantes del agar-agar.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las
células de levadura, si estas están atrapadas en la matriz de agar-
agar. ______________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
5- Presente al menos un caso detallado de aplicación de la
inmovilización de enzimas.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
6- Qué otros métodos para la inmovilización se utilizan?
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

45
VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VI.- CONCLUSIONES

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII.- BIBLIOGRAFÍA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

46
 PRÁCTICA 9

PRÁCTICA 9

EXTRACCIÓN
EXTRACCIÓN DE ENZIMAS DE ENZIMAS
VEGETALES

VEGETALES

47
 PRACTICA 9. EXTRACCION DE ENZIMAS VEGETALES

I. OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su
actividad catalítica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son proteínas con acción catalítica.
Las proteínas se encuentran en el interior de las células en un
estatus particular, a pH fisiológico, y con estructura nativa
estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven
las características estructurales y las propiedades funcionales de
las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica,
debido a la enzima ureasa presente en la cáscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato úrea provoca la
hidrólisis de esta con la consiguiente liberación de amoniaco y
anhídrido carbónico, según la siguiente reacción.
NH2
O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2
NH2
La actividad ureásica se puede comprobar haciendo reaccionar
el amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K 2Hg14). Este
reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio, que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de
color amarillo-anaranjado (complejo cuya fórmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes
de onda de 405 a 420 nm.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 150 gr. De cubierta de frejol, solución de úrea0.3 M, agua
destilada
 Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
 Espectrofotómetro, Baño María, Balanza, Equipo de
filtración, papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04
tubos de ensayo de 10 ml. Balón de 500ml. Vaso de
precipitados de 500 ml.

IV. PROCEDIMIENTO.

Extracción de la Enzima.

48
 Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o
(agua hervida fría) , después de 24 horas remover la
cáscara por fricción, y proceder a escurrir el agua.
 Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.
( PO4HNa2) , y 200ml. De solución EDTA 0.001 M. Usando
en ambos casos agua destilada fría, mezclar ambas
soluciones, y enfriar a 4ºC. En un balón de 500 ml.
 Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de
precipitados de 500 ml.
 Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado,
y licuar cuidando se mantenga baja la temperatura.
 Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De
agua destilada.
 Centrifugar la suspensión a 14,000 g. Por 10 min. o pasar
la solución por un filtro rápido y enjuagar el papel filtro
con 10 ml. De agua destilada.
 Separar el sobrenadante y medir el volumen final del
extracto obtenido, llevar a refrigeración.
 Preparar un cuadro de resultados.
CASCA BUFFE AGU EXTRACT FINAL
RA R A O (ml)

Determinación de presencia de proteínas en el extracto

por espectrofotometría.
Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de
reactivo biuret.
Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1
ml de agua y 4 ml de reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570
nm. Para comprobar la presencia de proteínas.
Anotar la lectura de Absorbancia.

Comprobación de La actividad enzimática.

 Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo
muestra y el otro como tubo de blanco.
 En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3
M y 1.5 ml de buffer fosfato.
 Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.

49
  Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de
agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente,
para lograr mezclar.
 Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC
por 15 min.
 Después de incubar los tubos, adicionar el Reactivo
Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8
ml.
 Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio
ambiente.
 Calibrar el espectrofotómetro a 420 nm.
 Medir la absorbancia. La muestra de extracto dará
coloración y un alta absorbancia por el amoniaco liberado.

V. CUESTIONARIO.
Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la
extracción de la enzima ureasa.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Diga que pruebas se tienen de haber extraído realmente enzimas

vegetales.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se

prepararon.

Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y

la refrigeración.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

50
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extracción

utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

VII. CONCLUSIONES

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________

51
 PRACTICA 10

PRACTICA 10
DETERMINACIÓN
DETERMINACIÓN DE DE
ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA
ACTIVIDAD ENZIMATICA EN
UREASA

52
 PRACTICA 10. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA

I. OBJETIVO
Determinar la capacidad catalítica o actividad enzimática de la
enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico
de la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reacción
que cataliza.
La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima
contenida en 1 ml de solución que transforma o produce 1 mg de
sustrato ó producto por minuto medidas en las condiciones
óptimas de operación de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos
organismos vivos, mas no en el organismo humano. Algunas
fuentes comunes son las bacterias, o la cáscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposición de la úrea según la
reacción:
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de
cualquier reacción puede ser determinada midiendo:
1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado
tiempo de reacción
2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer
el ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo
cualquiera de los productos (CO2 ó NH3) producidos en un
tiempo determinado.
Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado, lo cual
se hace por medios espectrofotométricos utilizando el reactivo
Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al
reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo
de color anaranjado castaño.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O
La intensidad del color formado será directamente proporcional
a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medirá la
absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado).

III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

53
Materiales.
 Preparar 50 ml de solución de urea 0.3 M.
 Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con
EDTA 0.001M
 Reactivo Nessler.
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato
pH, 7.4 ( a 4ºC)
 100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M
(5x10-4milimoles/ml)

Material de vidrio.
 02 fiolas de 50 ml.
 02 fiola de 100ml.
 08 tubos de ensayo.
 01 gradilla para tubos.
 01 espectrofotómetro.
 baño de hielo.
 Incubadora a baño maría.

Determinación de la curva de calibración.

Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de
amonio según la tabla siguiente:

Patr Concentra SO4(NH ml de Buff Nessl Volum Absorban

ón ción (NH3) 3)2 SO4(NH er er en cia
Nº mol/ml nmol/ml 3)2 (ml) (ml ) final 420 nm.
ml
Blan 00 0.0 0.0 7.50 0.5 8.0
co
1 5.0 0.01 7.49 0.5 8.0
2 10 0.02 7.48 0.5 8.0
3 15 0.03 7.47 0.5 8.0
4 20 0.04 7.46 0.5 8.0
5 25 0.05 7.45 0.5 8.0
6 30 0.06 7.44 0.5 8.0
Con los datos obtenidos se construye la curva de
equivalencia o curva de calibración.

Medida de la actividad ureasica.

54
 Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo
muestra y el otro como tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M
y 1.5 ml de buffer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solución de ureasa y 4.8
ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar
suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por
15 min.
Después de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubación e
introducir en baño de hielo para detener la reacción.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada
tubo). Volumen total 8 ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.

IV. CUESTIONARIO
1.- Efectúe los cálculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reacción

enzimática.

3.- Calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa en

nmol de NH3 producido/min.

4.- Explique por qué durante la reacción debe incubarse a 37ºC

55
 5.- Realizar los cálculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y
urea para cada tubo patrón usados en la construcción de la
curva de calibración.

6.- Encontrar la equivalencia por el cálculo del factor de

equivalencia y por la determinación analítica de la ecuación
de la curva.

7.- Diga si la curva de calibración obtenida obedece a la ley de

Beer. Explique por qué.

8.- Explique por qué es necesario contar con un blanco en las

determinaciones de actividad enzimática.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad

específica.

V. OBSERVACIONES
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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFÍA

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_____________________________________________________________________________________
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57
 PRACTICA
PRACTICA 11 11
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA

58
 PRACTICA 11. CINETICA ENZIMATICA CON UREASA

I. OBJETIVO.
Verificar la variación de la velocidad de las reacciones
enzimáticas con la concentración del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa,
para formarse amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente
ecuación.
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por
espectrofotometría a l = 420 nm, si previamente se le
compleja con reactivo Nessler.
Cinética de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimáticas varían con la
concentración del sustrato según una cinética autosaturante
que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.

V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma:

La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver

haciendo uso de la Linearización de Lineweaver-Burk, en
cuyo caso toma la forma.

59
 Donde los parámetros anteriores se relacionan por la
ecuación de una recta.
1 = 1 + [S]
VVmaxKs

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.
 20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de
pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM.
 Agua destilada.
 reactivo Nessler.
 Baño de hielo.
Equipos y material de vidrio.
 fiolas de 50 y 100 ml.
 07 tubos de ensayo de 10 ml.
 02 matraz de 100 ml.
 pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
 Equipo de baño maría.
 01 espectrofotómetro Espectronic 20D+
 01 termómetro de 0- 100 ºC

IV. PROCEDIMIENTO.
Preparación de muestras.
 Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de
amonio al 5x10-4 M
 Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0.3 M
Calibración del Espectrofotómetro.
A fin de transformar los valores de intensidad de color en
valores de concentración del producto formado (NH3), y por
tanto de actividad de la enzima se trazará una curva de

60
equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs. Concentración.
Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentración conocida, las que se neutralizan con reactivo
Nessler, para obtener diversas intensidades de color. Por la
dificultad del uso del NH3 se usará soluciones de sulfato de
amonio.
 Preparar solución madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M
 Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles
de Sulfato de Amonio, calcular las nmol de NH3 que
liberan cada una y su equivalencia con nmol de úrea.
Completar la siguiente tabla.

61
 Tabla Nº 1
PATRON nº Sol. de Contenido Contenido Equivalencia
sulfato(ml) nmol de nmol de en nmol de
sulfato NH3 úrea
1 50
2 100
3 150
4 200
5 250
6 300

 Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de

la práctica anterior.
 Completar la siguiente tabla.
Tabla Nº 2
Muestra Nº Volumen de NH3 en la Absorbancia
sulfato tomado ( muestra
ml) (nmol)
Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación
que relaciona DO vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadísticos que sean
necesarios.
Pruebas cinéticas.
 A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6
muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se
muestra.
 Preparar solución madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato
Tabla Nº 3

Tubo Ure Ure Buffe Incub Urea Incub Bañ Nessl Repos Volum Ab
a a r ar sa ar o er ar en s
µM o.3 fosfa 37°C ml 37°C hiel ml 5 final 42
ol M to ml 3 15 o min. ml 0
ml min min nm
.
Blan 0 0 7.0 0.5 0.5 8
co
1 60 0.2 6.8 0.5 0.5 8

62
2 120 0.4 6.6 0.5 0.5 8
3 180 0.6 6.4 0.5 0.5 8
4 240 0.8 6.2 0.5 0.5 8
5 300 1.0 6.0 0.5 0.5 8
6 360 1.2 5.8 0.5 0.5 8
 Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que
reacciona ( de la curva de calibración), y completar la
tabla 4

Tabla Nº 4
Muestra [urea] en Densidad Nmol de Nmol de
nmol/ml x10- óptica NH3 urea que
2
(Abs) producidos reaccionan
1 0.1
2 1.0
3 3.0
4 4.0
5 5.0
6 6.0
Blanco -
Tratamiento de datos.
 Para cada muestra calcular la velocidad de reacción
mediante la relación v = P/t, donde (p) es nmol de NH3
producidos, y (t) es el tiempo de reacción enzimática ( 15
min.) y completar la siguiente tabla.
Tabla 5
Muestra [S] nmol/ml. 1/[S] V(nmol/min.) 1/v
1
2
3
4
5
6
 Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.
 Estimar el valor de Vmax.
 Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una línea recta.
 Determinar gráficamente los valores de Vmax. Y Ks.
 Escribir la ecuación que representa a esta reacción
enzimática.

V. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________

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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
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VII. BIBLIOGRAFÍA
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64
 PRACTICA 12

EXTRACCION
PRACTICADE 12ADN DE

HIGADO DE POLLO
EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE
POLLO

65
I. OBJETIVO

Extraer ADN de un tejido animal

II. MARCO TEORICO

El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el

almacenamiento y la transferencia de la información genética.
Son componentes fundamentales de la célula y constituyen en
conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.

Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan

formando núcleo proteínas, ya que suelen unirse a
determinados tipos de estas, como las histonas.

El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el

núcleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se
sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula y también
cloroplastos y mitocondrias en pequeñas cantidades.

Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos

dirigen y llevan a cabo la síntesis de proteínas, y por tanto de
las enzimas necesarias para el funcionamiento celular.

Por otra parte el ADN es el vehículo de la herencia que se

transmite de padres a hijos de generación en generación.

III. FUNDAMENTO:

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente

sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas
celulares para liberar los núcleos, para ello se tritura el hígado
de pollo en un mortero.

Al añadir una solución hipertónica, como el NaCl 2M, se

produce el estallido de los núcleos, el detergente forma un
complejo con las proteínas y las separa del ADN, El alcohol
tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando
para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a
simple vista, que se pueden colorear mediante un colorante
selectivo para ADN como el anaranjado de acridina.

66
IV. MATERIALES

 Hígado de pollo 10 gr
 Cloruro de sodio 2M
 Etanol 96|°
 SDS 20%
 Arena
 Varilla de vidrio
 vasos de precipitados
 Mortero
 Embudo
 Pipetas
 Probetas
 Gasa

V. METODOLOGÍA

1.- Triturar 10 gr de hígado de pollo, dentro de un mortero,

con la adición de 5gr de arena lavada, para promover el
rompimiento de las membranas celulares.

2.- Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta

obtener una papilla.

3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando

separar los restos de tejido que quedaron sin romper
membranas.

4.- Medir el volumen del filtrado final.

5.- Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo

todo a un vaso de precipitados.

6.- Añadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío, por

las paredes, logrando se formen dos capas, en la interface
precipita el ADN.

8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la

misma dirección tratando de hilar las fibras de ADN; sobre

67
la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN
visibles a simple vista, que es el resultado de la agrupación
de muchas fibras de ADN.

68
VI. CUESTIONARIO
1. ¿De qué está formada la cromatina?
2. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el
hígado?, ¿para qué añadimos arena al triturado?
3. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M?
4. ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y
etanol, con que finalidad

VIII. OBSERVACIONES
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_____________________________________________________________________________________
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IX. CONCLUSIONES
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X. BIBLIOGRAFÍA
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