Citometría de Flujo

Técnicas instrumentales avanzadas

Bloque II

CITOMETRÍA DE FLUJO - T.I.A

1
 Introducción
La citometría de flujo es una tecnología que permite evaluar diferentes
características simultáneamente de célula o partícula en suspensión individuales.
Parámetros típicos, como son el tamaño y la complejidad interna, así como, algún
componente celular o la función marcada con fluorescencia pueden ser evaluados en un
número representativo de células. Aunque la citometría de flujo es una tecnología
relativamente reciente, sus características especiales como técnica de análisis celular
han propiciado en la última década un rápido incremento en su uso, tanto en los
laboratorios de investigación básica como en los laboratorios clínicos. A nivel de
diagnóstico, la citometría de flujo es una aliada valiosa en aquellas patologías que se
caracterizan por cambios en las poblaciones celulares o alteraciones en los marcadores
de superficie de alguna población celular del cuerpo. En este sentido, se usa para el
diagnóstico de enfermedades hematológicas, como las inmundeficiencias primarias y
secundarias (e.g. SIDA), el tratamiento y diagnóstico de leucemias y linfomas, y también
tendría un papel importante en el área de los trasplantes de médula ósea.

Modelos de citómetros de flujo

En esta sección se definen los conceptos de la citometría de flujo (CF), y los

sistemas que integran un citómetro de flujo. Al final se mencionan algunas aplicaciones
actuales de esta tecnología para ilustrar su utilidad.

Como se indicó más arriba, la Citometría de flujo es una tecnología que permite
medir características individuales de las células, mientras éstas pasan en suspensión en
una corriente de fluido. Es una disciplina orientada tecnológicamente a la determinación
multiparamétrica de elementos celulares tanto morfológicos como moleculares. En la CF
las partículas o células en suspensión viajan a través de una corriente de fluido hasta el
punto donde un láser incide sobre ellas y se generan señales que son recogidas por
diferentes sensores. En algunos equipos, un separador de células, conocido en inglés
como “cell sorter” o “flow sorter”, tiene dispositivos, ya sea mecánicos o eléctricos, que
son capaces de seleccionar y colectar células (Shapiro, 2003, Barrera y cols, 2004).

Se conoce como parámetro a la característica física o química de una célula que

puede ayudar a identificarla dentro de una población celular (Shapiro, 2003). Por medio
de CF se pueden analizar numerosos parámetros en una célula, dentro de ellos están:
tamaño y complejidad interna (relacionada con las membranas internas), receptores de
superficie, proteínas intracelulares, cambios en la membrana celular, ácidos nucleicos y
síntesis de ADN, metabolismo celular y otros. La capacidad de medir simultáneamente
múltiples parámetros celulares se debe a la disposición de varios sensores de diferente
naturaleza. La detección de la desviación de luz permite obtener el tamaño y complejidad.
Otras características son determinadas por la fluorescencia emitida proveniente de
cualquier componente celular o función, marcada con un colorante fluorescente o
fluorocromo excitable mediante el láser.

Actualmente existen numerosas aplicaciones de esta tecnología, muchas de las

cuales están altamente automatizadas y son regularmente empleadas como métodos
diagnósticos. Además, las compañías fabricantes se han esforzado en desarrollar
mejoras técnicas en los equipos, así como en los programas de análisis (software) para
ampliar las capacidades y confiabilidad de los equipos que son empleados en centros de
investigación. El citómetro de flujo está constituido por diversos sistemas los cuales se
describirán a continuación de manera breve.

La citometría constituye un complemento valioso de las técnicas clásicas utilizadas para el

estudio de la morfología, biología y bioquímica celular. Ha sido empleada en diferentes disciplinas
tanto en investigación básica como clínica.

Sistemas de un citómetro de flujo

Un citómetro de flujo está compuesto por tres principales sistemas:

• Fluidos: Para introducir y alinear a las células para ser medidas.

• Ópticos: Una fuente de excitación y colección óptica para generar y colectar
las señales de luz.
• Electrónicos: Conversión de señales ópticas a señales electrónicas.
 Estos tres sistemas sumados con los avances en diseño de programas de
computación permiten el análisis de múltiples parámetros de una célula, así como un gran
número de ellas (Ormerod, 2008). La Figura 1 muestra un esquema general de los tres
sistemas que integran un citómetro de flujo.

Figura 1. Vista general de la citometría de flujo. Se representa a una célula con receptores
de membrana y membranas internas, que sumados a su tamaño le dan características
propias. Se representa de manera general el análisis que se realiza de una célula con ayuda
de la citometría de flujo.

Sistemas de fluidos

El sistema de fluidos se encarga de transportar y alinear a las partículas dentro de

una celda o cámara de flujo en la cual son alcanzadas por una fuente de luz para medir
las diferentes características de las partículas (Macey, 2010). Es importante señalar que
las células o partículas deben estar en suspensión para que el sistema de fluidos cumpla
con su función. Al mecanismo para alineación de células también se le conoce como
enfoque hidrodinámico y consiste en la inyección de la muestra en el centro de una
corriente, conocida también como fluido envolvente y este puede ser agua o un
amortiguador de fosfatos.

El fluido envolvente mejora la precisión con la que las células se colocan en la

región de observación del citómetro, ya que se restringe a las células en el centro del flujo
de la muestra y reduce la posibilidad de obstrucciones del sistema (Shapiro, 2003). Si el
sistema no se perturba, el fluido envolvente y la corriente de la muestra no se mezclan y
se logra que las células viajen en de una en una a través de la cámara de flujo (Ormerod,
2008; Macey, 2010). Sin embargo, existen citómetros de nueva generación (como el que
emplearemos en prácticas) que no precisan de fluido envolvente.

Figura 2. En este esquema se muestran la cámara de flujo y las flechas señalan la dirección
de los fluidos.

Existen dos tipos principales de cámaras de flujo: la cámara abierta y la cerrada. De

hecho, en el diseño de cámaras cerradas hay dos subtipos (Figura 2). Las cámaras
cerradas están hechas con paredes de cuarzo, las cuales permiten el paso suave,
continuo y no pulsátil de la muestra. El punto de interrogación, es decir, el lugar donde la
luz incide en la muestra, se encuentra dentro de la cámara (Ormerod, 2008).
 La cámara abierta (Figura 2B), es utilizada en los citómetros que hacen separación
por deflexión electrostática (Dean y Hoffman, 2007). En este tipo de cámara, se genera
suficiente presión para que el fluido que contiene la muestra salga en un chorro fuera de
la cámara con las células enfocadas (Hoffman, 2008). A este tipo de flujo se le conoce
como chorro en aire o por las palabras en inglés “jet in air”. El punto de interrogación de la
muestra se encuentra inmediatamente después del orificio de salida (Hoffman, 2008;
Ormerod, 2008). Existen otros tipos de sistemas de fluidos que usan estrategias
diferentes para alinear a las células en la cámara de flujo: bombas peristálticas, enfoque
acústico y celda de flujo microcapilar.

Sistema óptico

Este sistema se compone de la óptica de excitación y consiste en una fuente láser

que incide sobre las partículas o células (teñidas o sin teñir) y la de colección que se
encarga de la detección de la desviación de luz y fluorescencias (Hoffman, 2008). La
fuente de luz puede ser diferente en cada modelo de citómetro, como lámparas de arco,
LED o, más frecuentemente, láser (Shapiro y Telford, 2009). El láser más común en los
citómetros actuales de diferentes fabricantes es uno de argón, enfriado por aire, que
produce una luz azul de 488nm, pero también existen instrumentos con otros tipos de
láser o algunas que equipan varios a la vez (Shapiro y Telford, 2009; Macey, 2010).

Figura 3. Dispersión de luz por parte de una célula.

 La membrana celular produce una desviación de luz con ángulo pequeño de 0.5 a
5° con respecto al eje del láser, conocida como dispersión frontal o FSC, por las siglas en
inglés de “forward scatter”, y ésta genera un cono que refleja el tamaño de la célula
(Figura 3). Por otro lado, la luz que se interna dentro de la célula, se encuentra con las
membranas internas y se desvía en cualquier ángulo. La luz dispersada por membranas
internas se conoce como dispersión lateral o SSC (side scatter) y se toma en cuenta la
que tiene un ángulo de aproximadamente 90°. Entre más membranas internas más
dispersión lateral se genera (Ormerod, 2008). La óptica de colección consiste en lentes
de colección y filtros ópticos. Un lente de colección se encarga de dirigir la luz desviada
frontalmente por la célula (FSC, por sus siglas en inglés) hacia el detector
correspondiente, mientras que otro lente se encarga de dirigir la luz desviada lateralmente
(SSC, por sus siglas en inglés) y la fluorescencia hacia los filtros ópticos (Macey, 2010).

Figura 4. Esquema general del arreglo del sistema óptico.

Los filtros dicroicos permiten el paso de luz en un intervalo de longitud de onda y

refleja la que esté fuera de ese intervalo (Shapiro, 2003). En la Figura 4 se muestran los
diferentes tipos de filtros: Los de longitud amplia (longpass) permiten la transmisión de luz
de longitud de onda mayor mientras que refleja la de menor longitud de onda; los de
longitud corta (shortpass) permite el paso de la luz de longitud de onda corta. Los filtros
que en este texto llamaremos de intervalo (bandpass), permiten solamente el paso de
longitudes de onda en un intervalo (o banda) y el resto lo reflejan (Hoffman, 2008). El uso
de diferentes filtros dicroicos permite que las señales luminosas se dirijan a los detectores
adecuados. Se han utilizado diferentes arreglos geométricos en los componentes del
sistema óptico para la lectura de dos o más de 10 fluorescencias según el modelo de
citómetro (Macey, 2010; Hoffman, 2008). En la Figura 4 se muestra un arreglo del
sistema óptico que fue adoptado por varios modelos de citómetros (Ormerod, 2008). Los
citómetros FASCan y FACSCalibur tienen un arreglo muy similar.

Sistema electrónico

Las señales luminosas generadas cuando el láser incide en la célula deben

traducirse a señales electrónicas, y para lograr este propósito se requieren sensores
sensibles a la luz capaces de esta conversión de las señales (Dean y Hoffman, 2007).
Los dos tipos principales de sensores luminosos son los fotodiodos y los
fotomultiplicadores (Hoffman, 2008).

Los fotodiodos son utilizados principalmente para detectar la extinción y la

desviación de luz frontal, es decir FSC, puesto que la señal es alta en energía. Este
fotodetector se encuentra en el mismo eje del láser y se coloca un filtro que obstruye y
refleja la luz que atraviesa la muestra o se emite directamente el láser, y de esta manera
se evita que interfiera con la señal de FSC y dañe el fotodiodo (Shapiro, 2003).

Los fotomultiplicadores, o PMT por sus siglas en inglés, son requeridos para captar
señales más débiles, como la fluorescencia y la dispersión lateral (SSC) (Dean y
Hoffman, 2007). El PMT es un tubo de vacío que capta la luz por un fotocátodo y libera
electrones en el interior del tubo que se amplifican en número con ayuda de un gradiente
de voltaje generados por una serie de electrodos llamados dínodos, llegan al ánodo en
una señal amplificada. El suministro de alto voltaje para el PMT hace que el costo sea
mayor que un fotodiodo (Shapiro, 2003).

Los electrones que se generan en los detectores cuando captan los fotones, se
convierten en una corriente eléctrica que es proporcional a la señal detectada. Este pulso
es amplificado aplicando un mayor voltaje, en escala lineal o logarítmica. Los am-
plificadores lineales son útiles para el estudio de poblaciones celulares con un intervalo
de intensidad de señal muy estrecho, los estudios del contenido de ADN son un ejemplo.
Por otro lado, los amplificadores logarítmicos son mejores para las poblaciones con un
amplio intervalo de intensidades (Shapiro, 2003; Hoffman, 2008).

Un convertidor análogo-digital (ADC, por su nombre en inglés analog-to-digital

converter) transforma el pulso de voltaje análogo de 0 a 1000 mV en un número que
representa un canal, en una escala de 0 a 1024 canales. Estos valores se transfieren a la
computadora por medio de una interfaz de entrada y salida de propósito general (GPI0,
por sus singlas en inglés) y se pueden representar en una gráfica con ayuda de un
programa computacional (Hoffman, 2008).

Fluorescencia

Las moléculas fluorescentes, también conocidas como fluorocromos, tienen la

característica de poseer dobles enlaces conjugados. Los electrones que se encuentran
en estos enlaces son capaces de absorber energía luminosa, ya que al estar en enlace
pi, se excitan de manera más fácil a orbitales de mayor energía. La energía absorbida se
emite cuando el electrón regresa a su estado inicial, pero parte lo hace en forma de calor
y como consecuencia, la luz emitida es de mayor longitud de onda y menor energía. Cada
fluorocromo absorbe en una longitud de onda específica de luz, y emite en otra longitud
también característica como se muestra en el Cuadro 1 (Shapiro, 2003; McCarthy, 2010).

Tabla 1. Ejemplos de fluorocromos, longitud de onda de excitación y de emisión y el tipo de

láser que se requiere para su detección.
 Existen recomendaciones para una selección adecuada de fluorocromos con base
en sus características (Ormerod, 2008, McCar- thy, 2010). A continuación se enumeran
las más importantes:

• El espectro de excitación debe coincidir con la longitud de onda de los

láseres disponibles en el citómetro.
• Deben tener intensidades de fluorescencia altas al asociarse a las células
• Deben mostrar poca superposición en los espectros de emisión entre ellos.
• Se puedan unir fácilmente a estructuras químicas.

Compensación

Los fluorocromos muestran un espectro de emisión que puede superponerse en el

espectro de emisión de otro fluorocromo (Macey, 2010), como se puede apreciar en la
Figura 5. Si este efecto no se corrige la fluorescencia de FITC, por ejemplo, hace una
contribución de señal al PMT correspondiente a un fluorocromo con un espectro de
emisión adyacente, como el PE. La compensación es el proceso matemático por el cual
se elimina la superposición entre fluorocromos (Tung y cols., 2007; Ormerod, 2008). La
compensación es muy importante para obtener datos confiables de las muestras
analizadas, por lo que se han diseñado programas de computación que permiten realizar
este proceso, en forma manual, o completamente automática y con la opción de una
compensación de los datos posterior a la adquisición (Tung y cols., 2007).

Figura 5. Esquema representativo de los espectros de emisión de FITC y PE. Los

rectángulos con línea punteada representan los filtros que colectan la señal de cada
fluorocromo.
 Información generada por el citómetro

Esta información estadística se visualiza principalmente mediante dos tipos de

gráficos: Citogramas e Histogramas. Como se muestra en la Figura 6A, en un citograma
se representa la totalidad de las células recontadas analizando su tamaño en el eje de
abcisas (Foward scatter) y su granularidad o complejidad citoplasmática en el eje de
ordenadas (Side scatter). Cada célula individual corresponde a cada uno de los puntos
representados en el gráfico.
El software nos dejará seleccionar los puntos deseados para analizarlos
inclusivamente. Como se muestra en imagen, se pueden distiguir diferentes grupos
homogéneos según la relación tamaño y glanuralidad. Generalmente, en una muestra
sanguínea se distuinguen los linfocitos (con un tamaño medio y una granularidad muy
baja), los monocitos (con un tamaño medio y una granularidad baja) y los granulocitos
(con un tamaño superior a los anteriores y una granularidad alta). Si seleccionamos de
forma homogénea cada una de las poblaciones, el programa nos distingue el número de
células sobre el total que corresponden a dicha población.

Por otro lado, el análisis de la fluorescencia normalmente se analizaría en forma de

histograma, tal y como se muestra en la Figura 6B, aunque en forma de histograma
también se pueden representar otros parámetros, al igual que en el caso del citograma
(como dos tipos de fluorescencia comparadas). Se representaría el número total de
células recontadas (o seleccionadas en el citograma) en el eje de ordenadas y la señal de
fluorescencia indicada en el eje de abcisas. Por ejemplo, si hemos marcado con un
anticuerpo policlonal anti-CD3 (que es la molécula diferencial “Cluster Diferentiation” de la
línea celular linfocitaria) conjugado con el fluorocromo FITC (Isocinato de Fluoresceína),
cuya emisión máxima se da en el espectro del verde, todas las células recontadas que se
detecten con una expresión relativamente alta de fluorescencia verde, se podrían
considerar linfocitos (aportando el gráfico datos sobre el porcentaje de células que lo
expresarían). Si además, hemos marcado con con un anticuerpo policlonal anti-CD4 (que
es la molécula diferencial “Cluster Diferentiation” de la línea celular linfocitaria T helper)
conjugado con el fluorocromo PE (Phycoeritrina), cuya emisión máxima se da en el
espectro del naranja, todas las células recontadas que se detecten con una expresión
relativamente alta de fluorescencia naranja, se podrían considerar linfocitos T4 (dentro de
la población con expresión de CD3).
 Figura 6. A) Poblaciones celulares discriminadas en representación FSC vs SSC; B)
Histograma de población marcada positiva CD3

Bibliografía

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Modern flow cytometry: a prac- tical approach. Clin. Lab. Med., 27: 423-467.
Práctica 1

Medida de la densidad celular y distribución de tamaños mediante citometría de

flujo (Laboratorio)

Entre los principales objetivos que mantiene esta práctica de laboratorio de la se

encuentran los siguientes:

-Comprender el funcionamiento básico de un citómetro de flujo, conociendo para

ello sus principales elementos y el papel que representan dentro de dicho aparato
analítico

-Interiorizar el método analítico en el que se basa la citometría de flujo, así como los
factores analizados en el momento de recontar y clasificar las células introducidas
en el aparato analítico

-Desarrollar los principales pasos a seguir dentro del protocolo para analizar por
citometría de flujo poblaciones celulares aisladas de microalgas, así como manejar
de forma correcta el instrumento analítico empleado para ello.

-Interpretar de manera adecuada los datos proporcionados tras la lectura del

citómetro de flujo de las muestras introducidas en el mismo.

Reconocimiento del equipo: El primer paso es reconocer las diferentes partes del
equipo y comprobar que los niveles de líquido de lavado y de deshecho están entre los
márgenes admisibles.

Conteo de poblaciones por microscopio y preparación de muestras.: Se realizará un conteo

previo de las poblaciones de microalgas. Los citómetros de flujo presentarán
desviaciones en sus medidas ante concentraciones demasiado altas o bajas. Éstas
últimas por la perdida de significancia estadística. Un valor de referencia típico es de
muestras con 1 millón de células para realizar medidas que incluyan en torno a los 10000
eventos. En nuestro caso, al emplear células flageladas se procederá antes al fijado
utilizando una solución de Lugol. El contaje se realizará en cámara de Nebauer por
duplicado.
 Medida de densidad celular en citómetro de diferentes poblaciones: Para esta primera
práctica emplearemos el protocolo “Count & Viability”, aunque no emplearemos reactivos.
Se medirán poblaciones uniformes por separado y también mezcladas en proporción 1:1.
Exportar datos en formatos CSV y FCS: Los datos obtenidos en los diferentes ensayos
serán exportados en formatos CSV y FCS para, posteriormente, ser analizados
empleando un software específico.
Protocolos de limpieza del citómetro: Después de las medidas es necesario realizar un
protocolo de limpieza. Existen protocolos diarios, otros que deben realizarse después de
un número determinado de muestras y, por último, protocolos cuando se produce algún
fallo en el equipo derivado de obstrucciones en los sistemas de flujo.

Práctica 2

Cuantificación de la viabilidad celular mediante citometría de Flujo (Laboratorio).

Entre los principales objetivos que mantiene esta práctica de laboratorio de la se

encuentran los siguientes:

-Comprender el uso de fluorocromos en citómetría de flujo, conociendo para

ello sus principales elementos y el papel que representan.

-Emplear un método analítico de citometría de flujo, para determinar la viabilidad

de células de microalgas.

-Interpretar de manera adecuada los datos proporcionados tras la lectura del

citómetro de flujo de las muestras introducidas en el mismo.

El el protocolo de teñido se recogen todos los detalles del procedimiento para

realizar las medidas (Ver ANEXO 1). Se emplearán microalgas en condiciones normales
(alta viabilidad) y otras tratadas son sulfato de cobre para tener un control positivo (baja
viabilidad). Mediante el software del equipo se realizarán los ajustes de los parámetros
necesarios para tener un valor de viabilidad y de concentración celular de las diferentes
muestras. Al igual que en la practica anterior se exportarán los datos y se iniciará el
protocolo de limpieza.
Práctica 3

Herramientas informáticas para tratamiento de los datos (Aula de informática).

Entre los principales objetivos que mantiene esta práctica de laboratorio de la se

encuentran los siguientes:

-Comprender el uso de softwares de citómetría de flujo, los formatos usuales y los

análisis disponibles.

-Emplear un software específico para el análisis de los datos obtenidos en sesiones

anteriores.

-Comprender la importancia del análisis estadístico en citometría, interpretar de

manera adecuada los datos y discutir los resultados.

Existen multitud de software dedicados para el tratamiento de datos de citometría

de flujo. La inmensa mayoría requieren de una licencia de pago y son provistos
normalmente con el citómetro que se adquiere. El formato usual de los datos es FCS y
puede por tanto ser leído en cualquier programa independientemente del equipo donde
se analizó la muestra. Existen, además, algunos software que no se emplean en la
adquisición sino en el tratamiento posterior. Entre ellos, uno de los más empleados es
FlowJo (https://www.flowjo.com/) o Modfit (https://www.vhs.com/).

El análisis de los datos obtenidos por citometría requiere manejar parámetros

estadísticos y una buena parte de subjetividad e interpretación. Por lo tanto, se
comprobará que los resultados para una misma población difieren entre los grupos de
trabajo. En citometría de flujo es usual por este motivo, contar con un alto número de
replicas. Nótese que cada muestra es ya la representación estadística de una población.
El equipo Muse permite la exportación de datos. Para esta práctica también usaremos
archivos de datos expresados desde otros citómetros (BC XL y BC Quanta). El software
que emplearemos será el FACSanalyzer 0.9.16.
ANEXO 1. Protocolos de marcaje

Medida de la viabilidad celular

Para cuantificar el porcentaje de celulas viables y no viables se prepara una solución

stock disolviendo 10mg de diaconato de fluoresceína en 100mL de acetona (0,1mg/mL).
La solución de trabajo se obtiene disolviendo 200 µL del stock primario en 1,8mL de
acetona. 5 µL de la solución de trabajo de diacetato de fluoresceina (0,01 mg·mL -1) se
añaden a un a muestra de 0,5 mL de suspensión celular (tiempo de incubación 5 min). La
muestra debe estar protegida de la luz directa. La concentración final es de 0,1 µg/mL. La
membrana celular es permeable a esta molécula. Una vez dentro de la célula los grupos
acetato son sustituidos por las esterasas celulares y se produce fluorescencia en el rango
de longitudes de onda: 505-545nm (Canal FL1). Las células no viables no tienen actividad
esterasa y por tanto no emiten fluorescencia. Al no producirse fluorescencia hasta que no
actúan las esteradas no es necesario lavar el exceso de reactivo de tinción.

La viabilidad se expresa como el cociente entre el número de células que emiten

fluorescencia en 505-545nm y el número total de células.

Esta tinción también puede observarse bien mediante microscopio de fluorescencia

aunque debe emplearse 10 veces más cantidad de fluorocromo.

Para observar una mayor proporción de células no viables puede emplearse algún agente
tóxico. En nuestro caso, los análisis se realizan sobre microalgas por lo que un conocido
algicida (sulfato de cobre, 0,01g/L. 1 µL sobre 0,5mL de muestra) permite observar
cambios en pocos minutos.

Medida de lípidos neutros

Se emplea rojo de nilo 10 µg/mL en acetona (tiempo de incubación 5 min). A 500 µL de

muestra se adicionaron 2 µL de solución. La emisión se recoge en valores de longitud de
onda mayor de 528. Típicamente en canales FL2. Al no producirse fluorescencia del rojo
de nilo en medios acuosos no es necesario lavar el exceso de reactivo de tinción. La
muestra requeriría un lavado previo y resuspensión en PBS (u otro buffer) si contuviese
suero o albúmina. Se empleará un cultivo de microalgas cuyo medio es
fundamentalmente inorgánico. El rojo de nilo emitirá fluorescencia cuando se una a los
lípidos de la membrana y a las reservas lipídicas intracelulares. Por tanto, El valor de
intensidad de fluorescencia puede correlacionarse con la cantidad de lípidos neutros.

Esta tinción también puede observarse bien mediante microscopio de fluorescencia. Para
microscopio se debe emplear 20 veces más cantidad de fluorocromo.
 Figura 7. Uso de Nile Red en células del músculo liso arterial. a) y b) Fotografías de las
células marcadas excitando a longitud de onda en rangos de 450-500 y 515-560,
respectivamente. Greenspan et al. Nile Red: Fluorescent Stain for Intracellular Lipid
Droplets. The Journal of Cell Biology, 1985, 100, 965-973.

Medida de ciclo celular

Las células microalgaes fueron fijadas en etanol (70%) a -20ºC. Esto permite
permeabilidad la célula y permitir la entrada de fluorocromos. Tras 2 minutos de suave
agitación se centrifugan suavemente y se resuspenden en PBS (PBS: 0.15 M NaCl, 0.01
M Na2HPO4, 0.01 M KH2PO4, pH 7.4). Este paso se realiza dos veces. Después del
lavado se adicionó RNasa-H (10 μg mL−1; Sigma-Aldrich) y se incubó la muestra 30
minutos a 37 ºC. Tras la incubación se realiza otro lavado con PBS. Para el análisis en el
citómetro el ADN se marcó con yoduro de propidio (IP; 0,1mg/mL; 10 minutos de
incubación en oscuridad a Tª ambiente). La fluorescencia del IP se recoge en el canal
FL4. Este es de los llamados agentes intercalantes y se une alas bases con poca o
ninguna preferencia de secuencia. El IP tiene un máximo de excitación fluorescente de
493 nm (azul-verde) y un máximo de emisión de 636 nm (rojo). Después de unirse al
ADN, el rendimiento cuántico de PI aumenta 20-30 veces por lo que no es necesario lavar
la muestra de exceso de IP. La fluorescencia en FL4 de cada evento (célula individual)
será función de la cantidad de ADN.