Citometría de flujo

INTRODUCCIÓN
La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de
análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en
suspensión. El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer
pasar células u otras partículas en suspensión alineadas y de una en una por
delante de un haz luminoso. La información producida puede agruparse en
dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la
relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula
o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas
detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se
convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora

La citometría de flujo (CMF) constituye una técnica de avanzada,

automatizada, objetiva y altamente sensible, muy útil para el estudio del
inmunofenotipo de las células normales y anormales.1

Este procedimiento permite realizar análisis multiparamétricos del

componente celular en suspensión de una manera individual, célula a célula,
a través de sus características físico-químicas e identificar la expresión de
proteínas celulares, lo que hace que con los procedimientos de disgregación
de tejidos, como son los órganos linfoides o la piel, se pierda información
sobre la localización tisular de cada una de las células presentes en la
muestra. En estos casos, se recomienda emplear técnicas de
inmunohistoquímica.

La citometria de flujo
La citometría de flujo es una técnica de amplia utilización en investigación
biomédica, pero que también tiene un uso importante en la práctica del
diagnóstico clínico. Dado que la citometría está naturalmente preparada para
estudiar partículas en suspensión en un medio líquido, tejidos humanos
como la sangre, la médula ósea, el líquido cefalorraquídeo, o producidos en
procesos patológicos (derrame pleural, derrame sinovial) o en el curso de
técnicas diagnósticas (lavado broncoalveolar, por ejemplo), son muestras
biológicas especialmente preparadas para la aplicación de técnicas de
citometría de flujo. No es de extrañar pues que las especialidades de
Hematología y de Inmunología sean las que han contemplado mayor
aplicación de esta tecnología en sus actividades rutinarias de diagnóstico y
seguimiento de los pacientes. En este artículo vamos a repasar someramente
las aplicaciones principales de la citometría a la práctica de la pediatría,
lógicamente a las enfermedades hematológicas e inmunitarias de los niños.

¿Cómo Funciona el citómetro de flujo?

Un citómetro de flujo se encuentra compuesto por tres principales sistemas,
el de fluidos, el óptico, y el electrónico (Figura 1) (Shapiro, 2003). En este
apartado se abordará con detalle en qué consiste cada uno de ellos.

Componentes de un citómetro de flujo. Éste se integra por tres sistemas: el

sistema de fluidos, que se encarga de transportar las células hacia el haz de
luz; el sistema óptico, compuesto por láseres y detectores que registran la luz
emitida por la célula, y un sistema electrónico que recibe las señales
luminosas y las codifica en gráficos.
Sistema de fluidos

Su principal función es alinear y transportar a las células dentro de una

cámara de flujo hacia el haz de luz; por tanto, es necesario que la muestra se
encuentre suspendida en un fluido (Hoffman, 2008). Para lograrlo, se aplica
una propiedad hidrodinámica, que consiste en la inyección de la muestra en
el centro de una corriente de fluido envolvente, el cual puede ser agua o un
buffer de fosfatos. Lo anterior se logra porque la presión de la muestra es
mayor que la presión del líquido envolvente. Gracias a este sistema, las
células pueden ser alineadas en “fila india”, y de esta manera se asegura que
el haz de luz incida sobre una célula a la vez (Hoffman, 2008).

Sistema óptico

El sistema óptico está compuesto por láseres y filtros, que se encargan de

iluminar a las células y dirigir las señales resultantes hacia los detectores
apropiados. Las células, al ser incididas por el láser, tendrán la capacidad de
dispersar la luz de acuerdo con su tamaño y su granularidad. En caso de que
la luz se disperse frontalmente, se obtendrá un parámetro denominado FSC
(forward scatter), que indica el tamaño de la célula (Figura 2) (Hawley &
Hawley, 2004; Shapiro, 2003). Por tal motivo, aquellas células marcadas con
fluorocromos serán excitadas por el láser y la luz será dirigida hacia un
detector, el cual recibirá la longitud de onda emitida por la excitación del
fluorocromo. Gracias a este sistema, se puede conocer el tamaño y la
granularidad de la célula, así como las proteínas que se expresan
(marcadores), permitiendo así la identificación de diferentes tipos celulares.
A medida que el citómetro posea más detectores, mayor será su capacidad
para identificar poblaciones celulares (Hoffman, 2008).

Sistema electrónico
Una vez que la señal luminosa es generada cuando el haz de luz incide en la
célula, ésta debe traducirse en señales electrónicas. El sistema electrónico
consta de sensores luminosos como fotodiodos y fotomultiplicadores, que
tienen la finalidad de convertir los fotones en electrones y éstos, a su vez, en
corriente eléctrica. De este modo, la señal eléctrica es recibida por la
computadora y traducida en gráficos e histogramas (Marti et al., 2001).

Imagen anterior. Dispersión de luz. La imagen representa la dispersión de la

luz emitida una vez que el haz de luz incidió sobre la membrana celular. La
desviación frontal de la luz determina el tamaño celular (FSC) mientras que la
dispersión lateral determina la complejidad (SSC).

Anticuerpos monoclonales acoplados a fluorocromos

Como se mencionó anteriormente, el marcaje celular con anticuerpos
monoclonales acoplados a fluorocromos, representa un paso crucial para la
identificación de subtipos celulares mediante el uso de la técnica de
citometría de flujo (Barberena, Ríos, & Muñiz, 2014). Los anticuerpos
monoclonales permiten detectar y “etiquetar” poblaciones específicas de
células. Esta tecnología consiste en la creación de un anticuerpo que sea
capaz de unirse a una estructura específica (antígeno), mismo que se expresa
en el tipo celular que se requiere identificar. Adicionalmente, este anticuerpo
debe contener una unión covalente a un fluorocromo, que emitirá luz
fluorescente cuando sea excitado por el láser (Mao & Mullins, 2010); de este
modo, la célula se “tiñe” y facilitará la identificación de las células que se
unieron al anticuerpo o marcador.
Análisis de resultados
Los resultados obtenidos pueden ser representados mediante diferentes
estilos, desde una gráfica de puntos hasta una figura tridimensional; la clave
se centra en seleccionar los gráficos que reflejen los resultados con precisión
y sin generar confusiones. A continuación se describen las representaciones
más utilizadas en esta área:

Gráfico de puntos: Este gráfico muestra la relación entre dos marcadores

diferentes y muestra a cada punto como un evento (se define como evento a
cualquier partícula que haya sido excitada por el láser). Por tal motivo, el
desplazamiento de los puntos hacia la derecha indica la expresión de un
marcador X, mientras que el desplazamiento de los puntos hacia arriba,
muestra la expresión de un marcador Y, siguiente figura.

Gráficos de densidad: Estos gráficos, además de representar a las

poblaciones con base en la expresión de dos marcadores, muestran la
frecuencia relativa (densidad) de las poblaciones; por ejemplo, las
poblaciones con mayor número de eventos se representan mediante tonos
de gris más intenso (gráfico de zebra), mediante colores cercanos al naranja
(gráfico pseudocolor), o mediante líneas (gráfico de contornos).
Gráficos de puntos y de densidad. La figura muestra las poblaciones de
linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos, representadas en gráfico
de puntos, pseudocolor, zebra y contornos.

Histogramas: Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un

marcador versus el número de eventos. El desplazamiento de la curva hacia
la derecha indica mayor expresión del marcador, mientras que la altura del
pico indica la frecuencia de las células capturadas en la siguiente figura. En
este sentido, es importante recalcar que el área bajo la curva contiene a las
células que se están analizando.
Aplicaciones de la citometría de flujo
Por tratarse de una técnica de identificación y cuantificación específica de
células, la citometría de flujo facilita el diagnóstico o seguimiento de
patologías como leucemias, linfoma, inmunodeficiencia primaria, monitoreo
del estado hematológico de pacientes con infección de VIH, así como la
detección de células cancerosas o tumorales (Bürgisser et al., 1999; Lacombe
et al., 1997)as defined by CD28 and CD38 expression, and plasma viraemia
and CD4+ T cells in HIV-1 infection was investigated. In a cross-sectional study
of 46 patients with either no or stable anti-retroviral treatment, there was a
strong negative correlation between the percentage of CD8+CD28- and the
percentage of CD4+ T cells (r = -0.75, P < 0.0001. Adicionalmente, esta
herramienta permite analizar funciones celulares como la proliferación, la
fagocitosis y la apoptosis, por mencionar algunas. Lo anterior es posible
gracias a que en el mercado existen diversas moléculas fluorescentes que se
incorporan cuando las células realizan este tipo de funciones. Por ejemplo,
para determinar la proliferación celular, las células pueden ser teñidas por
medio de una molécula fluorescente denominada éster de succinimidil
carboxifluoresceína (CFSE), la cual se incorpora al interior de la célula, y ésta
es diluida cuando la célula entra en proliferación, es decir, la reducción en la
fluorescencia de la molécula indica mayor proliferación celular (Quah &
Parish, 2010). Por otra parte, la citometría de flujo también permite
identificar, caracterizar y separar poblaciones celulares (Mattanovich &
Borth, 2006). Los equipos que pueden realizar este trabajo se denominan Cell
Sorters. En la clínica, esta técnica tiene una importante función en la
purificación de células que posteriormente serán transplantadas a pacientes
con ciertas patologías. Tal es el caso de la nueva terapia aprobada por la FDA
para tratar linfoma de linfocitos B, la cual consiste en el transplante de
linfocitos T con receptores de antígeno modificados (CAR-T, por sus siglas en
inglés) (Androulla & Lefkothea, 2018; Schuster et al., 2017). Este proceso
implica purificar los linfocitos T del paciente y modificarlos genéticamente
para expresar un receptor de superficie específico para un antígeno de
cáncer, que a su vez se encuentra fusionado con un dominio proteico que
activa al linfocito T. Posteriormente, los linfocitos CAR-T se expanden y se
reinfunden en el paciente como una inmunoterapia para atacar a células
cancerosas (Androulla & Lefkothea, 2018)

Es importante señalar que la citometría no se limita al estudio de células,

pues por medio de esta técnica también se puede conocer la cantidad de
RNA o DNA que posee una célula, lo cual tiene una alta aplicación en el
pronóstico de diversos tipos de cáncer (Nunez, 2001).

Principios de la citometría
Existen varios componentes básicos en cualquier citómetro de flujo. Una
suspensión de células es inyectada en un líquido capaz de ordenar el flujo de
células de manera individual y a gran velocidad. Dicho flujo pasa por un
punto en el que incide la luz de al menos un láser, aunque los citómetros
actuales cuentan generalmente con 2 o más fuentes de luz. Desde este
punto, la luz incidente se transforma en emisiones a diferentes longitudes de
onda (diferentes fluorescencias), algunas de las cuales son recogidas por
detectores que amplifican las señales y las transforman a formato digital. Los
citómetros actuales están preparados para manejar simultáneamente entre 6
y 10 detectores. Toda esta información es integrada en un ordenador, capaz
de almacenarla para su análisis posterior.

La citometría puede estudiar partículas en suspensión, en nuestro caso,

células. De cada una de ellas es capaz de identificar una serie parámetros
intrínsecos, derivados del tamaño y la complejidad de la partícula (se refiere
a características de su envuelta y de su contenido), y parámetros extrínsecos,
derivados del marcaje de las partículas con sustancias que emiten
fluorescencia. En el caso que nos ocupa, estas sustancias son anticuerpos que
reconocen algún marcador y que están provistos de un fluoróforo, molécula
capaz de absorber y emitir fluorescencia.

Dado que se pueden medir múltiples parámetros por cada célula (fig. 1), la
población total estudiada puede dividirse en subgrupos cada vez menores,
según las características de interés. La información que se genera en el
análisis de los datos, bien de la población total o bien de las diferentes
subpoblaciones, se presenta de manera estadística. Lo más frecuente es el
porcentaje de células que cumplen algún criterio (p. ej., el porcentaje de
linfocitos T, aquellos que son positivos para el marcador CD3). Este tipo de
información se obtiene cuando dentro de la muestra existen células que son
positivas para un marcador y células que son negativas para el mismo. Existe
otra situación en la que lo que sucede es un cambio continuo en la expresión
de un marcador, existen células que lo expresan con poca intensidad
mientras otras lo hacen con intensidad elevada. En este caso se prefiere
utilizar el parámetro que es la intensidad media de fluorescencia y se habla
de poblaciones que son débilmente positivas o que son intensamente
positivas.

Imágenes de citometría de flujo de muestra de sangre periférica. A la

izquierda se representa la gráfica de todas las células sanguíneas ordenadas
según los niveles de expresión del marcador panleucocitario CD45 (eje
horizontal) y la complejidad celular (eje vertical). Los granulocitos expresan
niveles medios de CD45 y presentan gran complejidad celular (coloreados en
rojo); los monocitos expresan mayores niveles de CD45 y tienen menor
complejidad (coloreados en verde), mientras que los linfocitos son los
leucocitos que expresan el marcador a mayor intensidad y presentan menor
complejidad celular (coloreados en azul). En el medio se representa la gráfica
de todas las células sanguíneas ordenadas según los niveles de expresión del
marcador CD3 (eje horizontal) y el marcador CD56 (eje vertical). Ni los
granulocitos (rojos) ni los monocitos (verdes) expresan estos marcadores.
Una proporción de linfocitos (azules) tampoco los expresan, representando a
los linfocitos B. Los linfocitos T expresan CD3 y no CD56, están coloreados en
morado. Las células NK (natural killer) expresan CD56 y no CD3. Nótese las 2
subpoblaciones de células NK, unas expresan niveles bajos de CD56 (NKdim),
mientras las demás expresan niveles altos de CD56 (NKbright). A la derecha
se representa la gráfica de todos los linfocitos T ordenados según los niveles
de expresión del marcador CD4 (eje horizontal) y el marcador CD8 (eje
vertical).

Uso de la citometría en enfermedades malignas

El principal problema que requiere el apoyo de la citometría de flujo es, por
su frecuencia, el diagnóstico de niños con leucemias agudas. Son la causa
más frecuente de cáncer en la edad pediátrica, destacando las leucemias
linfoblásticas agudas. En el momento del diagnóstico se realiza un aspirado
de médula ósea, que se encuentra casi totalmente infiltrada por las células
leucémicas. Esta muestra es procesada para el estudio, que consiste en la
preparación de varios tubos que combinan un número amplio de anticuerpos
que reconocen otros tantos marcadores específicos de los estadios
madurativos de los linfocitos B o T, o de las células mieloides. De esta
manera, se identifica el linaje de la leucemia y su estadio madurativo. Ambas
informaciones tienen valor en el pronóstico y en el tratamiento de la
enfermedad.

Otra información muy importante que se obtiene en el momento del

diagnóstico es la identificación de marcadores específicos de la leucemia, que
permitirá reconocerla en muestras de médula ósea que se obtienen una vez
que se ha iniciado el tratamiento. Todos los protocolos actuales requieren
que se cuantifiquen los niveles de enfermedad mínima residual (EMR) en
momentos concretos durante el tratamiento, cuando el niño está en
situación de remisión completa. La importancia es tal que si dichos niveles
son superiores a un umbral determinado, el paciente deber recibir un
tratamiento más intenso o bien debe recibir un trasplante alogénico de
progenitores hematopoyéticos, puesto que su riesgo de recaída es muy
elevado en esa situación. La cuantificación de los niveles de EMR se realiza en
muchos centros mediante citometría de flujo. Para ello, el hematólogo
reconoce y cuantifica la presencia de células leucémicas buscando aquellos
marcadores que identificó el día del diagnóstico y que diferencian las células
malignas de las sanas3. En general, se aprovecha de alguna de estas
características: aberración antigénica (expresión de un marcador que no
corresponde al linaje de la leucemia), expresión asincrónica (expresión de un
marcador que no corresponde al estadio madurativo), sobreexpresión
antigénica (expresión de un marcador a una intensidad excepcionalmente
elevada) o fenotipo ectópico (expresión de un marcador ausente en la
hematopoyesis normal).

Una aplicación de la citometría de flujo que se está desarrollando en la

actualidad en el campo de las leucemias es la detección de células leucémicas
en el líquido cefalorraquídeo, para lo que presenta mayor sensibilidad que la
citología convencional.

Por último, la citometría de flujo puede identificar en muestras de médula

ósea la presencia de células tumorales metastásicas, por ejemplo, células de
neuroblastoma5. Estas células expresan marcadores distintos de los que
expresan las células hematopoyéticas normales, por lo que son fácilmente
identificables. Se puede aplicar en el momento del diagnóstico del tumor,
para la estadificación de la enfermedad, y también para detectar la presencia
de EMR durante el tratamiento.

Uso de la citometría en hematopatías no malignas

Las inmunodeficiencias son enfermedades de la edad pediátrica, para alguna
de las cuales el citómetro de flujo es una herramienta diagnóstica. La
ausencia de alguna población linfocitaria específica (linfocitos T, linfocitos B,
células natural killer [NK]), bien de manera aislada o bien combinada, es
fácilmente identificable en un análisis de una muestra de sangre periférica.
En el caso de la inmunodeficiencia por déficit de HLA clase II, la ausencia de
expresión de HLA-DR por parte de linfocitos y monocitos en una muestra de
sangre se detecta fácilmente también por citometría. Otra enfermedad
hematológica no maligna en la que la citometría apoya el diagnóstico es el
síndrome linfoproliferativo autoinmunitario. En este caso, un porcentaje
elevado de linfocitos T que no expresan ni CD4 ni CD8, linfocitos T dobles
negativos, es un criterio diagnóstico.
La citometría de flujo en el diagnóstico de inmunodeficiencias no solo se
utiliza para cuantificar poblaciones de células inmunitarias, sino que también
se emplea en ensayos funcionales.

Uso de la citometría en el trasplante hematopoyético

Desde hace más de una década, una de las fuentes de progenitores

hematopoyéticos más empleadas es la sangre periférica movilizada. Siempre
que se utiliza esta fuente, hay que conocer la cantidad total de células
progenitoras presentes. El número absoluto de progenitores por kilo de peso
del receptor debe alcanzar un nivel que garantice el injerto. Dicha
cuantificación se realiza mediante citometría de flujo de manera rutinaria,
evaluando el porcentaje de células que expresan el marcador CD34 en el
producto de aféresis.

En algunos centros se realizan técnicas de manipulación celular en el inóculo

antes del trasplante de donante alogénico o haploidéntico. El objetivo es
eliminar los linfocitos maduros que pueden ocasionar una complicación muy
temida, la enfermedad injerto contra huésped (EICH). Los métodos
empleados consisten en la aplicación de técnicas inmunomagnéticas para
purificar los progenitores (selección positiva) o para eliminar los linfocitos
maduros (selección negativa). Al final del procedimiento y antes de infundir
las células recuperadas, el médico necesita conocer la cantidad de
progenitores y la cantidad de linfocitos contaminantes del inóculo. Esta
información se consigue mediante citometría de flujo realizada sobre una
muestra del producto que se trasplantará. Este estudio también sirve de
control de calidad del procedimiento de manipulación realizado ( siguiente
figura).
Análisis del resultado de un procedimiento de eliminación de linfocitos T en
muestra de aféresis. A la izquierda se representa la muestra antes del
procedimiento, y a la derecha después. En la parte superior se muestran los
linfocitos T CD4 y en la inferior los T CD8. La cuantificación se realiza sobra
la base de la cantidad de células contenidas en las áreas representadas en
las elipses. Para identificar los linfocitos T se combinaron anticuerpos anti-
CD4, anti-CD8 y anti-TCRαβ.

En el periodo después de realizar un trasplante hematopoyético, las células

infundidas deben regenerar tanto la hematopoyesis como el sistema
inmunitario. Esto sucede a lo largo del tiempo, y las interferencias con la
recuperación normal aumentan el riesgo de infecciones. La cinética de
reconstitución depende de muchos factores: tipo de acondicionamiento para
el trasplante, fuente de células hematopoyéticas, tipo de inmunosupresión,
compatibilidad donante-receptor8–10. Cuando el trasplante es alogénico o
haploidéntico, la reconstitución inmunitaria puede acompañarse de EICH. La
citometría de flujo puede ayudar a estudiar la cinética de la reconstitución
inmunitaria postrasplante. Para ello es preciso analizar muestras de sangre
del receptor a diferentes momentos postrasplante. Las primeras poblaciones
en aparecer tras el periodo de aplasia son células mieloides (sobre todo
granulocitos) y células NK. La detección de un porcentaje mayoritario de
linfocitos T CD8 en los días periinjerto suele indicar el rechazo del trasplante
y refleja la proliferación de los linfocitos citotóxicos del receptor frente a las
células infundidas del donante. La recuperación de cifras normales de
linfocitos B y T sucede de forma gradual durante el primer año postrasplante.
La recuperación funcional, por ejemplo la producción de inmunoglobulinas,
se retrasa respecto de la recuperación numérica. La citometría de flujo puede
identificar en cada momento cómo se están regenerando las diferentes
subpoblaciones de linfocitos T memoria, el número de linfocitos naïve
circulantes, la ratio CD4:CD8 y otros muchos parámetros que pueden
relacionarse con el estado clínico del paciente.

Inmunofluorescencia
El término inmunofluorescencia se usa para describir las técnicas en que se
emplea un fluorocromo para marcar un anticuerpo. Ya en 1941, Coons5
informó de la aplicación de esta técnica para localizar antígenos y
anticuerpos en secciones de tejido. El descubrimiento de los anticuerpos
monoclonales por Kohler y Milstein en 19756, incrementó dramáticamente el
uso de la inmunofluorescencia para la identificación de antígenos de
superficie celular.

La fluorescencia ha sido usada para visualizar ciertas moléculas y estructuras

por medio de la microscopia óptica durante muchos años. Esta ha
encontrado una extensa área de aplicación en la citometría de flujo. La
capacidad para detectar simultáneamente la fluorescencia de dos, tres,
cuatro o actualmente hasta 13 fluorocromos de diferentes longitudes de
onda, abre completamente el campo del análisis multiparamétrico.
PARÁMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRÍA DE
FLUJO
La citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula.
Éstos se dividen en (Figura 2):

• Parámetros nucleares

• Parámetros citoplásmicos

• Parámetros de superficie

• Parámetros extracelulares

En la Tabla I se resumen los parámetros que pueden ser medidos por medio
de esta técnica. Un aspecto importante y que representa una ventaja de ella,
es la posibilidad de medir tantos parámetros como anticuerpos se dispongan
para ello, marcados con distintos fluorocromos. Así, es posible caracterizar
una célula por su fenotipo de superficie (Figura 3) y, al mismo tiempo,
conocer el estado intracelular que guarda la célula como su patrón de
secreción de citocinas, o bien, la etapa del ciclo celular en la que se
encuentra.

APLICACIONES CLÍNICAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Inmunofenotipificación

La citometría de flujo es una técnica que permite un análisis celular

multiparamétrico de forma rápida, sensible y específica. La disponibilidad de
amplios paneles de reactivos de gran calidad facilita la aplicación de este
método analítico en el diagnóstico, clasificación, evaluación pronóstica y
valoración de enfermedad mínima residual. La citometría de flujo permite el
análisis de un gran número de células (habitualmente entre 10,000 células
por muestra y, más de un millón en los estudios de enfermedad mínima
residual). La aplicación de la citometría de flujo al análisis celular permite
conocer aspectos físicos de la célula (tamaño y complejidad) y determinar la
presencia o ausencia de determinados antígenos (habitualmente entre 3 y 4)
en los diferentes compartimentos celulares (superficie celular, citoplasma,
mitocondria y núcleo) lo que contribuye a aumentar, tanto la especificidad
como la sensibilidad de la prueba. En otras áreas como en el diagnóstico y
clasificación de las inmunodeficiencias primarias, en el monitoreo de
enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso
sistémico10 y la artritis reumatoide11, la citometría de flujo ha demostrado
su utilidad. También se ha demostrado útil en el seguimiento de la
recuperación inmune tras el trasplante de médula ósea, en la identificación
precoz del rechazo en pacientes que han recibido un trasplante alogénico, o
en el monitoreo terapéutico de los enfermos con anemia aplásica. En la Tabla
II se condensan algunas de las aplicaciones clínicas más importantes y con
mayor empleo en la actualidad.
APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA INVESTIGACIÓN
BÁSICA
Son innumerables las aplicaciones de la citometría de flujo a la investigación
básica, desde campos como la microbiología, hematología, inmunología,
citología, patología, biología celular y molecular, entre otros. Sin embargo, es
posible intentar clasificar dichas aplicaciones según el área específica en la
que es posible utilizar la citometría de flujo como herramienta de
investigación (Tabla III). La citometría de flujo ha sido utilizada en el
monitoreo del contenido de ADN15, expresión fenotípica, transporte de
drogas, flujo de calcio16, proliferación y apoptosis17. Virtualmente es posible
marcar cualquier molécula que sea de interés siempre que se disponga de un
anticuerpo acoplado a un fluorocromo que pueda ser detectado por el
citómetro de flujo, esto hace posible que las aplicaciones del citómetro de
flujo se adapten prácticamente a cualquier necesidad de investigación.
Actualmente, la relación entre la aplicación básica y clínica es cada vez más
estrecha dando la oportunidad a su vez a la aplicación diagnóstica, pronóstica
y de tratamiento en múltiples enfermedades.

CITOMETRÍA DE FLUJO Y LA INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES

PULMONARES
En los últimos 20 años, la citometría de flujo ha jugado un papel primordial
en el avance del entendimiento y habilidad para diagnosticar una variedad de
desórdenes linfoproliferativos18. Una de las aplicaciones nuevas más
interesantes es en la evaluación de pacientes con enfermedades
inmunológicas del pulmón19. Una muestra típica es aquella que es
recolectada a partir de lavados bronquioalveolares (LBA), cuya utilidad
diagnóstica ha quedado ampliamente demostrada20-25. Cuando el lavado es
realizado en pulmones normales, la célula presente más predominante es el
macrófago, el cual está en un porcentaje de aproximadamente 90% o más de
celularidad. Los linfocitos usualmente representan menos del 10% de la
población celular, los granulocitos representan la población celular
minoritaria con el 1-2%26. En fumadores, el porcentaje de linfocitos es aún
menor27. En muchos pacientes con enfermedades pulmonares
inmunológicas, el LBA puede estar acompañado por un incremento en
linfocitos o eosinófilos. Cuan o las células que están incrementadas son los
linfocitos, resulta importante saber qué subpoblación se encuentra elevada.
La citometría de flujo es ideal para esta evaluación. La proporción relativa de
linfocitos, macrófagos y granulocitos se determina fácilmente a partir de
gráficas de tamaño (Forward scatter FSC) contra complejidad celular (Side
scatter SSC). Los estudios de fluorescencia empleando diferentes
fluorocromos permiten determinar fácilmente la composición de
subconjuntos de linfocitos (CD4+ y CD8+). De esta manera, es posible ensayar
hasta siete colores, con citómetros modernos, que representan siete
marcadores diferentes sobre poblaciones celulares, requiriéndose sólo una
pequeña cantidad de muestra (250,000 células en 50µL) a partir de un LBA.

Por ejemplo, un incremento en el número de células inflamatorias en un LBA

sugiere una alveolitis28. El tipo de células en el lavado puede correlacionar
con el tipo de inflamación visto en las paredes alveolares de la biopsia.
Aunque esas correlaciones no son diagnósticas, pueden ayudar en el
diagnóstico cuando son combinadas con otros datos
 Conclusión
La citometría de flujo (CMF) es una técnica de avanzada, altamente sensible y
automatizada, que se emplea para el inmunofenotipaje de las células
normales y leucémicas. En este artículo se muestran los principales aspectos
metodológicos a tener en cuenta para un mejor desarrollo e interpretación
del inmunofenotipo por CMF, entre los que se encuentran: tipo, cantidad,
conservación y transportación de la muestra, uso de anticoagulantes, empleo
de anticuerpos monoclonales y fluorocromos, lisado de hematíes, fijación
celular, así como la calibración y compensación de la auto-fluorescencia.
Finalmente, se exponen las principales aplicaciones de esta metodología para
definir el estado de maduración celular leucémico, clasificar las leucemias
agudas en distintos subtipos inmunológicos, identificar subgrupos de mal
pronóstico y detectar fenotipos aberrantes. Todo lo anterior resulta de gran
utilidad para el diagnóstico de la enfermedad mínima residual que permite
estratificar a los pacientes en diferentes grupos de riesgo e individualizar el
tratamiento antileucémico.
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http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/MCF.pdf