Practicas Del Laboratorio de Inmunologia II

Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud
Dr. Francisco Virgilio Battistini Casalta
Departamento de Bioanálisis
Catedra – Inmunología II
Laboratorio
Profesora: Bachilleres:
Lic. Alizar Abou Fakhr Estudiantes del 7mo Semestre
Ciudad Bolívar, Abril del 2021
El presente trabajo pretende proporcionar al estudiante de la carrera de Bioanálisis

la información esencial para comprender, ejecutar e interpretar un conjunto de técnicas
inmunológicas de aplicación clínica, como parte de su formación en el curso del
Laboratorio Inmunología II. Se asume que el estudiante posee de antemano una forma-
ción básica en Inmunología I, tanto teórica como de laboratorio. Los capítulos presentan
una breve introducción que resume los fundamentos teóricos de cada técnica, seguida
de una descripción general de los procedimientos, algunas notas sobre los principales
cuidados e interpretación y una bibliografía sucinta. Los reactivos utilizados y su pre-
paración. Esperamos que este modesto trabajo didáctico sea de utilidad a los estudiantes
en su formación, así como en su futuro ejercicio profesional.
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Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Lunes A

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INTRODUCCIÓN
Uno principales mecanismos que se pone en marcha cuando se activa la respuesta
inmunológica es el sistema de complemento, que está conformado por un conjunto o red de
proteínas cuya función directa es el reconocimiento y destrucción de los patógenos cuando
estos invaden nuestro organismo. En condiciones normales las moléculas que forman parte
del sistema de complemento se encuentran inactivas circulando libremente en el torrente
sanguíneo y cuando se activan, al reconocer un microorganismo, migran hacia el tejido
infectado y favorecen la inflamación y la eliminación del patógeno.
En un organismo vivo sus componentes individuales tienen divididas las funciones entre
ellos, y a la vez interaccionan entre si de una forma compleja, pero precisa. Sin embargo,
este conjunto de interacciones delicadas puede ser fácilmente alterados por agentes que
amenazan su integridad como la existencia de parásitos, los daños a órganos y tejidos
(heridas) o la aparición de procesos tumorales. Para defenderse, los organismos han
desarrollados una gran variedad de mecanismos que están formados por una serie de
proteínas coordinadas en sus funciones. Estos sistemas se activan gradualmente, en cascada
y sus diversos integrantes interaccionan entre sí, conformando las tres vías de activación del
sistema de complemento: la vía clásica, la alterna y la de las lectinas.
El análisis del complemento es de gran importancia ya que mide la cantidad o la actividad

de las proteínas del complemento en la sangre. Las pruebas más comunes son las de las
proteínas C3 y C4 y la prueba de CH50 que mide la cantidad y la actividad de todas las
proteínas principales del complemento. Si la prueba muestra que los niveles de proteína del
complemento no son normales o que no están funcionando como deberían con el sistema
inmunitario, puede ser signo de una enfermedad autoinmunitario u otra condición que puede
poner en riesgo la salud del paciente.
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CUESTIONARIO DIAGNÓSTICO
1. ¿Qué es el sistema del Complemento?
El sistema del complemento hace parte de una de las

primeras líneas de defensa contra infecciones y está
constituido por una serie de proteínas solubles receptoras de
membrana, para esas proteínas una vez que son activadas, y
moléculas reguladoras que frenan su activación cuando han
cumplido su función que es la de reforzar la respuesta inmune
innata y adquirida. La mayoría de las proteínas o factores
solubles son de tipo enzimático y son transportados por la
sangre, pueden ser superficiales o de membrana que tienen la
capacidad de unirse al microorganismo y activar una vía del sistema de complemento.
El sistema del complemento forma parte del sistema inmunitario innato del organismo. A
diferencia del sistema inmune adquirido (que produce anticuerpos frente a sustancias
específicas), el sistema inmune innato es inespecífico y tiene la capacidad de responder
rápidamente a sustancias desconocidas para el organismo, como pueden ser bacterias, tejidos
no propios (como trasplantes), restos de células muertas o inflamación. Por lo tanto, no
requiere una exposición previa al microorganismo o sustancia y no guarda memoria de
exposiciones previas.
Como parte del sistema inmune innato, el sistema del complemento se ha desarrollado para
reconocer complejos antígeno-anticuerpo (inmunocomplejos) así como también ciertas
estructuras y polisacáridos (complejos de carbohidratos) que se encuentran en las
membranas externas de los microorganismos y en otras células extrañas.
Componentes: Las distintas proteínas que integran el sistema, son unas 37, se conocen como
factores y representan el 10% de las proteínas presentes en el plasma, lo cual indica su
importancia. 20 de ellas pertenecen al circuito de activación, 9 al sistema de control y 8
sirven de receptoras a las moléculas originadas durante el proceso de activación en la primera
fase. La cascada de activación se desarrolla en tres fases: Reconocimiento, activación y ata-
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que a la membrana.
Factores para vía clásica: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4

Factores para la vía alterna: C3b, Factores B, D y properdin
Factores para la vía de las lectinas: Lectina Ligadora de Manosa (MBL), ficolinas y las
proteasas de serina, MASP1 Y MASP2
2. ¿Cuáles son las funciones del sistema del complemento?
El sistema de complemento actúa en tres aspectos biológicos, en primer lugar, participa en

la defensa del hospedero contra microorganismos patógenos, función que se ejerce por los
siguientes mecanismos:
-Opsonización
-Liberación de péptidos quimiotacticos que atraen PMN
-Activación de la fagocitosis
-Amplificación de la inflamación
-Lisis de células o bacterias por daño a la membrana
Un segundo mecanismo es el de servir de puente entre la inmunidad innata y la adquirida.
El tercer mecanismo consiste en favorecer el transporte e inactivación de complejos inmunes
y la eliminación de cuerpos apoptóticos.
3. ¿Cómo se activan la vía alterna y clásica del sistema del complemento?

Vías de activación:
El complemento es un sistema cuyos componentes se activan secuencialmente en forma de
cascada. El proceso comienza con una etapa en la que las señales de peligro son identificadas
por receptores para el reconocimiento de patrones moleculares (PRR). Los PRR implicados
en este sistema incluyen Ac específicos, MBL, ficolinas, proteínas C reactiva y anticuerpos
naturales IgM que pueden activar las diferentes vías.
❖ Vía clásica: Inicia con una fase de reconocimiento, se inicia por medio de una
molécula de IgM que se haya unido a un Ag en la superficie de un microorganismo o de una
célula que deba ser destruida. Cuando un Ac reconoce un Ag en la membrana de un
microrganismo, la molécula C1q se une al complejo Ag-Ac y permite la unión y activación
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de los factores C1r y C1s, con lo cual se produce la activación completa del factor C1 que
inducirá la activación del C4.
• Se inicia: Por fase de reconocimiento, por medio de una molécula de IgM que
se haya unido a un Ag en la superficie de un microorganismo.
• Proteínas que participan: Complejo C1, C2, C3, C4, C5.
• Proteínas que activan: C1q, C1r, C1s
• Conversatas: C3 (convertasa) C4bC2a y C5 (convertasa) C4bC2aC3b, CAM
- La C3 convertasa de la vía clásica convierte catalíticamente por hidrolisis
muchas moléculas de C3 a C3a (difusibles) y C3b, que se anclando a la
membrana del microorganismo. De esta manera actúa como un núcleo
“focalizador” para que continúe la activación del complemento.
- La C5 convertasa de la vía clásica cataliza la rotura de unidades de C5
EN C5a (libre) y C5b, que se une a la membrana microbiana.
❖ Vía alterna o Properdin

Es la más antigua. La fase de activación de esta vía depende de dos mecanismos:
a. Pequeñas cantidades de C3b, se anclan en la membrana y son reconocidas por el factor

B que en presencia del factor D se fragmenta en Bb y Ba. El complejo C3bBb es
estabilizado por el properdin y constituya la convertasa de C3 de la vía alterna
b. El properdin puede actuar también, la vía alterna al reconocer sus ligandos en la

membrana de bacterias, hongos y células necróticas
• Se inicia: por C3b

• Proteínas/componentes que participan: C3, Factor B, factor D, properdin
• La activa: Por presencia de microorganismo
• Proteína que activan: C3b
• Convertasas: C3 (Convertasas) C3bBb, C5 (Convertasa) C3bBbp3b.
- La C3 convertasa de la vía alterna rompe numerosas moléculas de C3,
cuyos respectivos grandes de C3b tienden a unirse cerca de la misma
convertasa unida a la membrana.
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- La C5 convertasa de la vía clásica cataliza la rotura de unidades de C5

EN C5a (libre) y C5b, que se une a la membrana microbiana.
4. ¿Cuándo son necesarias las pruebas del sistema del complemento?
Puede solicitarse cuando existe una inflamación o edema sin causa aparente o síntomas de
enfermedad autoinmune como el lupus eritemasoso sistémico y cuando existe sospecha de
trastorno relacionado con inmunocomplejos y el médico quiere comprobar el estado del
complemento.
Los componentes que más suelen solicitarse son el C3 y el C4, pero otros, como el C1-
inhibidor, también pueden solicitarse cuando se sospecha un déficit. Los componentes del
complemento por separado suelen solicitarse cuando la actividad total del complemento
(CH50 o CH100) está alterada para determinar cuál es el componente deficitario o anómalo.
Una vez diagnosticado un trastorno crónico o agudo, la determinación del complemento
puede utilizarse para dar una idea de la severidad del trastorno (asumiendo que dicha
severidad se debe a un descenso de los componentes del complemento). También puede
solicitarse ocasionalmente cuando el médico quiere controlar la actividad del trastorno en un
momento concreto de su evolución.
5. ¿Cuáles son las pruebas para la determinación de la vía clásica y alterna?
Las proteínas del complemento se pueden medir individualmente o juntas, siendo las pruebas
más comunes las que determinan a las proteínas C3 y C4, como también, la prueba de CH50
que mide la cantidad y la actividad de todas las proteínas principales del complemento.
Para evaluar el sistema de complemento se utiliza pruebas tanto cuantitativas como

cualitativas y la utilidad de su determinación está en la inmunología clínica, ya que permite
detectar deficiencia en factores de complemento además de anomalías funcionales en las
vías de activación y regulación.
Las pruebas cuantitativas analizan las concentraciones de componentes infecciosos del
complemento e incluyen ensayos inmunogénicos, mientras que las pruebas cualitativas
miden la actividad total del complemento (lisis en las distintas vías de activación). Las
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pruebas que producen hemolisis dan una perspectiva de la función de la cascada enzimática
siendo una de ellas la de capacidad hemolítica de (CH50). Otro método que se usa son los
que utilizan los ensayos de inmunoabsorbancia asociados a enzimas (ELISA) Para detectar
el depósito de C1q, C1s, C4, C3, factor B.
❖ Técnica KENT Y FIFE (CH50): Ensayo CH50: La reacción se inicia con la

interacción antígeno (glóbulos rojos del carnero) con el anticuerpo (hemolisina) al agregar
el suero del paciente cuyos niveles del complemento se desean investigar, se inicia así la
activación de la cascada, activando la vía alterna del sistema del complemento, se obtiene
así destrucción de glóbulos rojos. La hemolisis se calcula mediante lectura
espectrofotométrica, los resultados representan la cantidad del complemento requerido para
lograr la hemolisis al 50% de los glóbulos rojos
❖ Prueba de C4 del complemento: Mide la cantidad de proteínas C4 que hay en la

sangre. Las enfermedades que implican niveles anormales de c4 es lupus eritematoso, un
trastorno auto inmunitario. A menudo los niveles del complemento aumentan de manera
drástica después de una infección o herida. Cuando el sistema de complemento se activa, los
niveles disminuyen.
6. ¿Qué condiciones pueden producir alteraciones en las proteínas del sistema de

complemento?
❖ DISMINUCIÓN
Los componentes del complemento pueden encontrarse disminuidos por déficits hereditarios
(relativamente raros) o debido a un exceso de consumo. Los déficits hereditarios en una o
más proteínas del complemento suelen conllevar una alta frecuencia de infecciones
bacterianas recurrentes o enfermedades autoinmunes. Los niveles de C3 y C4 generalmente
están disminuidos en el lupus, mientras que C3 sólo es bajo en septicemia e infecciones
causadas por hongos o parásitos como la malaria.
Si el déficit se debe a un trastorno subyacente agudo o crónico, los niveles del complemento
volverán a la normalidad una vez resuelto dicho trastorno.
Pueden observarse descensos en los componentes del complemento en:

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• Infecciones microbianas recurrentes (generalmente bacterianas)

- Deficiencia de C5, C9, factor B, el factor D, o properdina: susceptibilidad a las
infecciones por Neisseria
- Deficiencia en C1, C2, C3, MBL, serina proteasa asociada a MBL (MASP-2),
factor H, factor I, o el receptor 2 del complemento (CR2): provoca susceptibilidad a
infecciones bacterianas recurrentes
• Enfermedades autoinmunes, como LES o artritis reumatoide.
- Defectos en C1, C4 y C5: lupus eritematoso sistémico
• Angioedema hereditario o adquirido
• Diversas enfermedades renales, entre ellas: glomerulonefritis, nefritis lúpica, nefritis
membranosa, nefropatía por IgA, así como el rechazo del trasplante de riñón.
• Cirrosis
• Hepatitis
• Malnutrición
• Septicemia, shock
• Enfermedad del suero (enfermedad por inmunocomplejos)
❖ AUMENTO
Las proteínas del complemento suelen encontrarse elevadas juntamente con otras proteínas
conocidas como proteínas de fase aguda, durante una inflamación crónica o aguda. Todas
estas proteínas volverán a niveles normales una vez se haya resuelto el trastorno subyacente.
Sin embargo, no es habitual medir las proteínas del complemento en estas circunstancias, en
comparación con la prueba más ampliamente solicitada que es la proteína C reactiva (PCR).
También se puede observar una mayor actividad del complemento en los

siguientes casos:
• Cáncer (leucemia, linfoma de Hodgkin, sarcoma)
• Colitis ulcerosa
• Tiroiditis
• Infarto agudo del miocardio
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• Sarcoidosis
• Artritis reumatoide juvenil
❖ MUTACIONES
Las mutaciones en los genes para el factor B, factor H, factor I, la proteína cofactor de
membrana (CD46), o C3: desarrollo de la variedad atípica del síndrome urémico hemolítico
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TECNICAS DE LABORATORIO
INMUNODIFUSIÓN RADIAL
❖ FUNDAMENTO
Esta técnica es de tipo inmunoprecipitación y
consiste en hacer reaccionar un antígeno con su anticuerpo
correspondiente en un medio semisólido. Este medio
puede ser de gel de agar o agarosa, en placa de cristal o
plástico, cuyo espesor sea uniforme y el anticuerpo esté
distribuido en él.
El resultado final será la formación de un anillo de precipitación. Estos geles suelen
estar coloreados para que la lectura se realice con mayor facilidad. En los geles se hacen
unos pocillos de dimensiones determinadas y dentro de ellos se dispensa la muestra donde
queremos cuantificar el antígeno.
❖ MATERIALES Y MUESTRA
• Agarosa
• Antiglobulina humana (antígeno)
• Beaker
• Placas de petri
• Estufa de incubación (37ºC).
• Lámina porta objetos de vidrio
• Muestras de suero (anticuerpos)
• Pipetas automáticas de 20 uL
• Puntas amarillas para pipeta automática
• Pipeta Pasteur
❖ PROCEDIMIENTO
1. El antígeno en suspensión se mezcla con el Agar en estado líquido.
2. Luego se vierte en una placa de petri.
3. Una vez solidificado con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) en la placa, que
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contendrán la muestra de suero.
4. Se incuba (37°C) de modo que el suero con anticuerpo se difunde por la placa de Agar y
reacciona con el antígeno contenido en la placa.
5. Al cabo de 24h se ha creado un precipitado fruto de la

reacción Ag- Ac que se muestra en la placa como línea
blanca rodeando el pocillo (en ocasiones se pueden aplicar
tintes para facilitar su visionado) siendo su diámetro un
reflejo de la concentración de Ac. Que teníamos en la
muestra.
❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Los anillos de precipitina serán visibles en 24 a 48 horas. El diámetro de este círculo
es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero, de
modo que, a mayor diámetro, mayor concentración de anticuerpo.
Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta

estándar o patrón previamente creado donde se grafica el diámetro vs. Log de la
concentración de Ag. Esta recta se hace a partir de muestras de anticuerpos conocidas en
cada pocillo, que reaccionan con el antígeno; en el eje Y el área del círculo y en el eje X la
concentración de anticuerpos conocida.
Al final se comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores
de la recta patrón, obteniendo así el valor de la concentración de anticuerpos para cada
muestra de suero del individuo. Del mismo modo, se puede calcular mediante
una metodología análoga la cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta
vez en agar anticuerpo y creando la recta patrón sobre la base de concentraciones conocidas
de antígeno, también se une a IgM.
EJEMPLO: Interpretar las láminas de difusión en agarosa, determinando en que pozos hay
reacción Ag-Ac.
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GRÁFICA: En un papel cuadriculado regular, se debe obtener una curva lineal estándar. Si
la curva no es lineal, la concentración desconocida no se puede determinar con precisión.
ENSAYO INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

El ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican
una enzima como marcador para mediar la formación
de complejos antígeno-anticuerpo, es un tipo de EIA.
Permite detectar pequeñas partículas llamadas
antígenos, que habitualmente son fragmentos de
proteínas. La identificación es específica, es decir,
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consigue que pequeños segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con
otras.
Representa una aplicación popular del inmunoensayo sándwich heterogéneo de fase

sólida que combina un reactivo marcado enzima-anticuerpo con un anticuerpo unido a una
fase sólida. Inicialmente, se utilizaban como material de base sólida tanto las placas de
microtítulo como las esferas de 1/4 de pulgada. Una placa de microtítulo es simplemente una
placa plástica cuadrada con pocillos de poca profundidad recubiertos con un analito.
❖ FUNDAMENTO
La detección se realiza colorimétricamente por la interacción de un sustrato
cromogénico y una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector La prueba de
ELISA se basa en la formación de inmunocomplejos, (reacción antígenoanticuerpo, uno de
los cuales debe ser de reactividad conocida), para detectar la presencia de un análito de
interés. Consiste en fijar Ag o Ac a un soporte sólido, poniendo en contacto una fase fluida
que contiene el reactivo complementario formando un complejo.
❖ KIT DE ELISA
El contenido del kit puede varias ligeramente. Por favor refiérase a las inserciones
específicas del producto para obtener una lista completa de contenidos para los ensayos
individuales.
• Anticuerpo de captura
• Anticuerpo de detección biotinilado
• Estándar masa calibrada
• Estreptavidina – HRP
• Protocolo detallado
❖ PASOS GENERALES PARA LA TÉCNICA DE ELISA

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en
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el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido.
5. Adición del anticuerpo secundario

marcado con la enzima.
6. Unión del anticuerpo secundario al

antígeno o anticuerpo.
7. Lavado del pocillo para eliminar el

exceso de enzima no unida.
8. Adición del substrato.

9. Unión del substrato a la enzima.
10. Desarrollo del color.
❖ EQUIPOS
El analizados de Elisa es un
espectrofotómetro especializado a través del
cual se realiza la lectura de los resultados
obtenidos, luego de la aplicación de la
técnica empleada para la determinación de
la presencia de antígenos o anticuerpos
específicos en una muestra analizada.
Existen varios materiales que son utilizados en los equipos analizadores de Elisa, uno
de ellos son las cubetas de espectrofotometría, las cuales son elaboradas con dos tipos de
materiales, el cuarzo y el plástico. Cuando se va a trabajar bajo luz ultravioleta, se utilizan
las cubetas elaboradas con cuarzo y cuando el trabajo se realiza con la luz visible, las ideales
son las fabricadas de plástico.
El analizador de Elisa está provisto de rejillas o filtros de difracción, los cuales

limitan el rango de la longitud de onda a las utilizadas por esta prueba y están comprendidas
entre 400 y 750nm. Con el uso del analizador de Elisa, es posible obtener información de
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una muestra y conocer la naturaleza de la sustancia que contiene. Con ella, también es
posible determinar la cantidad de sustancia a examinar, y allí su aplicación en la serología y
la inmunología.
❖ UTILIDAD
Detección de Antígeno-Anticuerpo:
• Bacterias
• Parásitos
• Hongos
• Virus
Detección de complejos autoinmunes:
• Anti-DNA (Antígenos nucleares extractables: Sm – Ro – La – Rnp)
• Anti-Histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4)
Detección de Antígenos asociados a tumores:
• Ag prostático
• Ag ovario (Ca125)
• ACE, alfafetoproteína
❖ ANÁLISIS DE RESULTADOS
¿Qué hacer antes de ejecutar a un ELISA?
Una prueba de ELISA se debe realizar
siempre en réplicas (los duplicados o los
triplicados) para lograr suficiente número de
muestras para calcular la desviación estándar y el
coeficiente de variación. El coeficiente del desvío
se debe mantener menos el de 20%. Si el desvío
calculado es alto, después el surgimiento de los
desvíos debido a medir con una pipeta, la
contaminación de placas y de reactivos, la evaporación, y/o la temperatura tienen que ser
evaluados.
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Curva estándar
Una curva estándar se utiliza para medir la concentración de la muestra. Primero, los
valores de la absorción de las concentraciones estándar (pg/ml) se trazan. Una curva negativa
también se hace que no contiene ningunos datos de la muestra estándar y se utiliza para
descubrir y para medir ruido de fondo. Para una medición exacta, este valor de base se debe
restar de la curva estándar.
Los valores de la absorción de la concentración sabida se pueden trazar como mando

positivo. La concentración de la proteína del objetivo es derivada primero calculando la
absorción media y entonces usando la curva estándar para estimar la concentración.
Los factores de la dilución deben también ser tenidos en cuenta. Por ejemplo, si la
muestra se ha diluido cuatro veces, después la absorción debe ser multiplicado por cuatro
antes de usar la curva estándar para derivar la concentración.
Coeficiente de variación
La definición del coeficiente de variación es el índice de la desviación estándar y del
medio - es decir desviación estándar (σ) /mean (µ). Los valores grandes del coeficiente de
variación indican las inexactitudes debido a medir con una pipeta o a la mezcla de reactivos
entre los pozos, contaminación bacteriana o fungicida, desecación de pozos, o las variaciones
de la temperatura.
Recuperación del pico

El valor obtenido después de funcionar con la prueba de ELISA depende de cómo
una proteína apuntada obra recíprocamente con los anticuerpos, y esta acción recíproca se
compara a una curva
estándar de la proteína. Varios factores - incluyendo almacenador intermedio, matriz y los
anticuerpos heterophilic - pueden afectar al atascamiento de la muestra, así que a éste deben
ser tenidos en cuenta al determinar la exactitud de un ELISA.
Un análisis del pico se puede realizar para determinar la exactitud de los resultados
de ELISA. En este análisis, una cantidad sabida de proteína recombinante se agrega o se
clava hacia adentro a la muestra. Entonces, usando la curva estándar la cantidad de material
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se mide. Las desviaciones grandes en los valores medidos pueden indicar los desvíos debido
a los elementos desconocidos en el análisis.
Análisis de las linearidades

Las linearidades ensayan también se utilizan para determinar la exactitud de ELISA.
En este caso, la muestra clavada `' se diluye en serie al 1:2, al 1:4 y a 1: 8. Si la concentración
de la muestra alterada se descubre, y si los resultados no visualizan un cambio lineal en las
mediciones, puede indicar desvíos en la exactitud de ELISA.
En algunos casos, los desvíos se pueden observar en ciertas concentraciones y
observar no más en concentraciones más inferiores. En tales casos, la muestra puede tener
que ser diluido antes de que se realicen las mediciones de la concentración.
Localización de averías
• El ruido de fondo se puede causar por varios factores, incluyendo:
• Lavado escaso de los pozos
• Almacenadores intermedios contaminados de la estela turbulenta
• Demasiado reactivo de la detección
• Reactividad cruzada del anticuerpo
• Precipitación del almacenador intermedio y/o del analito
A veces, la curva estándar pobre puede ser generada. Esto puede ser debido a los
desvíos en la solución estándar, degradación del patrón, el patrón se reconstituye
incorrectamente, o si la curva no ajusta la escala. En vista de que este último, trazando se
pueden hacer usando diversas escalas, tales como curva logística con abscisas y ordenadas
logarítmicas o de 5 parámetros.
TURBIDIMETRÍA
Método inmunoturbidimétrico para la determinación del componente C3 del
complemento
❖ FUNDAMENTO
La proteína C3 del complemento reacciona con el anticuerpo específico anti-C3
formando inmunocomplejos insolubles. La turbidez provocada por estos inmunocomplejos
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es proporcional a la concentración de C3 en la muestra y puede medirse

espectrofotométricamente.
❖ MUESTRA
Suero o plasma heparinizado
a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda no emplear

niveles en exceso de heparina como anticoagulante.
c) Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolizados o contaminados. No

se observan interferencias por bilirrubina hasta 20 mg/dl, triglicéridos hasta 25 g/l, ni
hemoglobina hasta 10 g/dl.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: se recomienda usar suero

preferentemente fresco. Si el ensayo no puede ser realizado en el mismo día, la muestra
puede ser conservada 48 horas en refrigerador (2-10o C). En caso que se deba procesar en
un período más largo de tiempo, debe conservarse inmediatamente a -20o C.
❖ MATERIALES
Reactivo A: solución fisiológica tamponada, pH 7,35 ± 0,10.
Reactivo B: anticuerpo monoespecífico anti-C3.
- Solución fisiológica.
- Calibrador Proteínas nivel alto Turbitest AA
(en este caso)
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- Espectrofotómetro.
- Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Micropipetas y pipetas
- Tubos de Kahn o hemólisis.
- Reloj
❖ CONDICIONES DE REACCIÓN
- Longitud de onda: 340 nm
- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (25o C). El control de la temperatura
no es crítico, pudiendo oscilar entre 22 y 30o C.
- Tiempo de reacción: 30 minutos
❖ PROCEDIMIENTO
Para realizar la Curva de Calibración
Realizar en tubos de Kahn, las siguientes diluciones en solución fisiológica, del
Calibrador Proteínas nivel alto:
- 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160, empleando solución fisiológica como punto cero.
Calibrador Proteínas diluido 70 ul

Reactivo A 900 ul
- Homogeneizar y leer la absorbancia de cada dilución a 340 nm (DO1 ) llevando el
aparato a cero con agua destilada. Luego agregar:
Reactivo B 120 ul
- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia a 340 nm (DO2 ), llevando el aparato a cero con agua destilada.
Calcular la diferencia (∆A = DO2 - DO1) para cada dilución del Calibrador
Proteínas, incluyendo el punto cero. Representar en papel milimetrado las diferencias de
absorbancia (∆A = DO2 - DO1) en función de la concentración en mg/dl (g/l) del Calibrador
Proteínas.
Para la muestra:
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- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica.

Muestra diluida 70 ul
Reactivo A 900 ul
- Homogeneizar y leer la absorbancia a 340 nm (DO1) llevando el aparato a cero con agua
destilada. Luego agregar:
Reactivo B 120 ul
- Mezclar e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
- Leer la absorbancia a 340 nm (DO2), llevando el aparato a cero con agua destilada.
❖ CÁLCULOS
Calcular la diferencia de absorbancia (∆A = DO2 - DO1) correspondiente a cada
muestra analizada. Interpolar esta diferencia (∆A) en la curva de calibración para determinar
la concentración en mg/dl correspondiente a la muestra estudiada.
Las muestras con absorbancias superiores a la del Calibrador Proteínas nivel alto,
deben ser diluidas 1:2 con solución fisiológica y procesadas nuevamente. Multiplicar el
resultado obtenido por dos.
Valores de Referencia
90 - 180 mg/dl (0,9 - 1,8 g/l).
Cada laboratorio debe establecer sus propios valores de referencia.
❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

El C3 es una β-2-proteína que constituye el componente central de la vía clásica y de
la alternativa del complemento. Se comporta además como una proteína de fase aguda, por
lo tanto, niveles séricos aumentados se relacionan con enfermedades inflamatorias agudas.
Niveles séricos disminuidos se observan en enfermedades autoinmunes, glomerulonefritis,
deficiencias congénitas, etc.
❖ LIMITACIONES
La turbidez y la presencia de partículas en las muestras, pueden interferir con la
prueba. Por lo tanto, las partículas que puedan resultar de una coagulación incompleta, o de
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una desnaturalización de las proteínas, deben ser removidas por centrifugación antes de
proceder a su ensayo.
Las muestras que presentan absorbancias superiores al calibrador más alto de la curva
de calibración, deberán ser diluidas y ensayadas nuevamente. La concentración de C3 para
dichas muestras se obtiene multiplicando el resultado obtenido por el factor de dilución
correspondiente.
NEFELOMETRÍA
Es una técnica que mide la luz dispersada (desviada) en una dirección determinada
(en general se define a 90º) por las partículas presentes en la suspensión. En este método se
mide directamente la luz dispersada, es más sensible que la turbidimetría por lo que es el
método recomendado para mezclas con muy baja turbidez.
La nefelometría cuantitativa es un examen de laboratorio para medir en forma rápida

y precisa los niveles de ciertas proteínas llamadas inmunoglobulinas en la sangre. Las
inmunoglobulinas son anticuerpos que ayudan a combatir una infección. Este examen mide
específicamente las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA.
❖ FUNDAMENTO
Procedimiento analítico que se
basa en la dispersión de la radiación
que atraviesa las partículas de la
materia cuando la luz atraviesa en un
medio transparente en el que existe una
suspensión de partículas sólidas, se
dispersa en todas las direcciones y
como consecuencia se observa turbia.
La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante solo es afectada la

dirección de la propagación porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier
ángulo, lo hace usando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente
luminosa, a través de la cual se ilumina la muestra para analizar que se encuentra en una
23
cámara fotocelda de lectura las partículas de la suspensión dispersa en la luz y esta luz va a
un dispositivo detector, finalmente en el sobreseimiento central junto a la fuente luminosa
absorbe la luz directa de la muestra a analizar, cuanta mayor dispersión de luz se detecte e
igual a mayor concentración del analito buscado y a menor dispersión menor concentración.
❖ APLICACIONES
• Tiene aplicación para la determinación de fracciones del complemento,
inmunoglobulinas, transferrina, haptoglobina, cadenas kappa y lambda, albúmina, pre-
albúmina, proteína C reactiva, factorreumatoide, alfa 2 macro globulina y otras proteína.
• Se usa en instrumentos automatizados que mide la sensibilidad de los antibióticos,

determinación de ribonucleasas y sulfatos en orinas.
• Detección de complejos inmunes Cuando una muestra biológica contiene un antígeno

de interés, éste se mezcla (en una solución buffer) con un anticuerpo para formar un complejo
inmune. La nefelometría mide la cantidad de luz que se dispersa por la reacción antígeno-
anticuerpo (Ag-Ac), y de esta manera se detectan los complejos inmunes
❖ INSTRUMENTOS
• Nefelómetro
Para la nefelometría es necesario emplear un
equipo con características específicas, que recibe el
nombre de nefelómetro. Sus componentes básicos son:
- Fuente de luz: los modelos más antiguos
empleaban la lámpara dewolframio. En la actualidad
se usan lámparas de arco de mercurio (Hg), diodos
emisores o láser de helio-neón, de baja potencia.
- Sistema colimador (innecesario con la lámpara de láser), cuyas funciones la de
concentrar el rayo de luz en haces paralelos.
- Sistema óptico (colimador + selector de longitud de onda).
- Cubeta de medición.
- Detector a 90°
24
❖ MUESTRA
Suero, plasma sanguíneo, orina.
❖ PROCEDIMIENTO
En esta técnica se añade a la muestra de suero un anticuerpo específico frente a la
proteína que queramos detectar. El anticuerpo se añade en unas condiciones en las que la
unión con su proteína va a producir una inmunoprecipitación en fase líquida. Cuando se
aplica una luz a la muestra el inmunoprecipitado va a dispersarla. La luz dispersada en
determinados ángulos por estos inmunocomplejos solubles se mide mediante células
fotoeléctricas como densidad óptica. La cantidad de luz dispersada es proporcional a la
concentración de proteína en suero.
❖ PATOLOGÍAS RELACIONADAS A LAS DEFICIENCIAS DE LAS

INMUNOGLOBULINAS
Aumento de los niveles de IgG Disminución de los niveles de IgG
● Agammaglobulinemia (niveles muy
● Infección o inflamación crónica bajos de inmunoglobulinas, un trastorno muy
● Hiperinmunización (número más raro)
alto que lo normal de anticuerpos ● Leucemia (cáncer de la sangre)
específicos) ● Mieloma múltiple (cáncer de la médula
● Mieloma múltiple por IgG (un tipo ósea)
de cáncer de la sangre) ● Preeclampsia (presión arterial alta
● Enfermedad hepática durante el embarazo)
● Artritis reumatoidea ● Tratamiento con ciertos fármacos
quimioterapéuticos
Aumento de los niveles de IgM: Disminución de los niveles de IgM

● Mononucleosis
● Linfoma (cáncer del tejido linfá- ● Agammaglobulinemia (muy rara)

tico)
● Leucemia
● Macroglobulinemia de Waldens-
25
tröm (cáncer de los glóbulos blancos en la ● Mieloma múltiple

sangre)
● Mieloma múltiple
● Artritis reumatoidea
● Infección
Aumento de los niveles de IgA Disminución de los niveles de IgA

● Infecciones crónicas, especialmente ● Agammaglobulinemia (muy rara)
del tracto gastrointestinal ● Deficiencia hereditaria de IgA
● Enfermedad intestinal inflamatoria, ● Mieloma múltiple
como la Enfermedad de Crohn ● Gastroenteropatía por pérdida de
● Mieloma múltiple proteínas
(Diagnóstico conjunto a otras pruebas)
26
REFERENCIAS BIBIOLOGRÁFICAS
Calculating and evaluating ELISA data, (s.f). Abcam.Recuperado de:

https://www.abcam.com/protocols/calculating-and-evaluating-elisa-data
Cetola V., (2000). Método inmunoturbidimétrico para la determinación del

componente C3 del complemento. Recuperado de:
https://www.wienerlab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/c3_turbi
test_aa_sp.pdf
Complemento (s.f). Labtestonline. Recuperado de:

https://labtestsonline.es/tests/complemento
Hernández, L., González, C., (2002), Introducción al Análisis Instrumental. Editorial:

Ariel Ciencia. Wentworth, Ladner. (1975), Fundamentos de química física
Martínez E., (2012).Determinación de biomasa. Slideshare. Recuperado de:

http://www.slideshare.net/yuricomartinez/labo2-peso-hmedo-pesoseco-turbidimetra
Medida de los analitos por fotometría y espectrofotometría. [Blog]. Recuperado de:

http://elblogdeadepi.blogspot.com/p/resumen-analisis-bioquimico-fundamentos.html
Rodríguez, F. (2019). Determinación de IgG por Inmunodifusión Radial (IDR).

Recuperado de: https://www.franrzmn.com/determinacion-igg-inmunodifusion-radial-idr/
Rojas M., Anaya C., Cano L., Aristizábal B., Gómez L., Lopera D.,
(2017). Inmunología de Rojas (17th ed.). Colombia: Corporación para Investigaciones
Biológicas (CIB).
Spike and-Recovery and Linearity of Dilution Assessment for ELISA. (s.f).

Thermofisher. Recuperado: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-
science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-
library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html
27
Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Carrera, Ana

28
INTRODUCCION
La cuantificación de linfocitos T circulantes es de suma importancia para la
evaluación de pacientes en estudio por deficiencias de su sistema inmune, ya sean innatas o
adquiridas. La enumeración de las poblaciones linfocitarias (T y B), en conjunto con las
pruebas que evalúan su funcionalidad, contribuyen a precisar la naturaleza de la
inmunodeficiencia y a predecir las complicaciones más probables que enfrentará el paciente,
así como a establecer una base para las estrategias profilácticas y terapéuticas posibles. Por
ejemplo, la evaluación del estado inmunológico de los pacientes infectados por el virus de
inmunodeficiencia humana (HIV), incluye un control periódico de sus cifras de linfocitos T,
en especial la subpoblación CD4+ (T cooperadores), cuyas disminuciones muestran
correlación con la aparición de los signos y síntomas característicos del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Por otra parte, durante el seguimiento y control de pacientes que reciben tratamientos
inmunosupresivos fuertes (por ejemplo, en receptores de trasplantes, o pacientes con
neoplasias tratadas mediante quimioterapia/radioterapia, etc.), la evaluación de linfocitos T
y B puede proveer información útil para regular la dosificación del tratamiento. Algunos
estudios han descrito que es posible predecir tempranamente una crisis de rechazo en
trasplantes renales mediante la detección de un aumento de los linfocitos T circulante.
En el caso de enfermedades linfoproliferativas como las leucemias linfocíticas, la
clasificación con base en su origen T, B, o NK posee interés, dado que el pronóstico y la
susceptibilidad a distintas terapias pueden mostrar diferencias.
29
POBLACIONES LINFOCITARIAS
Generalidades de las poblaciones celulares
Una población celular es un conjunto de células de un mismo tipo que se encuentran
en un ambiente determinado.
Los linfocitos son un grupo de células del sistema inmunitario. Sus características más
importantes
• Son las únicas células capaces de reconocer diversos determinantes antigénicos y
distinguirlos específicamente
• Desempeñan un papel fundamental en el control de las infecciones
En los linfocitos se evidencian subpoblaciones que difieren entre sí en sus funciones y
productos proteicos, pero son muy similares desde el punto de vista morfológico. Por esta
razón se necesitan técnicas de alta sensibilidad y especificidad para su estudio diferencial.
Los linfocitos humanos pueden clasificarse en dos poblaciones principales según
su función biológica y su expresión de antígenos de superficie celular: linfocitos B y
linfocitos T.
– Linfocitos B: Están implicados en la inmunidad adaptativa con un rol fundamental
que es el de producir anticuerpos (inmunidad humoral).
– Linfocitos T: a diferencia de los linfocitos B, los linfocitos T están involucrados en

la inmunidad celular. Reconocen antígenos de los microorganismos intracelulares y actúan
destruyendo los microorganismos y las células infectadas.
• Linfocitos T cooperadores: son CD3+CD4+. Su función característica es que,
luego de activarse por exposición a un antígeno secretan intermediarios (citocinas)
que ayudan a la activación y proliferación de otras células como macrófagos y linfocitos
B, para controlar la infección.
• Linfocitos T citotóxicos: Están implicados en la destrucción de células
infectadas por microbios y células tumorales.
Células NK
Además de los linfocitos B y T existen otros tipos de células denominadas células
NK que son morfológicamente indistinguibles de los linfocitos T y B excepto por los
gránulos que contienen. Las células NK son componentes importantes en la
defensa inmunitaria innata y median la citotoxicidad contra ciertas células tumorales y
células infectadas por virus.
Monocitos
Los monocitos son células sanguíneas que pertenecen a una subpoblación de
leucocitos, denominada sistema de fagocitos mononucleares.
• Se encargan de la regulación de la inmunidad innata y adaptiva, así como de la
remodelación del tejido y la homeostasis.
30
• Cumplen la función patrullaje en búsqueda permanente de algo anormal.

• Fagocitosis consiste en capturar y digerir partículas que son peligrosas y nocivas para
el organismo. (esto pasa cuando ellos pasan a los diversos tejidos y órganos del
cuerpo convirtiéndose en MACROFAGOS).
Métodos de separación de las poblaciones linfocitarias: tipos, fundamento.
Bøyum (1958) ideó un método basado en la centrifugación de la muestra sobre un
gradiente de densidad discontinuo, en donde el medio original consistía en una mezcla de
ficoll y metrizoato de sodio, con densidad de 1,077 g/ml. Este método es rápido y simple,
por lo que se utiliza muy comunmente para obtener preparaciones enriquecidas de linfocitos
sanguíneos. Aunque estrictamente esta técnica resulta en la separación de los leucocitos
mononucleares, que incluyen tanto a los linfocitos como a los monocitos, los primeros
superan ampliamente en número a los segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre
periférica.
El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla de
dos componentes. El ficoll 400 es un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina, de
400.000 daltons, soluble en agua. Por otra parte, el diatrizoato de sodio (que ha sustituido al
metrizoato de la fórmula original de Bøyum) es un compuesto que, al ser mezclado con el
ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad.
La función del diatrizoato es proveer la densidad óptima para la separación y a la vez
la osmolaridad adecuada para mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa
la aglutinación de los eritrocitos, lo cual facilita aún más su sedimentación.
Fundamento de la separación
Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las
células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se
mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y
sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y por
su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su menor
densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio, con presencia baja de
plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la centrifugación, los leucocitos mononucleares
se recogen del anillo blanco que se forma en la interfase entre el plasma y el ficoll-
diatrizoato.
Factores que afectan el procedimiento
La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporción con el volumen y la altura
del medio de separación. Al aumentar la altura del estrato de sangre con respecto a la altura
del medio, se aumenta la contaminación con eritrocitos en la interfase. Por esto, el diámetro
del tubo es un factor importante para establecer el volumen de sangre óptimo para fraccionar.
Para aumentar el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el diámetro del tubo, tratando
de no variar la altura de las capas de medio y de sangre.
El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran parte de la eficiencia en
la remoción de los eritrocitos. Cuando estos son aglutinados por el ficoll, algunos linfocitos
son atrapados dentro de los grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenómeno se reduce
31
diluyendo la sangre 1:2 antes de fraccionarla, usando una solución salina fisiológica, con el
fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos. La aglutinación de los glóbulos rojos se
favorece conforme aumenta la temperatura, con lo cual se acelera la separación, pero se
disminuye el rendimiento (ej. a 37°C). En bajas temperaturas (4°C) se disminuye la
velocidad de agregación, por lo que hay que prolongar el tiempo de separación. Una
temperatura de alrededor de 18°C da resultados óptimos en cuanto al balance entre tiempo
y rendimiento.
Procedimiento
1. Colocar 2 ml de F-D (ficoll-diatrizoato) en un
tubo de 10-15 ml.
2. Diluir 2 ml de sangre (anticoagulada1 o
desfibrinada) con 2 ml de solución salina fisiologica
(SSF)
3. Estratificar cuidadosamente 4 ml de la sangre
diluída sobre el F-D (¡no mezclar!).
4. Someter a 1800 rpm por 40 min
5. Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el
tubo de la centrífuga y aspirar el plasma (capa superior)
con una pipeta, delicadamente, dejando intacto el anillo
blanquecino de células mononucleares en la interfase.
6. Aspirar el anillo de células mononucleares, sin
recoger demasiado plasma, ni F-D. Depositar las
células en un tubo limpio.
32
7. Añadimos 10 ml SSF, mezclamos, sometemos a 1600 rpm por 10 min.

8. Descartamos 5ml, agregamos 5ml y lo sometemos a 1600 rpm por 10min
9. Se descarta 10 ml.
10. Con una pipeta Pasteur sin bulbo, transferir por capilaridad una gota de la suspensión
a una cámara de recuento celular.
11. Contar 100 linfocitos con el objetivo de 40x y anotar como "rosetas" aquellos
linfocitos que posean 3 o más eritrocitos adheridos. No deben contarse las células permeables
al azul tripán (dañadas), ni los monocitos.
12. Calcular el porcentaje de linfocitos T (%T o % células E+), así como su número
absoluto (T/µl ò células E+ /µl) con base en los datos del hemograma de la muestra (número
de leucocitos totales y fórmula leucocitaria diferencial).
• Ejemplo del cálculo de la cifra absoluta de linfocitos T:
Expresión de resultados e interpretación
Las cifras de linfocitos T obtenidas deben expresarse tanto en números absolutos
(T/mm3, T/μl) como relativos (%), para evitar errores de interpretación. Los valores de
referencia deben ser preferentemente establecidos en las condiciones de cada laboratorio.
El uso de la cámara en esta etapa es esencial, ya que, si la lectura final se realiza en un
portaobjetos con cubreobjetos convencional, la
presión que ejerce este último, al colocarlo,
disgrega un cierto número de rosetas. En cambio,
el espacio (0,1 mm) existente entre el
cubreobjetos y la superficie de la cámara de
Neubauer evita este problema.
El anticoagulante recomendado para
obtener la muestra de sangre es la heparina sódica
(10-50 U/ml) sin preservantes. El EDTA puede
causar una disminución en la formación de
rosetas. La muestra debe ser procesada el mismo
día, para preservar al máximo la viabilidad
linfocitaria.
Ventajas: Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos
presentes en la muestra, con una viabilidad mayor del 90% (determinada mediante exclusión
del azul tripán)
Desventajas: La unión que se establece entre los linfocitos T y los eritrocitos de
carnero es muy frágil, lo cual constituye el principal problema técnico de este método: las
agitaciones, aún leves, pueden desintegrar las rosetas y causar amplias variaciones en los
resultados.
Cuantificación de linfocitos T mediante formación de rosetas
Las diferentes poblaciones y subpoblaciones de linfocitos no son distinguibles morfo-
33
lógicamente. Para identificarlas, se requieren métodos de laboratorio que detectan, por lo

general, proteínas de membrana que utilizamos como "marcadores" de dichas poblaciones.
Alrededor de 1970 se encontró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse
espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones llamadas
rosetas E.
El fenómeno de formación de rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen
en su superficie un receptor que media la unión con los eritrocitos de carnero.
Inicialmente, este receptor fue denominado "antígeno T11", cuando se generaron las
primeras series de anticuerpos monoclonales contra marcadores de los linfocitos T.
Posteriormente, cuando se introdujo el uso de la nomenclatura de "grupos de diferenciación"
(CD, clusters of differentiation), se cambió su nombre a CD2. Esta es una glicoproteína de
membrana de 50 kDa, presente en todos los linfocitos T humanos maduros, cuya función
natural es la interacción con una glicoproteína de 40-70 kDa, denominada LFA-3 (leukocyte
function antigen) o CD58, presente en la superficie de diversos tipos celulares. Los
eritrocitos de carnero poseen una molécula análoga al LFA-3 humano en su superficie.
Independientemente de la función natural del CD2, su presencia es útil para
identificar a los linfocitos T humanos, a través de la formación de rosetas.
Solamente los linfocitos T viables pueden formar rosetas, por lo que las células
muertas (que se detectan porque han incorporado el colorante supravital azul de tripán) no
deben ser tomadas en cuenta para establecer el porcentaje de linfocitos T por este método.
La formación óptima de las rosetas se logra con una incubación breve a 37°C, seguida de un
período más largo a 4°C, a pH fisiológico.
Roseta B
Propiedad que tienen los linfocitos B (con receptores en su superficie para el fragmento
Fc de las inmunoglobulinas) de producir rosetas con hematíes recubiertos de anticuerpos
antieritrocitarios (p. ej., hematíes D recubiertos de anticuerpos anti-D). Se le denomina test
de rosetas EA (eritrocito-anticuerpo), pues no precisa complemento.
Estas células son, en su mayoría, theta negativas. No es un buen marcador de linfocitos
B, pues otras células distintas de las células B tienen dicho marcador, como los monocitos,
las células T activadas y las células K. Además, no todas las células B tienen receptor para
34
el fragmento Fc de las inmunoglobulinas.

Técnica Inmunitaria de las Rosetas tipo B.
Los pasos 1 - 6 son los mismos que los efectuados para la técnica de Rosetas T.
5. Tomar 0,25 ml. del reactivo linfocitos B (reactivo C3) y mezclarlo con 0,25 ml. células
linfocitarias.
6. Centrifugar a 1.500 r.p.m. durante 2', bajo control de cronómetro.
7. Incubar 30' a temperatura de laboratorio.
8. Retirar el sobrenadante con pipeta Pasteur.
9. Añadir 2 ml. de solución de Hanks, o incluso 3 ó 4 ml. si queda muy concentrado.
10. Ponerlo durante 10 segundos en un agitador rápido.
11. Lectura.
Hay que destacar que para el empleo del C3 solamente se necesita suero humano.
Se cuentan en el hematocímetro no menos de 200 células. Se considera como célula
formadora de roseta aquélla que al menos adhirió 3 hematíes en su superficie.
35
Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Lunes B

36
INTRODUCCIÓN
La inmunofluorescencia es una técnica hondamente versátil, efectuada primeramente
por Albert Hewett Coons, Hugh J Creech, Norman Jones y Ernst Berliner de la Universidad
de Harvard en 1941; a la cual se le han dado una extensa gama de usos en el ámbito científico
y clínico. Puede ser utilizada para responder preguntas ecológicas, genéticas y fisiológicas
respecto a muchos organismos. Entre las aplicaciones clínicas se tiene que se aprovecha para
el diagnóstico directo de algunas enfermedades dermatológicas, bien sea empleando
inmunofluorescencia directa o indirecta sobre tejido epitelial de los pacientes estudiados. La
importancia de esta técnica de laboratorio radica en el hecho de su amplia utilidad en el área
de investigación y diagnóstico de una variedad de agentes virales, tanto en humanos como
en animales, se ha dispuesto en organismos unicelulares como las levaduras para visualizar
los microtúbulos intranucleares y citoplasmáticos, actina y proteínas asociadas, los
filamentos de 10 nm y otros constituyentes del citoplasma, de la membrana y las paredes
celulares.
En términos generales, la Inmunofluorescencia es una técnica de imagen basada en

la tinción de células con anticuerpos formados contra una proteína diana que se conjuga
concisamente con un fluorocromo o en su defecto se emplea junto a un anticuerpo secundario
conjugado. Desarrollar los conocimientos en un procedimiento como la
inmunofluorescencia nos permitirá diagnosticar enfermedades autoinmunitarias, siendo una
herramienta precisa para el juicio médico.
La inmunofluorescencia se clasifica en dos grandes grupos, la cuantitativa

(inmunoensayo de polarización fluorescente) y la cualitativa (Directa, Indirecta o Indirecta
amplificada por el complemento).
37
CUESTIONARIO DIAGNOSTICO
1.- ¿Qué es un sustrato en inmunofluorescencia?

El sustrato es el corte de tejido el cual contiene los antígenos que queremos
determinar o buscar en el paciente.
2.- ¿Qué es un anticuerpo monoclonal?

Es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B. Los anticuerpos
monoclonales son anticuerpos idénticos porque son producidos por un solo tipo de célula del
sistema inmune, es decir, todos los clones proceden de una misma célula madre.
3.- ¿Qué es un anticuerpo antinuclear?

El sistema inmunitario normalmente produce anticuerpos para ayudarte a combatir
infecciones. Por el contrario, los anticuerpos antinucleares a menudo atacan los propios
tejidos del cuerpo. Los anticuerpos antinucleares son autoanticuerpos que tienen como
blanco el contenido del núcleo celular. Están presentes en enfermedades autoinmunes como
el Lupus.
4.- ¿Qué es fluorescencia?

La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las
sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y
luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda
diferente.
38
INMUNOFLUORESCENCIA
Es una técnica histocitoquímica de laboratorio que permite la detección de un

antígeno o un anticuerpo, mediante el uso de sustancias fluorescentes denominadas
fluorocromos. Se emplea, de manera habitual, en el diagnóstico de enfermedades
autoinmunes. Es un conjunto de técnicas diagnósticas que recurren al uso de sustancias
fluorescentes, fluorocromos, que permiten detectar la presencia de un antígeno o anticuerpo
en células o tejidos.
Fundamento
Las moléculas proteicas de los anticuerpos se unen al marcador fluorescente
(fluorocromo) por medio de enlaces firmes químicos como la actividad inmunológica de
estos no se altera, la capacidad de los mismos de unirse a los antígenos homólogos
permanece integra.
Tipos de inmunofluorescencia
La técnica de inmunofluorescencia tiene variantes que pueden ser cuantitativas o
cualitativas.
1. Cuantitativa: la variante cuantitativa es el inmunoensayo de polarización

fluorescente (FPIA) es un inmunoensayo de tipo competitivo en fase homogénea, muy
utilizado en ensayos de laboratorio clínico para la cuantificación de analitos que se
encuentran en muy baja proporción en los líquidos biológicos, del orden del microgramo o
nanogramo por mililitro, tales como hormonas, drogas terapéuticas, drogas de abuso,
vitaminas y algunos aminoácidos, de importancia clínica.
Método del Inmunoensayo de polarización fluorescente

Un anticuerpo específico para reconocer a la molécula de interés es puesto en
contacto con la muestra biológica que contiene el analito y con una cantidad conocida de la
misma molécula de interés unida químicamente a otra molécula que sirve de "marca" o
"etiqueta" capaz de generar una señal mensurable, la molécula natural presente en la muestra
biológica compite por los sitios de unión en los anticuerpos con la molécula marcada y al
final de un cierto tiempo necesario para que el sistema se estabilice, la proporción de
39
moléculas marcadas unidas a los anticuerpos resulta inversamente proporcional a la cantidad

de molécula natural presente en la muestra. Esta proporción de molécula marcada unida al
anticuerpo es la que genera la señal que se mide. En los ensayos competitivos por lo tanto la
señal producida es inversamente proporcional al analito presente en la muestra (A menor
cantidad de analito, mayor es la señal y viceversa); esta propiedad permite cuantificar con
facilidad muy pequeñas cantidades y variaciones en la concentración de un analito.
En lo que se distingue FPIA de otros inmunoensayos competitivos es en la forma en

que se genera y detecta la señal. En FPIA la molécula marcadora es fluorescente, y lo que se
detecta es la luz polarizada en un plano específico generada por la fluorescencia de la marca.
En FPIA la molécula competidora marcada es fluorescente y comparativamente

pequeña, por lo que presenta altas velocidades de rotación en relación a su tiempo de
decaimiento. Pero cuando la molécula marcada se une a un anticuerpo, que tiene una masa
de varios cientos de miles de daltons, gira mucho más lentamente. Las moléculas libres al
ser iluminadas con luz polarizada generan luz no polarizada, pero las moléculas marcadas
unidas al anticuerpo que giran mucho más lentamente emiten luz polarizada. La intensidad
de la luz polarizada obtenida es por lo tanto proporcional a la cantidad de molécula
competidora marcada unida al anticuerpo e inversamente proporcional a la cantidad de
molécula natural presente en la muestra de interés
2. Cualitativa: existen tres técnicas cualitativas, las cuales son:
a. Directa o primaria: La muestra clínica que presuntamente contiene el antígeno

bajo estudio es puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho
microorganismo conjugado con un fluorocromo (como por ejemplo fluoresceína). Si el
antígeno esperado está presente se formará un complejo antígeno--anticuerpo. La reacción
positiva es en forma de fluorescencia verde manzana y puede verse con la ayuda de un
microscopio de fluorescencia.
40
Imagen 1. Inmunofluorescencia directa
b. Indirecta o secundaria: es una técnica de doble capa en donde se aplica el

anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento
con suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo. El proceso se realiza en dos
etapas:
Imagen 2. Etapas de la inmunofluorescencia indirecta
- La primera etapa: se fijan sobre un portaobjeto los antígenos que constituyen el

sustrato conocido como especifico, sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la
presencia de Ac específicos; si la reacción es positiva se dará la formación del complejo Ag-
Ac no visible ya que el anticuerpo no está marcado.
41
- La segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que

reaccionará con el Ac del complejo producido en la primera etapa y dará la fluorescencia.
Imagen 3. Inmunofluorescencia directa e indirecta
c. Indirecta amplificada por el complemento: esta técnica está basada en el método

indirecto para la detección de Ac que fijan el complemento. El procedimiento es parecido
pero en el segundo paso se añade complemento fresco, que queda fijado alrededor de las
zonas a las que se ha unido el Ac. Una única molécula de Ac puede inducir la unión de
muchas moléculas de C3b a la sección, debido al proceso de amplificación que se produce
en la vía clásica del complemento; a continuación, estas moléculas de C3b pueden ser
visualizadas mediante anti-C3 marcado con fluoresceína.
42
Imagen 4. Inmunofluorescencias cualitativas
Ventajas de la inmunofluorescencia
• Se pueden obtener resultados rápidos
• No es necesario realizar cultivos
• Se pueden identificar microorganismos específicos en un grupo mixto
• Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible
Desventajas de la inmunofluorescencia
• Costos en reactivos y equipos
• Debe ser utilizado por personal especializado
• Los resultados no son 100% específicos
• Perdida de actividad fluorescente causada por la exposición a la luz
43
Aplicación de los métodos
✓ Inmunofluorescencia directa: Las técnicas directas han sido adaptadas para

diagnostico bacteriológico, micológico, viral, en la inmunopatología, en la investigación de
depósitos de complemento o inmunoglobulinas o complejos Ag-Ac sobre determinadas
estructuras.
La inmunofluorescencia directa se utiliza para diagnosticar enfermedades de tipo

autoinmunitario, es decir, aquéllas en las cuales las defensas pierden el control y atacan algún
órgano de nuestro propio organismo. Es de gran utilidad para el diagnóstico de
enfermedades de piel y mucosas, como el lupus eritematoso. También permiten la detección
de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM) y fracción 3 del complemento, cadenas ligeras lambda
y cadenas ligeras kappa sobre tejido congelado. Sus aplicaciones más comunes son el estudio
de enfermedades ampollosas o inmunitarias sobre biopsia cutánea y la clasificación de
glomerulopatías en biopsia renal.
✓ Inmunofluorescencia indirecta: la detección por el método indirecto tiene mayor

sensibilidad que el directo, por presentar amplificación de señal debido a una unión de dos
o más anticuerpos, se utiliza para diagnosticar Treponema pallidum (FTA-abs), Toxoplasma
gondii, Rickettsia conorii. Las técnicas indirectas se usan también ampliamente para
diagnostico en múltiples campos y como técnicas cuantitativas en múltiples sistemas,
ejemplos de éstas los tenemos en el diagnóstico de sífilis, lupus eritematosos sistémico y
toxoplasmosis.
Microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta
en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La
imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas
que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.
Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados
debajo del condensador y encima del objetivo.
Está compuesto por:

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• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia
en el espectro específico de cada fluorocromo. Se emplean lámparas de mercurio a alta
presión.
• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda,
la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no
deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo
dicroico y es nuevamente filtrada para poder ser observada. Los tipos de filtros son:
- Filtro de excitación: selecciona la longitud de onda o el espectro de excitación

necesaria para excitar la muestra.
- Filtro dicroico: refleja la luz necesaria para la excitación y transmite el resto en

la banda de emisión.
- Filtro de emisión o de barrera: actúa como una especie de control de calidad, ya

que solo permite pasar las longitudes de onda de interés.
• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen
de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.
Imagen 5. Componentes del Microscopio de fluorescencia

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Utilidad del microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de
inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de
sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la
información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa
desapercibida. Este microscopio tiene numerosas aplicaciones, como, por ejemplo:
• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.
• Estudios inmunológicos.
• Mineralogía.
Diferencia con otros microscopios
Microscopio de Microscopio Microscopio de luz
Microscopio óptico
fluorescencia electrónico ultravioleta
Utiliza propiedades
La muestra es La muestra no es
de fluorescencia Ilumina la muestra
iluminada mediante iluminada con luz.
para generar la con luz ultavioleta
luz visible Se utiliza electrones
imagen.
Permite observar Los electrones
Puede observar una
sustancias que La luz es conducida impactan sobre la
muestra que es
emiten luz propia a por un objetivo y un muestra dentro de
transparente a luz
una longitud de ocular. una cámara de
visible.
onda determinada. vacío.
Fluorocromos
Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor
energía (mayor longitud de onda). Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color
determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia.
La reacción de unión ocurre entre los grupos aminos y carboxilo de la proteína y los
grupos tiocinato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El pH afecta la fluorescencia por
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esto se debe de trabajar a pH estable y adecuado dependiendo del colorante.
Para las técnicas cualitativas los fluorocromos que se utilizan son: Fluoresceína que
se debe trabajar a un pH 8, isotiocrato de fluoresceína o rodamina que se debe trabajar a un
pH 7. Para las técnicas cuantitativas se pueden utilizar: samario, europio o tiberio.
Fluoróforo
Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la
fluorescencia.
Tipos de fluoróforos
1.- Moléculas orgánicas: Los fluoróforos Alexa Flúor (derivados de la rodamina)
han sido utilizados como marcadores de biomoléculas. La fotoestabilidad es una de las
principales características de este tipo de colorantes, además barren todo el espectro.
2.- Puntos cuánticos: son nano cristales (2-50 nm) semiconductores que, al ser
iluminados, re-emiten luz en una longitud de onda muy específica y que depende del tamaño
de este. Cuanto más pequeños sean los puntos, menor es la longitud de onda y más acotadas
las propiedades cuánticas de la luz que emiten. Por ello la luz emitida vira del azul al rojo a
medida que el tamaño del punto se incrementa.
3.- Proteicos: GFP posee un barril beta formado por 11 cadenas e incluye una hélice
alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice hay tres aminoácidos
consecutivos que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada
con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.
Espectros de absorción y emisión

- Espectro de absorción: Muestra la diferente intensidad de fluorescencia observada
en función de la longitud de onda de excitación, a una longitud de onda de emisión fija.
- Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en función

de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de excitación fija (máxima).
Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presen-

ta un espectro de absorción y de emisión característica y única. Los fabricantes dan el pico
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de máxima absorción y el pico de máxima emisión o bien los espectros de absorción y

emisión.
Imagen 6. Espectros de emisión y absorción
Los fluorocromos mas utilizados son: Fluoresceina y rodamina

Longitud de Longitud de
Color de Color de
Fluorocromo onda de onda de
absorcion emisión
absorcion (nm) emisión (nm)
Fluoresceina Verde
494 Azul 520
(FTIC) manzana
Rodamina Rojo -
540 Verde 570
(TRITC) naranja
Imagen 7. Longitud
de onda de
fluoresceína y
rodamina
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Utilidad
Los fluorcromos son muy utiles porque la molécula que es marcada con ellos
(fluorescente), aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite.
Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser
localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia.
Ventajas
No requieren proteínas recombinantes (pero si un anticuerpo primario)
Desventajas
• Si damos un pulso de luz de excitación a una población de fluoróforos en un solvente
uniforme, la fluorescencia se decae exponencialmente.
• Pueden generar puentes (aglomeraciones) en proteínas membranales
• La mayoría de los fluoróforos tienen una vida media (τ) en el rango de nanosegundos
Equipos para utilizados para la inmunofluorescencia cuantitativa

En la inmunofluorescencia cuantitativa se puede utilizar el microscopio de
fluorescencia o también se puede utilizar un fluorímetro o fluorometro.
Un fluorímetro es un dispositivo de laboratorio utilizado para medir los parámetros

de la fluorescencia: su intensidad y la distribución de longitudes de onda del espectro de
emisión después de la excitación por un cierto espectro de luz. Estos parámetros se utilizan
para identificar la presencia y la cantidad de ciertas moléculas específicas en un medio.
Los fluorímetros mo-

dernos son capaces de dete-
ctar concentraciones de mo-
léculas fluorescentes tan ba-
jas como 1 parte por billón.
Imagen 8. Esquema general

de un fluorímetro
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También se pueden utilizar equipos automatizados que es el analizador cuantitativo

de inmunofluorescencia.
Pruebas que se pueden determinar por este método

Prueba de Anticuerpos antinucleares (ANA)
Una prueba de ANA detecta anticuerpos antinucleares en la sangre. El sistema
inmunitario normalmente produce anticuerpos para ayudarte a combatir infecciones. Por el
contrario, los anticuerpos antinucleares a menudo atacan los propios tejidos del cuerpo (se
dirigen específicamente al núcleo de cada célula).
La detección de ANA debe realizarse mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI)

en líneas celulares como prueba de tamizado inicial debido a su alta sensibilidad. El título
de referencia para los ANA es de 1:40 para adultos y 1:20 para niños. Títulos o suelen ser
indicativos de una enfermedad autoinmune.
Los ANAs sugieren la presencia de un lupus eritematoso sistémico (en el cual se

encuentran presentes en más del 90 % de los pacientes clínicamente diagnosticados); aunque
también pueden aparecer en otras patologías autoinmunes reumatológicas como la
enfermedad mixta del tejido conectivo (>90 % de los casos), el síndrome de Sjögren (60 %),
la artritis reumatoide, la esclerodermia, la polimiositis y dermatomiositis (30 %); y también
50
en otras condiciones autoinmunes no reumáticas como hepatitis autoinmune, enfermedad de

Addison, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), enfermedad de Hashimoto, anemia
hemolítica autoinmune, esclerosis múltiple o diabetes mellitus tipo I.
Detección de anticuerpos anti-DNA

El ensayo se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos que reaccionan
contra el DNAn de la mitocondria gigante (cinetoplasto) del parásito Crithidia luciliae. La
prueba solo se considera positiva cuando se tiñe el cinetoplasto independientemente de la
tinción en el núcleo, debido a que en el núcleo puede existir reactividad contra otros
componentes, lo que da resultados falsos positivos. La técnica es altamente específica, pero
poco sensible, por lo que es conveniente en ciertos casos confirmar los resultados con otras
pruebas más sensibles como el ELISA.
Los anticuerpos antiDNA son considerados marcadores de Lupus Eritematoso

Sistémico (LES), su prevalencia en estos pacientes es de 40% a 80%. Bajos niveles de estos
anticuerpos pueden estar presentes en otras enfermedades autoinmunes. Existe una
correlación entre los niveles de los anticuerpos anti-DNA y la actividad de la enfermedad.
Por esta razón, es una herramienta para seguir la evolución de la enfermedad y eficacia del
tratamiento.
Anticuerpos anti-citoplasma del neutrófilo

Para la detección de los ANCA, la IFI se utiliza también como prueba de tamizado
inicial, debido a que en ella se observan los 3 patrones de tinción que se relacionan con
manifestaciones clínicas de autoinmunidad. Los patrones son: el citoplásmico o cANCA, el
perinuclear o pANCA y el atípico o xANCA. El patrón cANCA se caracteriza por presentar
una tinción citoplásmica en neutrófilos fijados con etanol o acetona. Los anticuerpos que dan
el patrón cANCA reconocen proteínas débilmente catiónicas o neutras como la proteinasa-
3 (PR-3) y la proteína catiónica de 57kDa (CAP-57), las cuales se liberan de los gránulos
específicos por el tratamiento de las células con alcohol o acetona y se distribuyen de manera
homogénea en el citoplasma de los neutrófilos.
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Imagen 9. Patrón cANCA.
El patrón pANCA se observa en neutrófilos fijados con etanol o acetona y es

perinuclear homogéneo. El patrón está dado por los anticuerpos que reconocen proteínas
fuertemente catiónicas como: mieloperoxidasa (MPO), elastasa y azurocidina, las cuales
cuando son liberadas de los gránulos primarios y específicos del neutrófilo se reorganizan
en la periferia del núcleo, el cual tiene carga negativa por el DNA.
El patrón xANCA o atípico es el resultado del reconocimiento de las proteínas:

catepsina G, lisozima y lactoferrina. Dichas proteínas se liberan de los gránulos específicos
de los neutrófilos y se redistribuyen en la periferia del núcleo cuando son tratados con etanol,
acetona o formalina.
Imagen 10. Patrón xANCA o atípico

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Delves P, Martin S, Burton D, Roitt I. (2014) Inmunología. Londres, Reino Unido.

Editorial Panamericana.
Bruno Lomonte, V. (2009). Técnicas de Laboratorio en Inmunología Clínica.

Obtenido de http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/
Burtis , A., Ashwood, E., & Burns, D. (2008). Tietz Fundamentals of Clinical
Chemistry. Obtenido de Wikipedia: https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunofluorescencia/
Hernández Ramírez, D., & Cabiedes, J. (2009). Técnicas inmunológicas que apoyan
el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. Obtenido de
https://www.reumatologiaclinica.org/
Kuby Janis, O. B. (2014). KUBY. INMUNOLOGÍA. Mexico: McGraw-Hill tercera

edición.
Murphy, K., Travers, P., & Walport, M. (2009). Inmunobiología de Janeway.

MÉXICO: McGRAW-HILL séptima edición.
Peña Meñano, E. (2017). Laboratorio De Inmunología. Obtenido de

https://es.scribd.com/presentation/474761488/lab-inmuno-prof-ludys
Torras Rabasa, A. (1974). Contribución a la fluorescencia al estudio de las

nefropatías glomerulares. Obtenido de http://hdl.handle.net/10803/2317
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Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Martes A

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INTRODUCCIÓN
La quimioluminiscencia es la propiedad de algunas sustancias químicas para emitir

luz. Estas sustancias son, por ejemplo, las que se emplean para los números de los relojes
que brillan en la oscuridad, o las que de forma natural tienen algunos animales, como las
luciérnagas. También tienen su aplicación en la medicina.
Generalmente se emplean para detectar la existencia de sustancias químicas en las

biopsias de tejidos. Si, por ejemplo, queremos saber si un fragmento de hígado tiene una
proteína que caracteriza al cáncer, se baña la muestra con un anticuerpo que se pega a esa
proteína. El anticuerpo va combinado con una sustancia quimioluminiscente. Se examina el
espécimen al microscopio y, si se aprecia que brilla con luz propia, es que contiene la
proteína.
Esta propiedad aplicada a métodos analíticos en el laboratorio clínico, brinda

numerosas ventajas, la más relevante a destacar es su gran especificidad seguida de la rapidez
al momento de dar resultados, esto comparado con procedimientos como ELISA.
Por otra parte, la electroquimioluminiscencia, se vale de transferencias de electrones

que forman estados excitados que emiten luz.
Ambas definiciones pueden llegar a confundirse o mal interpretarse por sus

características comunes. Sin embargo, con el propósito de identificar con exactitud las
diferencias entre ellas, su utilidad y aplicación en el laboratorio clínico, desarrollamos el
siguiente material.
55
1.- Fotón
Partícula mínima de energía luminosa o de otra energía electromagnética que se
produce, se transmite y se absorbe. "la luz es energía que se transmite por medio de fotones
en forma de onda electromagnética"
2.- Electrón
Un electrón es una partícula con carga eléctrica negativa. Los electrones forman la
corteza exterior “reactiva” de los átomos que interacciona con otros y forman los vínculos
químicos que mantienen a las moléculas unidas. El flujo de electrones entre dos puntos
genera corriente eléctrica.
3.- Luminiscencia
La luminiscencia es un proceso de emisión de luz por un elemento cuyo origen no
radica exclusivamente en las altas temperaturas, es una forma de “luz fría” en la que la
emisión de esa luz es provocada en condiciones de temperatura ambiente.
Existen diversas variedades de luminiscencia en función de la energía responsable del
fenómeno:
➢ Triboluminiscencia, un resultado de una acción mecánica sobre un sólido.
➢ Fotoluminiscencia, un resultado de la absorción de fotones.
➢ Fluorescencia es un tipo de fotoluminiscencia, en el que los fotones emitidos son de

menor energía que los absorbidos.
➢ Fosforescencia, es una fluorescencia ligeramente retardada después de la absorción

inicial de radiación (en una escala de segundos a horas).
➢ Radioluminiscencia, es resultado del bombardeo a una sustancia con radiaciones

ionizantes.
➢ Sonoluminiscencia, resultado de la implosión de las burbujas en un líquido cuando
es excitado por el sonido
56
➢ Electroquimioluminiscencia, es resultado de una reacción electroquímica.
➢ Electroluminiscencia, es resultado de una corriente eléctrica que pasa a través de

una sustancia.
➢ Quimioluminiscencia, que es resultado de una reacción química. Una variedad de

este fenómeno la constituye la Bioluminiscencia producida por reacciones químicas
de origen biológico, siendo uno de los casos más conocidos la luz producida por las
luciérnagas o por los peces de ambientes hipoabisales.
4. Fotomultiplicador
Un foto detector, detecta los fotones de luz emitida y los convierte en pulsos
eléctricos. Los sistemas cuentan estos pulsos eléctricos, leen y los resultados son comparados
en una curva madre definida para cada ensayo, finalmente el sistema emite su cálculo de la
concentración del analito determinado.
57
QUIMIOLUMINISCENCIA
La quimioluminiscencia es un fenómeno que se produce cuando, en una reacción
química, los electrones saltan de las capas más altas de los átomos a las más bajas.
Se entiende, además, que la quimioluminiscencia es la propiedad que tienen algunas

sustancias químicas para emitir luz. Además, tienen su aplicación en la medicina, en esta
área por lo general se emplean para detectar la existencia de sustancias químicas en las
biopsias de tejidos.
En el laboratorio clínico los sistemas que llevan a cabo esta reacción fueron
especialmente diseñados para realizar inmunoensayos con tecnología automatizada de
vanguardia como lo es la quimiolumiscencia, método de lectura con mayor sensibilidad
que ELISA, basándose en el principio de emisión de energía luminosa a través de una
reacción química (Enzima – Sustrato).
Este fenómeno acompaña a algunas reacciones químicas y bioquímicas que sucede

porque un electrón que estaba en un nivel superior baja a un nivel inferior; al bajar necesita
menos energía para poder dar una vuelta alrededor del núcleo por lo que libera la energía
sobrante en forma de fotones que al ser libres producen luz. Un fotón es una partícula
elemental que, de acuerdo a los principios de la física cuántica, compone la luz. Como todas
las partículas elementales.
58
Fig. 1 Se expresa esquemáticamente las diferencias entre fluorescencia y quimiolu-

miniscencia, dos tipos de luminiscencia frecuentemente confundidos en la literatura. Su dife-
rencia radica en la fuente de energía empleada para colocar la molécula en estado de exci-
tación electrónica. Así, mientras en la fluorescencia es una fuente externa de radiación ele-
ctromagnética (luz de excitación) la que transfiere la molécula fluorescente (A) de su estado
'basal' a excitado (A), en la quimioluminiscencia es la energía de la reacción oxidativa de la
propia molécula (A) la que transfiere el producto de la reacción (B) a su estado excitado
(B"').
FUNDAMENTO: En presencia de antígeno y anticuerpo complementarios, el paratopo

del anticuerpo se une al epítopo del antígeno para formar un antígeno-anticuerpo o un
complejo inmune. La estimación de los niveles de dicho complejo inmune mediante el uso
de anticuerpos marcados forma la base de CLIA. Implica el uso de partículas sólidas
estacionarias recubiertas con el antígeno o el anticuerpo de interés. Después de la
incubación, que asegura la formación de complejos inmunes intactos, se agrega el
sustrato. Esto da como resultado la generación de luz, cuya intensidad es directamente
proporcional a la cantidad de complejos marcados presentes y que ayuda indirectamente en
la cuantificación del analito de interés. La intensidad de la luz se mide en términos de
Unidades Relativas de Luz (RLU). La quimioluminiscencia emite luz en estado basal.
CLIA DIRECTO
En una reacción directa, dos reactivos, normalmente un substrato y un oxidante que,
en presencia de algunos cofactores, reaccionan para formar un producto o intermedio de la
reacción, algunas veces en presencia de un catalizador. Después, parte del producto o
intermedio pasa a un estado electrónicamente excitado, que puede a continuación relajarse
hasta el estado fundamental con emisión de un fotón.
Un ejemplo típico de este tipo de reactivo de quimioluminiscencia directa es el

luminol, que se ha utilizado durante muchos años para identificar sangre. La figura 2 muestra
la reacción de quimioluminiscencia provocada por el luminol. Cuando está en presencia de
un catalizador metálico, el luminol emite una luz azul (425 nm) en respuesta a una fuerte
59
alcalinidad, agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y calor. La reacción de

luminol se puede utilizar en HPLC para analizar peróxidos (peróxidos de lípidos, etc.) y
materiales que contienen metales.

Fig.2 Reacción de quimioluminiscencia causada por luminol
CLIA INDIRECTO
La quimioluminiscencia indirecta o sensibilizada se basa en un proceso de
transferencia de energía de la especie excitada a un fluoróforo. En el caso de moléculas que
no pueden emitir directamente quimioluminiscencia, este proceso permite transferir su
exceso de energía a un fluoróforo que a su vez es excitado, volviendo a su estado
fundamental con la emisión de un fotón. Todas estas etapas dan lugar a una gran variedad
de aplicaciones prácticas de la QL en la fase sólida, líquida y gaseosa.
Fig.3 Reacción de quimioluminiscencia entre un diéster de ácido oxálico (TCPO) y

peróxido de hidrógeno
60
Un ejemplo típico de este tipo de reactivo de quimioluminiscencia indirecta es la

combinación de un diéster de ácido oxálico y peróxido de hidrógeno. La Fig. 3 muestra la
reacción de quimioluminiscencia provocada por el ácido oxálico bis (2,4,6-triclorofenil)
(TCPO). En esta reacción, el intermedio activo (1,2-dioxetanediona) producido por la
reacción entre el TCPO y el peróxido de hidrógeno entrega energía de excitación al material
luminiscente cuando se descompone en dióxido de carbono.
Cuando el analito no es un material luminiscente, este método se utiliza para

convertirlo en un derivado luminiscente. Por ejemplo, cuando el analito es un ácido amino
dansilado, el método de quimioluminiscencia indirecta permite la detección a ultra-altas
sensibilidades del orden de femtomoles (10 -15 moles) o varios cientos de attomoles (10 -18
mol).
Marcadores quimioliminiscentes
✓ Luminol.
✓ Éster de acridinio
✓ Hidróxido de sodio
Ventajas de la quimiluminiscencia
✓ Alta sensibilidad.
✓ No emplea radioactividad.
✓ Los resultados son rápidos.
✓ Los equipos son automatizados.
Aplicaciones: Hormonas: insulina, tiroxina, estradiol, testosterona, progesterona,

Vitamina: vit B12, Marcadores tumorales: proteína morfogénica ósea-2, antígeno
carcinoembrionario (CEA), alfa fetoproteína (AFP), Gonadotropina coriónica beta humana,
Factor de necrosis tumoral, C3 y C4 del complemento.
ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA
La electroquimioluminiscencia (ECL) es el proceso en el que las especies se generan
en los electrodos.sufren reacciones de transferencia de electrones para formar estados
excitados que emiten luz. La electroquimioluminiscencia es un medio de convertir la
61
energía eléctrica en luz (energía radiativa). Implica la producción de intermedios reactivos a

partir de precursores estables en la superficie de un electrodo.
➢ Ensayo tipo competitivo: para analitos extremadamente pequeños.

➢ Ensayo tipo sándwich: para analitos más grandes.
➢ Ensayo formación de puentes: para detectar anticuerpos en la muestra.
APLICACIÓN DE CADA ENSAYO

Ensayo competitivo: Este principio se aplica a analitos de bajo peso molecular.
1. La muestra del paciente se combinan en una cubeta de ensayo con un anticuerpo
específico marcado con un complejo de rutenio.
2. Se incuba la muestra
3. Tras la primera incubación, se añaden micropartículas paramagnéticas recubiertas de

estreptavidina. Los sitios de unión aún libres del anticuerpo marcado se ocupan así
formándose un complejo anticuerpo-hapteno. Todo el complejo se une a las micropartículas
mediante la interacción de la biotina y la estreptavidina.
4. Se encuba nuevamente la muestra.
5. Tras la segunda incubación, la mezcla de reacción que contiene los complejos

inmunes se transporta hasta la célula de medición. Los complejos inmunes quedan atrapados
magnéticamente sobre el electrodo de trabajo, mientras que el reactivo y la muestra libres se
eliminan con ProCell.
6. En la reacción de ECL, el conjugado es un derivado basado en rutenio y la reacción

quimioluminiscente se estimula eléctricamente para producir luz. La cantidad de luz
producida es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra del
paciente.
7. La evaluación y el cálculo de la concentración de antígeno se realiza mediante una

curva de calibración creada a partir de estándares con concentraciones de antígeno
conocidas.
62
Ensayo tipo sándwich: Este principio se aplica a analitos con mayor peso molecular:
1. La muestra del paciente se combina con un reactivo que contiene anticuerpo
biotinilado y un anticuerpo específico marcado con rutenio.
2. Se incuba 9 minutos, la muestra.
3. Se añaden micropartículas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina. Durante una

segunda incubación de 9 minutos, el anticuerpo biotinilado se adhiere a la superficie
recubierta de estreptavidina de las micropartículas.
4. Esta mezcla de reacción que contiene los complejos inmunes se transporta hasta la
célula de medición. Los complejos inmunes quedan atrapados magnéticamente sobre el
electrodo de trabajo, mientras que el reactivo y la muestra libres se eliminan con la solución
de limpieza ProCell

producida es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la muestra.
6. La evaluación y el cálculo de la concentración del antígeno o analito se realiza

mediante una curva de calibración creada a partir de estándares con concentraciones de
antígeno conocidas.
63
Ensayo formación de puente: El principio de formación de puentes es similar al principio

de tipo sándwich, con la diferencia de que el ensayo está diseñado para detectar anticuerpos
(por ejemplo, IgG, IgM e IgA) y no antígenos. Esto se logra incluyendo antígenos
biotinilados y marcados con rutenio en los reactivos por los que el anticuerpo que se presente
analizar presenta afinidad.
1. En el primer paso, los anticuerpos séricos se unen a los antígenos biotinilados y

marcados con rutenio para formar un complejo inmune.
2. Se incuba 9 minutos, la muestra.
3. Se añaden micropartículas recubiertas de estreptavidina a través del antígeno

biotinilado.
4. Tras la segunda incubación, la mezcla de reacción que contiene los complejos

inmunes se transporta hasta la célula de medición; los complejos inmunes quedan atrapados
magnéticamente sobre el electrodo de trabajo, mientras que el reactivo y la muestra libres se
eliminan con la solución de limpieza ProCell.

producida es directamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra.
6. La evaluación y el cálculo de la concentración del anticuerpo se realiza mediante una

64
curva de calibración creada a partir de estándares con concentraciones de anticuerpo cono-

cidas.
Marcadores de electroquimluniniscencia
 Complejo de rutenio
 Tripopilamina
Ventajas Desventajas
✓ Mayor sensibilidad ✓ Mas difíciles de automatizar
✓ Su señal se amplifica mas ✓ Consideran mayor tiempo de análisis
✓ No consume su marcador
✓ No cuenta con ningún nivel de peligro
✓ Son lineales en un amplio espectro
Aplicaciones
En diagnóstico clínico se usa especialmente determinar:
✓ Detección de hormonas tiroideas: T4, T3 y TSH.
✓ Determinación de testosterona total, gonadotropina coriónica humana, hormona

luteinizante y prolactina.
✓ Diagnóstico de anemia: vitamina B12, ferritina, ácido fólico.
✓ Búsqueda de IgG en: TORCH y hepatitis.
✓ Búsqueda de antígeno viral: Ag p24 del VIH-1 y VIH-2.

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CONCLUSIÓN
La diferencia entre la quimioluminiscencia y la electroquimioluminiscencia, radica
en el origen de esa emisión de luz que ambas producen. Para la primera (CLIA), la emisión
se da durante una reacción química, en estado basal. Para la segunda (ECLIA), la emisión se
da por la misma quimioluminiscencia, aunque esta vez es inducida por un estímulo
electroquímico, en estado excitado.
Ahora, sea uno o el otro, los distintos e innumerables métodos aplicados en el

laboratorio clínico buscan en resumidas cuentas lo mismo: resultados confiables.
La precisión de este tipo de determinaciones es fundamental no solo para el

diagnóstico de un paciente, si no para el desarrollo mismo de nuevos métodos que
contribuyan a un mejor entendimiento y tratamiento de las diferentes patologías que se
estudian hoy día y se estudiarán con el pasar de los años.
66
REFERENCIAS BIBILIOGRAFICAS
Andrés Poeylaut. (07 de diciembre de 2014), Generación de quimioluminiscencia.

NotiWiener Digital. Recuperado de: https://notiwiener.net/2014/12/generacion-de-
quimioluminiscencia/
Canal, Guisell Hernández. (27 de marzo de 2019), Técnica de Inmunoensayo:

Quimioluminiscencia. [Archivo de Vídeo]. Youtube. Recuperado de:
https://youtu.be/MXP5rKkLPI8
Canal, Natalia Quiroga. (29 de junio de 2019), Electroquimioluminiscencia [Archivo

de Vídeo]. Youtube. Recuperado de: https://youtu.be/z9kgFT_LR7w
CCLABGroup. (27 de noviembre de 2020), Quimioluminiscencia - CLIA. Recuperado

de: http://www.cclabgroup.com/quimioluminiscencia-clia/
Electrochemiluminescence. (01 de enero de 2020), En Wikipedia. Recuperado de de:

https://en.m.wikipedia.org/wiki/Electrochemiluminescence
67
Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Martes B

68
INTRODUCCIÓN
En su esencia la citometría de flujo representa un proceso en el que células u otras
partículas biológicas inc1uídas en un flujo de líquido isotónico son empujadas a pasar,
alineadas y de una en una, por delante de uno o varios detectores capaces de recoger y medir
diferentes características físicas y/o químicas de esas células o partículas, a la vez que son
iluminadas por un haz de luz, habitualmente un láser. En términos generales, las caracte-
rísticas celulares analizadas mediante esta tecnología son el reflejo de dos grandes grupos de
parámetros: por un lado, los derivados de la luz que al incidir sobre la célula o partícula es
dispersada y que se relacionan entre otras características con el tamaño y la granularidad ce-
lulares y, por otra parte los que se asocian con la luz generada como consecuencia de la pre-
sencia en la célula de fluorocromos, bien de forma natural (auto fluorescencia) o unidos a
ella artificialmente.
Desde su aparición, la citometría de flujo ha sufrido un importante desarrollo debido

en gran medida a que por su carácter multidisciplinario se ha beneficiado de los avances ocu-
rridos en los últimos años en campos diversos como la informática, la producción de
anticuer-pos monoc1onales, la química de los fluorocromos, los procedimientos de tinción
citoquí-mica, la electrónica, la óptica y la tecnología láser. Todo ello unido a su progresiva
utilización en el análisis automático y separación de células ha abierto nuevas perspectivas
en el campo del diagnóstico clínico y la investigación biomédica. Así, esta tecnología en un
principio sofisticada y restringida a laboratorios de investigación básica ha pasado a estar
presente en los últimos años en la rutina de muchos laboratorios clínicos.
Dado que la citometría está naturalmente preparada para estudiar partículas en suspen-
sión en un medio líquido, tejidos humanos como la sangre, la médula ósea, el líquido cefalo-
rraquídeo, o producidos en procesos patológicos (derrame pleural, derrame sinovial) o en el
curso de técnicas diagnósticas (lavado broncoalveolar, por ejemplo), son muestras biológicas
especialmente preparadas para la aplicación de técnicas de citometría de flujo. No es de
extrañar pues que las especialidades de Hematología y de Inmunología sean las que han con-
templado mayor aplicación de esta tecnología en sus actividades rutinarias de diagnóstico y
seguimiento de los pacientes.
69
1. ¿Qué información de las células se puede obtener usando citometría de
flujo?: Se pueden obtener numerosas características físicas y químicas de células mediante
citometría de flujo.
2. ¿Por qué es importante conocer la fuente excitadora de luz que tiene un

citómetro?: Es importante conocer este dato porque al utilizar fuentes excitadoras diferen-
tes, la emisión será distinta, variable. Una célula debe de ser excitada para que emita fluores-
cencia siempre en una longitud de onda mayor que la excitadora, por tanto, depende de cada
fuente excitadora, la fluorescencia que se emite.
3. Indique las dos principales características en las que se basa un citómetro

de flujo para evaluar los parámetros (características de las células): Se basa en el tamaño
celular y complejidad o granulosidad celular.
4. Indique en qué consiste la separación de células o “cell sorting” por

citometría de flujo. Explique cuál es el fundamento básico para llevar a cabo la separa-
ción de células: La corriente de líquido se rompe en gotas usando un mecanismo de vibra-
ción, donde cada gota contiene una célula. La célula ha pasado previamente por el láser de
modo que cuando se forme la gota un mecanismo pueda marcar la gota (mediante carga elé-
ctrica) para su posterior clasificación.
5. ¿Con qué propósito se lleva a cabo la separación de células? y Mencione los

factores implicados en la eficiencia de la separación de células: Con el objetivo de poder
estudiar la biología, morfología y bioquímica celular. Se hace el estudio siempre en base a
un mismo parámetro, la diferencia de cargas. Las diversas técnicas de separación se basan
en las diferencias existentes entre los distintos tipos celulares como, por ejemplo:
➢ El tamaño y la densidad de las células.

➢ La afinidad de anticuerpos hacia determinados epítopos de la superficie celular.
➢ La dispersión de luz.
➢ La emisión de fluorescencia.
➢ El tamaño del diámetro capilar del flujo interno.
70
➢ La frecuencia relativa de la célula (condiciona su marcaje).

➢ La composición diferencial de la membrana celular (heterogeneidad) Con frecuencia,
para conseguir una separación eficaz es necesario utilizar dos o más métodos.
6. Explique cuáles son los parámetros utilizados para determinar la viabi-

lidad celular. Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o par-
tículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de:
➢ Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes, reductoras.
➢ Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas.
➢ Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos.
➢ Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares.
71
Citometría de Flujo
➢ Definiciones:
❖ La Citometría: Es el análisis de las características de células ya sea mediante
inspección al microscopio, o midiendo de manera automatizada propiedades particulares de
las células.
❖ Citometría De Flujo: Es una tecnología que permite analizar y cuantificar de

manera simultánea múltiples características celulares a medida que son transportadas en
un fluido e incidadas por un haz de luz. El citómetro de flujo mide el tamaño y la granu-
laridad de la célula, así como la fluorescencia relativa de la misma. Estas características se
determinan usando un sistema óptico acoplado a un procedimiento electrónico que graba
la manera en que la célula dispersa el haz de luz y emite fluorescencia. Una suspensión de
células es inyectada en un líquido capaz de ordenar el flujo de células de manera individual
y a gran velocidad. Dicho flujo pasa por un punto en el que incide la luz de al menos un
láser, aunque los citómetros actuales cuentan generalmente con 2 o más fuentes de luz.
Células en una
Almacenadas para
sola fila pasan en Digitalizadas y
su análiis
una corriente de computarizadas
posterior
flujo
Son alcanzadas Son convertidas

por el rayo de un en señales
láser electrónicas
Estas señales son

Se generan percibidas por
señales ópticas defectos
especifícos
72
❖ Citometría de Inmunofluorescencia: El objetivo del análisis por inmunofluores-

cencia en citometría de flujo es asignar a cada célula a un grupo específico de células que
compartan propiedades comunes. El primer paso es identificar las células de interés. Se
utiliza para analizar las propiedades fisiológicas y químicas de las células. También se puede
utilizar para analizar otras partículas biológicas en analizadores de orina. Básicamente pro-
porciona información sobre: Tamaño y la estructura de las células.
❖ Citómetro De Flujo: Es una técnica de avanzada, altamente sensible y automatiza-

da, que se emplea para el inmunofenotipaje de las células normales y leucémicas.
❖ Citograma: Representación gráfica de un número de células que se midieron en el

microscopio.
➢ Componentes de un Citómetro de Flujo: Para que el citómetro pueda medir diferen-

tes características de las células, está compuesto por tres grandes sistemas, cada uno de estos
sistemas tiene una función específica. Además, cada sistema tiene diversos componentes.
73
❖ Sistema de fluidos: Su principal función es alinear y transportar a las células dentro

de una cámara de flujo hacia el haz de luz; por tanto, es necesario que la muestra se encuentre
suspendida en un fluido. Para lograrlo, se aplica una propiedad hidrodinámica, que consiste
en la inyección de la muestra en el centro de una corriente de fluido envolvente, el cual puede
ser agua o un buffer de fosfatos. Lo anterior se logra porque la presión de la muestra es ma-
yor que la presión del líquido envolvente. Gracias a este sistema, las células pueden ser ali-
neadas en “fila india”, y de esta manera se asegura que el haz de luz incida sobre una célu-
la a la vez.
❖ Sistema óptico: El sistema óptico está compuesto por láseres y filtros, que se en-
cargan de iluminar a las células y dirigir las señales resultantes hacia los detectores apro-
piados. Las células, al ser incididas por el láser, tendrán la capacidad de dispersar la luz de
acuerdo con su tamaño y su granularidad. Gracias a este sistema, se puede conocer el tamaño
y la granularidad de la célula, así como las proteínas que se expresan (marcadores), permiti-
endo así la identificación de diferentes tipos celulares. A medida que el citómetro posea más
detectores, mayor será su capacidad para identificar poblaciones celulares.
Identificación de leucocitos de sangre periférica de acuerdo con su tamaño y granula-

ridad. Los linfocitos son células pequeñas y poco granulares por lo que se representan cer-
ca del origen; le siguen los monocitos con un tamaño y granularidad mayor y finalmente,
los granulocitos, que son las células de mayor tamaño y complejidad.
74
❖ El sistema electrónico: Consta de sensores luminosos como fotodiodos y fotomul-

tiplicadores, que tienen la finalidad de convertir los fotones en electrones y éstos, a su vez,
en corriente eléctrica. De este modo, la señal eléctrica es recibida por la computadora y tradu-
cida en gráficos e histogramas. Una vez que la señal luminosa es generada cuando el haz de
luz incide en la célula, ésta debe traducirse en señales electrónicas.
Dispersión de luz. La imagen representa la dispersión de la luz emitida una vez que
el haz de luz incidió sobre la membrana celular. La desviación frontal de la luz deter-
mina el tamaño celular (FSC) mientras que la dispersión lateral determina la com-
plejidad (SSC).
En el siguiente cuadro se anotan estos tres sistemas y su función general.
Sistema Función Componentes Generales
Fluidos Introducir y alinear a las Tubo de inyección de la muestra. Cámara

células para ser medidas de flujo
Óptica de excitación → (Laser, pueden
ser varios).
Generar y colectar las Emisores laser: Helio – Neón (atuarico) o
Ópticos Helio – cadnio (molecular).
señales luminosas
Óptica de adquisición → (Lentes, espe-
jos, filtros y detectores)
Convertir las señales
ópticas a señales
Electrónicos Sensores sensibles/luz fotodiodos y
electrónicas proporcio-
fotomultiplicadores
nales y digitalizadas para
análisis en computadora
✓ Fotomultiplicadores y convertidores analógicos digitales: Detectan y convi-

erten las señales luminosas en impulsos eléctricos y estos en señales digitales.
75
✓ Ordenador: Para adquisición, almacenamiento y análisis de los datos en tiempo

real o en modo de matriz de datos.
➢ Utilidad: la citometría de flujo en la práctica médica se relaciona con la hematología

e inmunología clínicas, midiendo parámetros como número y clasificación de células
sanguíneas. Esta técnica es empleada también en el conteo de subpoblaciones de linfocitos
en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de
leucemias agudas y síndromes linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos.
Por tratarse de una técnica de identificación y cuantificación específica de células, la

citometría de flujo facilita el diagnóstico o seguimiento de patologías como leucemias, linfo-
ma, inmunodeficiencia primaria, monitoreo del estado hematológico de pacientes con infe-
cción de VIH, así como la detección de células cancerosas o tumorales. Adicionalmente, esta
herramienta permite analizar funciones celulares como la proliferación, la fagocitosis y la
apoptosis, por mencionar algunas. Lo anterior es posible gracias a que en el mercado existen
diversas moléculas fluorescentes que se incorporan cuando las células realizan este tipo de
funciones.
Es importante señalar que la citometría no se limita al estudio de células, pues por me-
dio de esta técnica también se puede conocer la cantidad de ARN o ADN que posee una cé-
lula, lo cual tiene una alta aplicación en el pronóstico de diversos tipos de cáncer. Actual-
mente, la citometría de flujo es una poderosa herramienta para el diagnóstico, clasificación
y determinación del pronóstico de diversas enfermedades; no obstante, es imprescindible
vincular la investigación biomédica con la investigación clínica, y de esta manera, fortalecer
la caracterización de nuevas poblaciones celulares que se encuentren implicadas en el desa-
rrollo de estas patologías.
➢ Parámetros Que Se Pueden Analizar Por Citometría De Flujo: La citometría de

flujo permite medir diferentes parámetros de una célula.
❖ Parámetros nucleares. ❖ Parámetros extracelulares.
❖ Parámetros citoplásmicos.
❖ Parámetros de superficie.
76
77
➢ Ensayos funcionales celulares: colorantes y reactivos: Analice simultáneamente

múltiples proteínas, expresión génica y funciones celulares como oxidación, viabilidad, ciclo
celular, apoptosis y proliferación de una célula individual con ensayos de citometría de flujo
fluorescente, reactivos y anticuerpos. Esta tecnología permite obtener una cantidad de datos
estadísticamente relevante al combinar información de celdas individuales para obtener
información sobre una muestra heterogénea. Ofrecemos reactivos y ensayos de citometría
de flujo que abarcan una amplia gama de aplicaciones y áreas de investigación, que incluyen
ensayos de función y salud celular, así como ensayos de detección de ARN.
❖ Ensayos de citometría de flujo y selección de reactivos

✓ Ensayos de viabilidad celular: Distinguir las células muertas y eliminar los
artefactos en su ensayo es un paso fundamental para ayudar
a garantizar resultados precisos.
• Ensayos de viabilidad fijables.
• Ensayos de viabilidad no reparables.
• Ensayos de viabilidad y vitalidad bacteriana.
• Ensayos de viabilidad y vitalidad de levadura.
✓ Ensayos de ARN: Detección simultánea

de ARN y proteínas mediante citometría de flujo utiliza
ensayo de ARN PrimeFlow.
• El ensayo PrimeFlow RNA Combine
el ensayo.
✓ Ensayos de proliferación celular: La medi-

ción de la proliferación celular es un método fundamental
para evaluar la salud celular y la división celular.
• Ensayos de medición de síntesis de ADN
• Ensayos de dilución de tinte para la prolife-
ración celular
78
✓ Ensayos de ciclo celular: Ofrecemos una serie de rea-

ctivos fluorescentes diseñados para un análisis preciso del ciclo ce-
lular en poblaciones de células vivas o fijas. Ensayos de ciclo celular
vivo.
• Ensayos de ciclo celular fijo.
✓ Ensayos de metabolismo y estrés oxidativo:

Mida el estrés oxidativo generalizado en células con sondas
fluorogénicas, utilizando microscopía de fluorescencia con-
vencional, detección de alto contenido, fluorometría de mi-
croplacas o citometría de flujo.
• Ensayos de estrés oxidativo de células vivas
para citometría de flujo.
• Sondas generales de estrés oxidativo.
✓ Ensayos de microbiología: Evalúe los procesos me-

tabólicos clave y controle el crecimiento, la proliferación y la vita-
lidad de bacterias/levaduras.
• Ensayos de recuento y enumeración de bacterias
• Ensayos de viabilidad y vitalidad bacteriana
• Ensayos de viabilidad y vitalidad de levadura
✓ Senectud: Detección fluorescente de hidrólisis de

β-galactosidasa por citometría de flujo.
• Kit de detección Cell Event Senescence Green
✓ Ensayos de apoptosis: Las cascadas de muerte celular

son complejas y dinámicas, lo que subraya la importancia de un enfo-
que multiparamétrico para la detección de apoptosis.
79
• Ensayos de membrana plasmática, tinción de anexina V.

• Ensayos de función de las mitocondrias.
• Ensayos JC-1
• Ensayos de caspasa.
• Ensayos de apoptosis nuclear.
➢ Aplicaciones Clínicas De La Citometría De Flujo – Inmunofenotipificación: La

disponibilidad de amplios paneles de reactivos de gran calidad facilita la aplicación de este
método analítico en el diagnóstico, clasificación, evaluación pronóstica y valoración de en-
fermedad mínima residual. La citometría de flujo permite el análisis de un gran número de
células (habitualmente entre 10,000 células por muestra y, más de un millón en los estudios
de enfermedad mínima residual). La aplicación de la citometría de flujo al análisis celular
permite conocer aspectos físicos de la célula (tamaño y complejidad) y determinar la pres-
encia o ausencia de determinados antígenos (habitualmente entre 3 y 4) en los diferentes
compartimentos celulares (superficie celular, citoplasma, mitocondria y núcleo) lo que
contribuye a aumentar, tanto la especificidad como la sensibilidad de la prueba. En otras
áreas como en el diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiencias primarias, en el moni-
toreo de enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sisté-
mico y la artritis reumatoide, la citometría de flujo ha demostrado su utilidad. También se
ha demostrado útil en el
seguimiento de la recupe-
ración inmune tras el tras-
plante de médula ósea, en
la identificación precoz
del rechazo en pacientes
que han recibido un tras-
plante alogénico, o en el
monitoreo terapéutico de
los enfermos con anemia
aplásica.
80
En las siguientes tablas II y III se observan las diferentes aplicaciones clínicas gene-
rales de la citometría de flujo.
81
82
➢ Muestras para la Citometría de Flujo:

❖ Sangre total.
❖ Biopsias de ganglios linfáticos u otros tejidos: Las muestras de tejido deben man-
tenerse en medio de cultivo o en su defecto en suero fisiológico, nunca en formol. Tubos pa-
ra recolección de muestras- contienen medio de cultivo RPMI y son suministrados por el la-
boratorio. Conservar a temperatura ambiente hasta el momento de ser utilizados. Obtención
de la muestra – colocar la muestra inmediatamente luego de obtenida y asegurarse que él te-
jido quede completamente cubierto por el líquido. La muestra debe ser enviada a temperatura
ambiente para ser procesada dentro de las 24 hs de extraída. Es imprescindible, si la muestra
se va a obtener fuera de los horarios del laboratorio, comunicarse para realizar coordinación
previa.
❖ Aspirado de medula ósea.

❖ Líquido cefalorraquídeo: Se ha reportado que a partir de dos horas de extraída la
muestra de LCR, las células comienzan a morirse impidiendo una adecuada valoración de
las mismas. El conservante Transfix retrasa significativamente esta muerte celular. Tubos
para recolección de muestras- contienen anticoagulante EDTA. Conservar a temperatura am-
biente (18 - 24ºC) hasta el momento de ser utilizados. Obtención de la muestra - colocar el
LCR inmediatamente luego de obtenido y llegar hasta el enrase indicado en el tubo. Mezclar
manualmente por inversión unas 10 veces. Si la muestra es obtenida fuera del horario de la-
boratorio, conservarla a temperatura ambiente.
❖ Líquidos pleurales, ascitis, pericardio y PAAF (Biopsia con aspiración de

aguja fina): Deben ser enviadas al laboratorio inmediatamente luego de extraídas a tempera-
tura ambiente.
➢ Cuidados Requeridos para la Citometría de flujo: Tomar ciertas precauciones du-

rante la etapa preanalítica, para lograr que las células a estudiar se encuentren en condiciones
óptimas y para que se pueda obtener un resultado representativo de la muestra que se está
evaluando.
❖ Un mal acondicionamiento de las muestras remitidas puede causar un deterioro en

83
las mismas, imposibilitando el análisis u ocasionando variaciones en los valores relativos de

las distintas poblaciones celulares, impidiendo obtener un resultado de utilidad clínica. Los
métodos y períodos de conservación de muestras pueden variar en base al tipo de espécimen,
número y características de los componentes celulares y al estado del paciente en el momento
de su obtención. La calidad de los resultados es inversamente proporcional al tiempo transcu-
rrido desde la obtención del espécimen y al grado de manipulación sufrido por el mismo des-
de su obtención, siendo siempre recomendable el empleo de muestras frescas, recién obteni-
das.
❖ No es conveniente la realización del estudio en especímenes conservados durante

más de 48 horas desde su obtención. Incluso, hay ciertas muestras tales como líquido cefalo-
rraquídeo y punción/ biopsia de tejidos sólidos cuyo tiempo de conservación recomendado
es aún menor, en especial si contienen células susceptibles de entrar en apoptosis (por ejem-
plo, muestras de pacientes con linfomas no Hodgkinianos de alto grado, tipo linfoma de Bur-
kitt). En estos casos, el procesamiento del espécimen debe iniciarse lo antes posible. A conti-
nuación brindamos una serie de indicaciones útiles para la mejor conservación de materiales
para ser procesados en el laboratorio de Citometría de flujo:
✓ Muestras de sangre entera y médula ósea: mantener a temperatura ambiente

(15 - 25 ºC). Evitar temperaturas extremas que puedan causar muerte o lisis de poblaciones
celulares. A temperaturas ambiente elevadas, colocar el espécimen en un envase y poner éste
en el interior de otro recipiente que contenga refrigerante y material absorbente, evitando
que el refrigerante entre en contacto directo con las muestras. Este método ayuda a conservar
el espécimen a la temperatura indicada y evita la destrucción celular por frío excesivo.
✓ Las muestras de tejidos sólidos como ganglios, porciones de órganos o biopsias

por punción, se deben enviar en solución fisiológica en caso de que se remitan al laboratorio
en forma inmediata. De lo contrario lo ideal es conservarlas en medio RPMI 1640® + 5%
Albúmina Bovina y enviar refrigerados a 4 - 8 º C.
✓ Los líquidos de punción se deben remitir en forma inmediata refrigerados a 4 -

8ºC. Para líquido cefalorraquídeo se requiere especial cuidado ya que se trata de un medio
84
poco nutritivo para las células, por este motivo sugerimos que de no ser posible su envío
inmediato al laboratorio, se agreguen 3 gotas de albúmina bovina al 30% por cada mililitro
de líquido, y se transporte refrigerado lo más rápido posible.
✓ En caso que se requiera enviar también suero, se recomienda mantener refrige-

rado a 4 – 8 ºC y enviar en las mismas condiciones.
➢ Ventajas y Desventajas de la Citometría de Flujo:

❖ Ventajas e Inconvenientes de la Citometría de Flujo:
✓ Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números
de células individuales (miles).
✓ Aumento en la representatividad de las muestras estudia-

das y en la precisión de las medidas.
✓ A menor tiempo de dedicación mayor productividad.
❖ Desventajas de la Citometría de Flujo:

✓ Poca información morfológica de la célula.
✓ No proporciona información de la localización celular

en un tejido.
✓ La citometría de flujo no aporta información sobre la

distribución espacial de las células estudiadas.
TECNICAS DE LABORATORIO
➢ Fundamento: la Citometría de flujo se basa en medir características de cada elemento
particulado en suspensión (principalmente celular), cuando se le incide un rayo de luz. La
técnica necesita de un equipamiento sofisticado y relativamente complejo que combina un
sistema lumínico (rayo de luz de tipo láser y combinación de espejos, filtros y cristales que
llevan la señal luminosa hasta receptores fotomultiplicadores), un sistema fluídrico (las cé-
lulas en suspensión e individualizadas, es decir, sin que se agrupen, se llevan por un circuito
líquido a una cámara de flujo en la que se define un flujo laminar por el que una célula se
sitúa de manera precisa y estable frente al rayo lumínico) y un sistema electrónico/infor-
85
mático (recoge, maneja y permite representar y cuantificar todos los parámetros recogidos)
para la evaluación de los distintos parámetros lumínicos. La valoración de la fluorescencia
celular es un aspecto que introduce muchas otras posibilidades y por ello, aunque en sentido
estricto la metodología de la que hablaremos se debería denominar citofluorimetría de flujo,
ya que mide principalmente fluorescencia (y así se denomina en algunos libros y artículos),
reconociéndose que sin medida de la fluorescencia no existe citometría de flujo, habitual-
mente se usa el término más genérico de citometría de flujo.
➢ Marcadores: Fluorocromo, Rodamina, Fluoreceina, Naranja de acridina y verde de

calcio. Algunos fluorocromos utilizados para marcar anticuerpos en inmunofluorescencia y
citometría de flujo:
Fluorocromo Pico de Absorción Pico de Emisión
Fluoresceína 495 nm 520 nm
Tetrametilrodamina 543 nm 570 nm
Rojo Texas 596 nm 620 nm
Rojo Princeton 490 nm 579 nm
Ficoeritrina-R 495 y 564 nm 576 nm
Aloficocianina 650 nm 660 nm
Cumarina 357 nm 460 nm
➢ Procedimiento: El siguiente procedimiento permite el análisis de linfocitos sanguí-
neos utilizando anticuerpos fluorescentes contra distintos marcadores. Para los linfocitos T
totales, es usual utilizar un anticuerpo monoclonal anti-CD3. Las subpoblaciones de linfoci-
tos T cooperadores y T citotóxicos se evalúan con anticuerpos monoclonales anti-CD4 y
anti-CD8, respectivamente. Los linfocitos B son usualmente evaluados mediante el uso de
anti-CD19.
1. Obtener 10 ml de sangre anticoagulada y distribuirla en 5 tubos de 50 ml (2

ml/tubo).
2. Un tubo a la vez, agregar 45 ml de solución de lisis y mezclar de inmediato. Repetir

para los demás tubos.
3. Esperar 10 min a temperatura ambiente (para que los eritrocitos se lisen).

4. Centrifugar a 400 xg por 10 min a 4°C y decantar el sobrenadante.
86
5. Resuspender cada botón celular con 5 ml de solución SSB-BSA y combinar todo

en un solo tubo.
6. Centrifugar a 400 xg por 5 min a 4°C y decantar el sobrenadante.
7. Lavar las células con 25 ml de solución SSB-BSA y centrifugar como en el paso

anterior.
8. Ajustar la concentración de la suspensión a 5x10 6 células/ml y mantener sobre

hielo.
9. Colocar 100 μl de cada anticuerpo conjugado a utilizar (en la dilución previamente
optimizada) en un tubo sobre hielo. Correr en paralelo los siguientes controles: (a) 100 μl de
solución SSB-BSA, sin ningún anticuerpo; (b) 100 μl de algún anticuerpo conjugado de igual
isotipo que cada anticuerpo anterior, pero dirigido contra un epítopo irrelevante.
10. Colocar 100 μl de la suspensión de leucocitos en los tubos con los anticuerpos y
mezclar suavemente.
11. Incubar durante 30 min sobre hielo, protegiendo de la luz.
12. Agregar 1,5 ml de solución SSB-BSA a cada tubo y centrifugar a 400 xg por 5
min a 4°C. Decantar el sobrenadante y repetir este lavado.
13. Resuspender el botón celular en 450 μl de fijador de formalina-SSB-BSA y

mantener a 4°C protegido de la luz, hasta la aplicación en el citómetro, según las instruccio-
nes específicas de cada instrumento.
➢ Análisis de Resultados: Los resultados obtenidos pueden ser representados mediante

diferentes estilos, desde una gráfica de puntos hasta una figura tridimensional; la clave se
centra en seleccionar los gráficos que reflejen los resultados con precisión y sin generar
confusiones. A continuación, se describen las representaciones más utilizadas en esta área:
❖ Gráfico de puntos: Este gráfico muestra la relación entre dos marcadores diferen-
tes y muestra a cada punto como un evento (se define como evento a cualquier partícula que
haya sido excitada por el láser). Por tal motivo, el desplazamiento de los puntos hacia la
87
derecha indica la expresión de un marcador X, mientras que el desplazamiento de los puntos

hacia arriba, muestra la expresión de un marcador Y.
❖ Gráficos de densidad: Estos gráficos, además de representar a las poblaciones con

base en la expresión de dos marcadores, muestran la frecuencia relativa (densidad) de las
poblaciones; por ejemplo, las poblaciones con mayor número de eventos se representan
mediante tonos de gris más intenso (gráfico de zebra), mediante colores cercanos al naranja.
❖ Histogramas: Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un marcador

versus el número de eventos. El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor
expresión del marcador, mientras que la altura del pico
indica la frecuencia de las células capturadas. En este
sentido, es importante recalcar que el área bajo la curva
contiene a las células que se están analizando.
En el histograma se observan dos picos; el pico de

la derecha representa a las células positivas para el
marcador de linfocitos T cooperadores CD4, mientras
que el de la izquierda muestra las células negativas para
88
este marcador. Se observa que el pico de la derecha es más alto que el de la izquierda; por
tanto, existe un mayor número de linfocitos que expresan al marcador CD4 (T cooperado-
res), con respecto a aquellos que no lo expresan.
❖ Gráficos 3D: Este tipo de gráficos permite comparar a las poblaciones con respecto
a la expresión de tres marcadores diferentes y la frecuencia relativa. Los histogramas también
pueden ser representados en gráficos de 3D, lo que permite la comparación de la expresión
de dos marcadores diferentes versus el número de eventos.
Gráficos tridimensionales. A) Histograma tridimensional que identifica las poblacio-

nes de linfocitos T cooperadores y linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de
CD4 y CD8; la altura de los picos indica el número de células registradas. B) Dot plot
tridimensional que muestra a las poblaciones de linfocitos B (por exclusión), linfocitos T
Cooperadores y linfocitos T Citotóxicos, de acuerdo con la expresión de CD3, CD4 y CD8.
89
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
➢ Libros:
❖ Pérez J. (2018) Fundamentos de Citometría de flujo: Su aplicación diagnóstica en
la investigación biomédica y clínica. [version electrónica]. Revista Médica de la Universidad
Veracruzana. Vol.18, no. 2, julio-diciembre 2018.
❖ Cotez, E. Cervantes, E. Ortiz, A. Manual de practica de laboratorio citometria de

flujo [Archivo excel]. Casa abierta al tiempo Universidad Autónoma Metropolitana Unidad
Aiztapalapa.
❖ Robinson, P. (24 de Enero de 2018). Guía para el correcto acondicionamiento y

envío de muestras para Citometría de flujo. CIBIC LABORATORIOS. Recuperado el día
27 de Marzo de 2021 de Guía para el correcto acondicionamiento y envío de muestras para
Citometría de flujo - Cibic Laboratorios.
❖ Carey JL, McCoy JP, Keren DF. Flow cytometry in clinical diagnosis.
4thed.Chicago: ASCP Press; 2007 Van Dongen JJ, Lhermitte L, Bottcher S, Ameida J, van
der Velden VH, FloresMontero J, et al. Euro Flow antibodies panels for standardized n-
dimensional flow citometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant
leucocytes. Leukemia. 2012; 26:1908-75.
➢ Páginas Web:
❖ Cegarra, V. (2012). Comparación de tres métodos de medición de hemoglobina en
cirugía cardiaca. Recuperado de https://ddd.uab.cat/pub/trerecpro/2012/hdl_2072_20337
6/TR-CegarraSanmartin.pdf
❖ Alberto, O (2021). La citometría de flujo en el diagnóstico clínico. Recuperado de

https://core.ac.uk/download/pdf/61903411.pdf. Servicio General de Citometría de la
Universidad de Salamanca.
❖ Cerberuz, C. (2021). Citometria de flujo. slideshare. Recuperado 29 de marzo de

2021, de https://es.slideshare.net/CARlozCerbeRuz/citometria-de-flujo-41008816#:%7E:te
90
xt=DESVENTAJAS%20DE%20LA%20CITOMETRIA%20DE,Necesita%20suspensi%C
3%B3n%20de%20c%C3%A9lulas%20individuales%20.
❖ Perez, C. (2018). Fundamentos de Citometría de flujo: Su aplicación diagnóstica en

la investigación biomédica y clínica. Recuperado de https://www.medigraphic.com/pdfs/ver
acruzana/muv-2018/muv182d.pdf
❖ Otero, M. (2013-2014). Aplicaciones Clínicas De La Citometría De Flujo.

Recuperado de https://www.seqc.es/download/tema/4/2945/3022644/1494273/cms/tema-6-
aplicaciones -clinicas-de-la-citometria-de-flujo.pdf/
❖ Barberena, E. (2014). Manual de prácticas de laboratorio de Citometría de Flujo.

Recuperado de http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/MCF.pdf
❖ Orellana, R. M. (2012, 1 septiembre). Citometría de flujo: qué puede aportar al

diagnóstico hematológico en pediatría Anales de Pediatría Continuada. Elsevier.
https://www.elsevier.es/es-revista-anales-pediatria-continuada-51-articulo-citometria-flujo-
que-puede-aportar-S1696281812700999
❖ Flow Cytometry Assays and Reagents | Thermo Fisher Scientific - NL. (2021).
Thermofisher. Recuperado 30 de marzo de 2021, de https://www.thermofisher.com/nl/en
/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents.html
❖ Ramírez, B. L. M. (s. f.). Citometría De Flujo: Vínculo Entre La Investigación

Básica Y La Aplicación Clínica. Scielo. Recuperado 30 de marzo de 2021, de
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S018775852004000100007#:
%7E:text=La%20citometr%C3%ADa%20de%20flujo%20es%20una%20t%C3%A9cnica
%20que%20
❖ Garcia, L. (2021). Citometria de flujo - Inmunologia 1234. StuDocu. Recuperado

27 de marzo de 2021, de https://www.studocu.com/latam/document/universidad-central-del-
ecuador/inmunologia/resumenes/citometria-de-flujo/3847562/view
91
Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Viernes A

92
INTRODUCCIÓN
La inmunología se encarga de estudiar la forma en la que el organismo se defiende

de los patógenos con los que el ser humano entra en contacto a través del sistema
inmunitario, el cual abarca células y moléculas responsables de mantener la inmunidad.
Estos conocimientos acerca de que en el ser humano existen un conjunto de componentes
con funciones específicas que evitan que agentes extraños al organismo causen daño, se han
aprovechado en el laboratorio clínico para el diagnóstico de diversas enfermedades a través
de diversos métodos inmunológicos y técnicas específicas. En el presente trabajo se
desarrollará el tema de Enzimoinmunoanálisis (EIA) y Ensayo de Inmunoadsorción Ligado
a Enzimas (ELISA), que forman parte de técnicas basadas en la inmunología dentro del
laboratorio de bioanálisis.
La técnica de EIA, fue creada para reemplazar al Radioinmunoanálisis (RIA), porque

era una técnica invasiva y los reactivos que se utilizaban eran demasiado costosos. El EIA
puede ser homogéneo y heterogéneo. Patologías relacionadas con los pulmones, riñones, o
enfermedades autoinmunes, pueden ser determinadas mediante esta técnica. Luego con el
paso del tiempo se comienza a implementar en los laboratorios la técnica de ELISA, debido
a esas mejoras que se les fueron dando a las pruebas para mantener la especificidad y
sensibilidad de las técnicas protegiendo la salud de los analistas.
La técnica de ELISA es una técnica utilizada para medir anticuerpos, antígenos,

proteínas y glicoproteínas en muestras biológicas. Existen tres tipos, ELISA indirecto,
ELISA tipo sándwich y el ELISA competitivo, siendo los más utilizados el ELISA indirecto
y el ELISA tipo sándwich, a su vez s tiene una clasificación general que consiste en ELISA
competitivo y no competitivo. Algunas de las pruebas que se pueden realizar son la prueba
del VIH como prueba de tamizaje o screening, toxoplasmosis, carcinoma escamoso,
enfermedad de Lyme, entre otros. Además, las técnicas de ELISA pueden ser cualitativas y
cuantitativas; los primeros sólo indican la presencia o ausencia de inmunocomplejos y los
otros detectan cuánto hay de ellos.
Estas técnicas son parecidas lo que va a variar entre ellas son sus marcadores, los
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reveladores, el tipo de estructura donde se da la interacción de la muestra del paciente con

los componentes de cada una de esta técnica y las pruebas que se pueden hacer.
Con la llegada del Covid-19, las pruebas de ELISA han tomado gran importancia y
en diversos países, laboratorios han desarrollado nuevas técnicas que se fundamentan en el
ELISA, como es el caso de del Consejo Superior de investigaciones Científicas (CSIC), el
cual ha creado un test en formato kit de ELISA, que detecta anticuerpos y permiten saber si
el individuo ha estado en contacto con el virus y su sistema inmunitario ha tenido reacción
ante esto. Como esta organización, muchos otros laboratorios han desarrollado pruebas que
se basan en la técnica explicada, por lo cual su aplicación se ha desarrollado por la
importancia diagnostica que representa sobre todo en situaciones de pandemia como la que
se vive en la actualidad.
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CUESTIONARIO DIAGNÓSTICO
1.-En ELISA, en un método indirecto ¿Qué estará fijado en fase sólida y que se
determinará en la muestra del paciente?
Respuesta: Se tienen fijados antígenos en fase sólida y se van a determinar
anticuerpos en la muestra del paciente.
2.- ¿Que determinaciones se pueden hacer con ELISA?

Respuesta: De acuerdo a la investigación realizada las respuestas correctas deberán
estar relacionadas con:
 Investigación del cáncer: Las técnicas basadas ELISA están disponibles y son
utilizadas en el laboratorio clínico para probar los primeros tiempos de cánceres incluyendo
cáncer ovárico y de pecho.
 Prueba de droga: Las concentraciones de drogas ilícitas, tales como cannabinoides,

las anfetaminas, narcóticos, cocaína, benzodiacepinas, y metadona, pueden ser resueltas
usando ELISA en muestras de orina. El método se puede también utilizar para vigilar los
niveles de concentraciones farmacéuticas de la droga en los pacientes que experimentan
tratamiento.
 Prueba de embarazo: Para la detección de la Gonadotropina Coriónica Humana (h-

CG) en la orina.
 Determinación de anticuerpo de la plaqueta: La detección de los anticuerpos de la

plaqueta en suero se utiliza para determinar a los pacientes que sufren de desórdenes tales
como Púrpura Trombocitopénica Idiopática y Lupus Eritematoso Sistémico.
 Alergénicos de la comida: Descubrir la presencia de alergénicos para la etiqueta

legalmente requerida del ingrediente.
 Detección del VIH, Virus del Nilo del Oeste, Virus de la Enfermedad de Newcastle
(NDV), Toxoplasmosis, Sífilis, Enfermedad de Lyme, Carcinoma Escamoso, Anemia
Perniciosa, entre otros.
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3.-Mencione la clasificación del EIA y establezca diferencias entre ambos

Respuesta: EIA homogéneo y EIA heterogéneo
EIA homogéneo EIA heterogéneo
 Se utiliza fase solida
 Método competitivo (antígeno o
 Se hace en una fase liquida
anticuerpo) y no competitivo (indirectos
 Método competitivo
 No hay separación de facciones, lo que y doble anticuerpo)
causa interferencias.  Se requiere separación de las fases para
eliminar exceso de antígeno y
anticuerpo no unidos en reacción
4.-Mencione los métodos de EIA heterogéneo

Respuesta:
 Método competitivo (antígeno o anticuerpo)
 No competitivo (indirectos y doble anticuerpo)
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ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA)
Competencias a desarrollar
 Describe el Enzimoinmunoanálisis, variables y aplicación.

 Identifica los componentes del Enzimoinmunonálisis.
Sub-núcleos temáticos
 Definición, tipos (homogéneo y heterogéneo), métodos, procedimientos.

 Componentes: definirlos, utilidad, tipos y aplicación.
Definición
Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo
como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La diferencia consiste en
que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en vez de con un isótopo radiactivo. Se
puede marcar tanto el antígeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias).
La cuantificación se hace, por tanto, basándose en la medida de la actividad del enzima

marcador. Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se
añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un compuesto
coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda de un
espectrofotómetro. Esta medida de la actividad nos servirá para calcular la concentración de
la molécula problema. Al igual que en el caso del radioinmunoanálisis es necesario elaborar
una curva patrón.
Con objeto de aumentar la sensibilidad de este análisis es frecuente utilizar el sistema

biotina-streptavidina, que actúa como mecanismo multiplicador. Así, por ejemplo, el
anticuerpo está unido a varias moléculas de biotina (vitamina). Cada molécula de biotina se
une específicamente a varias moléculas de estreptavidina (similar a la avidina de huevo, pero
de origen bacteriano y mayor afinidad). El enzima está unido a la estreptavidina. De esta
forma se consigue un efecto multiplicador de la señal. (Ej. 3 moléculas de biotina por
anticuerpo x 4 moléculas de streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada molécula
de biotina= 12- enzima en vez de una).
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Principio
 El analito (Ag, Ac) se hace reaccionar con su contrario (Ac o Ag) marcado con una
enzima (conjugado)
 La concentración del complejo inmune formado y marcado con la enzima es

directamente proporcional a la concentración del componente
 El complejo formado se mide por medición de la actividad enzimática, eliminándose

previamente o no la enzima no asociada al complejo (EIA heterogéneo u homogéneo
respectivamente) y añadiendo un sustrato.
Tipos
Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos.
 Los ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las sustancias
reaccionantes antes de medir la actividad enzimática.
 Los ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los reaccionantes en las

fracciones libre y ligada antes de la determinación de la actividad del enzima marcador.
EIA homogéneo
No requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción
inmunológica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado con el
enzima.
Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la

marcada con el enzima.
 Cuando el antígeno marcado se

une al anticuerpo, este impide el acceso
del sustrato al centro activo de la enzima,
por lo que anula su actividad.
 A mayor concentración de la
molécula problema, menor cantidad de
antígeno marcado se unirá al anticuerpo,
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quedando mayor cantidad de antígeno marcado libre con el enzima activo dando una mayor
actividad.
Análisis de resultados: A mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar

las fracciones.
Método: Método competitivo
EIA heterogéneo
Requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción
inmunológica. En esta modalidad, los reactivos son el anticuerpo y el antígeno marcado con
el enzima.
Fundamento: El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo,

de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la muestra problema,
mayor cantidad de antígeno marcado con el enzima quedará sin unirse al anticuerpo. En este
caso la actividad del enzima no se anula por la unión antígeno-anticuerpo. Se separan los
complejos antígeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se añade el sustrato del enzima para
que se produzca la reacción enzimática y se mide su actividad.
Análisis de resultados: La actividad será inversamente proporcional a la cantidad de

antígeno en la muestra.
Método: Método competitivo y no competitivo

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EIA Homogéneo EIA Heterogéneo

 Se hace en una fase liquida  Nace de la modificación del homogéneo.
 Método competitivo  Se utiliza fase solida
 Unión Ag-Ac, modula actividad  Se requiere separación de las fases para
enzimática eliminar exceso de antígeno y anticuerpo
 No hay separación de fracciones, lo que no unidos a la reacción
causa interferencias.  Método competitivo (antígeno o
 Fue en primer método creado en los EIA anticuerpo) y no competitivo (indirectos
y doble anticuerpo)
Componentes
Marcadores/Enzimas
Método homogéneo: Malato deshidrogenasa, lisozimas, glucosa -6- fosfato
Método heterogéneo: Peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, glucosa
oxidasa.
Reveladores/sustrato
Revelador de color
Utilidad: Se agrega el sustrato y se observa la formación de color la cual indicara el
100
resultado de la reacción.
Fases sólidas/soporte
Fases solidas: Dependiendo de la casa comercial, nitrocelulosa (dientes peinecitos),
agarosa, celulasa.
Equipos
Espectrofotómetro: Permite la medida de la actividad enzimática del compuesto coloreado,
midiendo la cantidad de intensidad de luz absorbida al atravesar la muestra
Ejemplo de un procedimiento con sus componentes detallados

 Tampón de recubrimiento (coating). Carbonato 0.05 M; ph 9.6.
 PBS – BSA 1%.
 Tampón sustrato para fosfatasa alcalina: Dietanolamina 10%; ph: 9.8.
 Sustrato para fosfatasa alcalina: p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml)
 Tampón sustrato para peroxidasa: tampón citrato-fosfato ph 5.0: ácido cítrico x 1 H2O
21.0 g/l y fosfato disódico 28.4 g/l
 Sustrato para peroxidasa: ortofenilendiamina al 0,04%.
 Conjugado fosfatasa-alcalina o conjugado-peroxidasa (anti-inmunoglobulinas u otro).
Usar según dilución de trabajo (1/500 a 1/1500 o más).
 Solución de detención.
101
Procedimiento
 Para reactivos comerciales seguir indicaciones fabricantes.
 Para técnicas de laboratorio seguir los siguientes pasos:
1.-Cubrir los pocillos de las placas con antígeno o anticuerpo, según sea el caso, en una
concentración de 0.01 a 1 µg/ml/pozo en tampón de recubrimiento.
2.- Dejar 1 hora a 37°C y luego toda la noche a 4°C.
3.- Lavar 6 veces (3 minutos por vez) con PBS y dejar 1 hora con PBS-BSA 1% a
temperatura ambiente.
4.- Agregar 0.1 ml en cada pozo del anticuerpo o antígeno control, según sea el caso, en
diferentes concentraciones (5 diluciones) y las muestras a estudiar diluidas en PBS-BSA 1%.
5.- Incubar por 1 hora a 37°C.
6.- Lavar 6 veces con PBS.
7.- Agregar 0.1 ml a cada pozo del conjugado correspondiente diluido en PBS-BSA 1%.
8.- Incubar por 1 hora a 37°C o dejar toda la noche 4°C.
9.- Lavar 6 veces con PBS.
10.- Agregar 0.1 ml en cada pozo de la solución sustrato correspondiente.
11.- Dejar por 15 a 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
12.- Detener la reacción con 0.05 de NaOH 3 M o H2SO4 2.5 M, según corresponda.
13.- Leer a 405 nm para fosfatasa alcalina o 492 nm para peroxidasa.
14.- Graficar en papel log-log la densidad óptica versus concentración de anticuerpo o
antígeno control e interpretar las lecturas de la muestra.
Aplicaciones
 Apoyo diagnostico a enfermedades autoinmunes
 Diagnóstico de enfermedades infecciosas.
 Diagnóstico de enfermedades alérgicas.
 Estudio de marcadores tumorales.
 Cuantificación de proteínas circulantes de baja circulación.
 Niveles de drogas y de hormonas en el plasma.
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ENSAYO DE INMUNOABSORCION LIGADO A ENZIMAS (ELISA)
Competencias a desarrollar
 Describe el Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Enzimas, variables y aplicación
 Identifica los componentes del Ensayo de Inmunoadsorción ligado a enzimas.
 Aplica los métodos del Ensayo de Inmunoadsorción Ligado a Enzimas para la
identificación del antígeno o anticuerpo que puede estar causando un daño
inmunológico.
Sub-núcleos temáticos
 Definición, tipo, método indirecto, doble anticuerpo, competitivo y procedimientos:
Ventajas y desventajas del método, aplicaciones.
 Componentes: sustratos, enzimas, solución de parada, solución de lavado.
Definirlos, utilidad, tipos y aplicación
 Equipos: Utilidad
Definición
El ELISA es un EIA heterogéneo basado en el mismo principio que el RIA, es una técnica
biomolecular que utiliza la especificidad de un anticuerpo, así como la sensibilidad de los
análisis de enzima para descubrir y cuantificar las moléculas tales como hormonas, péptidos,
anticuerpos, y proteínas. Determina la concentración de antígenos o de anticuerpos,
mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución. Puede ser cualitativo o
cuantitativo.
Tipos y procedimientos
ELISA no competitivo
Las técnicas de ELISA no competitivas constituyen un ejemplo de los análisis de tipo I
(con exceso de anticuerpo). A menudo se denominan análisis inmunoenzimométricos, en los
que el analizado o antígeno, reacciona con exceso estequiométrico de un anticuerpo y el
grado de reacción de antígeno-anticuerpo se mide en segundo paso. Su diseño se basa en
reactivo limitante; para dosificar partículas pequeñas con relativa pureza en una muestra y
pueden ser marcados con una enzima. Detectan anticuerpos específicos independientemente
de su isotipo.
103
 ELISA indirecto
Para detección de anticuerpos, el ELISA indirecto es un proceso de unión de dos pasos
que implica el uso de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado. En este
método, el anticuerpo primario se incuba
con los pocillos de una placa recubiertos con
antígeno. A continuación, se agrega un
anticuerpo secundario marcado que
reconoce el anticuerpo primario. Luego se
agrega un sustrato para producir una
amplificación de la señal.
Este método se utiliza comúnmente para diagnosticar infecciones por bacterias, virus o
parásitos y cuantificar los anticuerpos contra este antígeno extraño. La detección por ELISA
indirecta es versátil, ya que se pueden usar diferentes marcadores de visualización con el
mismo anticuerpo primario.
Procedimiento
1.- Agregue 500λ del diluyente de la muestra con 5λ de muestra.
2.-Agregar 100λ de la dilución en el pozo.
3.-Incubar dependiendo de lo que establezca la casa comercial.
4.- Proceso de lavado. Con equipo automatizado el inserto establece que se realiza tres veces.
104
5.-Se secan los pozos.

6.-Se va a dar una interacción antígeno anticuerpo, pero no marcada.
7.- Se marca con el conjugado.
6.- Incubación.
7.- Se lava la misma cantidad de veces que la primera vez.
8.- Se va a dar una interacción de antígeno anticuerpo marcada.
7.- Se agrega el sustrato para revelar.
8.-Incubación.
9.- Se va a obtener la presencia de color. Positiva: El anticuerpo del paciente se unió a la
reacción.
ELISA sándwich
Detecta solo las proteínas intactas y fragmentos de gran tamaño con un mínimo de dos
puntos de enlace, Los ensayos ELISA sándwich utilizan dos anticuerpos específicos contra
el antígeno para capturarlo a manera de emparedado (sándwich) en la placa de detección.
Solo es aplicable a antígenos bivalentes o polivalentes.
En una primera la primera etapa, el antígeno de interés se añade a un anticuerpo primario

unido a una placa. Durante una segunda incubación, se añade un anticuerpo secundario al
complejo antígeno anticuerpo primario formado en el primer paso. El anticuerpo secundario
puede estar directamente conjugado a una enzima que sólo requiera la adición del sustrato o
estar unido a un marcador que requiera la adición de un segundo compuesto que es el que
reaccionará directamente con el sustrato.
Cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para desarrollar color, las muestras
con una alta concentración de antígeno generan más señal que aquellas con una baja
concentración de antígeno, lo que produce una señal directamente proporcional a la cantidad
de antígeno en la muestra.
Para estimar la concentración de antígeno presente en la muestra se extrapolan las

mediciones con una curva de calibración. Este tipo de ensayo se usa generalmente para
proteínas de peso molecular bajo a alto, como la endotelina 1 (por ejemplo, Endothelin-1
105
ELISA kit), HSP70 (AMP’D HSP70 high sensitivity ELISA kit), o la proteína de
supervivencia de las neuronas motoras (SMN ELISA kit).
Los ELISA sándwich son altamente específicos ya que se basan en un par de anticuerpos
para la captura y detección en lugar de fijar de manera directa el antígeno a una placa de
plástico, como se hace en el ELISA directo. Esto permite concentrar el antígeno de interés
sobre la superficie de la placa aun cuando esté presente en concentraciones muy bajas en la
mezcla inicial.
106
ELISA Competitivo
 ELISA Competitivo con empleo de antígeno marcado por enzimas
En este tipo de análisis, la presencia y la cantidad de un antígeno particular en una muestra
desconocida se determinan por su capacidad para competir con un antígeno de referencia
marcado para unión a un anticuerpo fijo en una placa (Murphy, Travers y Walport, 2008).
Primero, una cantidad determinada de anticuerpo no marcado se fija a un grupo de placas

y una preparación de estándar de referencia de un antígeno marcado se une a ellas. A
continuación, se añaden diversas cantidades de muestra no marcadas y se mide el
desplazamiento del antígeno marcado, lo que genera curvas de inhibición características.
Se obtiene una curva estándar al usar cantidades conocidas de antígeno no marcado

idénticas a las usadas en la especie marcada y una comparación con esta curva permite
calcular la cantidad de antígeno en muestras desconocidas.
Durante la incubación, las muestras con alto contenido de antígeno dan como resultado
que el antígeno no marcado se une en mayores cantidades que el antígeno conjugado; por lo
tanto, cuando se agrega un sustrato cromogénico al ensayo para desarrollar color, las
muestras con una alta concentración de antígeno generan una señal más baja que las que
contienen una baja concentración de antígeno, lo que produce una correlación inversa entre
la concentración de antígeno en la muestra y el desarrollo de color en el ensayo.
Este tipo de reacción es uno de los pocos métodos posibles para estimar la cantidad de
antígenos de bajo peso molecular con un número limitado de epítopes o sitios de unión a
anticuerpos, como moléculas pequeñas (por ejemplo, Direct cAMP ELISA kit), péptidos
(por ejemplo, Oxytocin ELISA kit) y esteroides (Corticosterone ELISA kit).
 Método competitivo de anticuerpo

Se emplea el procedimiento que se describió anteriormente, con la diferencia de que en
fase solida van a estar fijados antígenos. La muestra que se agregara es el suero del paciente
junto con el conjugado, lo que va a provocar una competencia del conjugado con los
anticuerpos del paciente para ver cual se une al sitio de unión.
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Procedimiento
1.-Agregue 100λ de muestra e incube 15 minutos
2.-Agregue 100λ de conjugado e incube 1 hora y 45 minutos.
3.-Proceso de lavado.
4.- Se agrega el sustrato.
5.- Proceso de incubación.
6.-Reaccion positiva: A mayor color menor concentración. Ausencia de color está indicando
positividad.
Reacción negativa: Presencia de color, se estableció la unión con el conjugado.
Componentes
Fase sólida/soportes
Se pueden utilizar dos tipos de sustancias, las que favorece la adsorción física (por fuerzas
electrostáticas) de las moléculas de antígenos o anticuerpos: poliestireno, cloruro de
polivinilo, polipropileno, nylon y silicona. O las que permiten la fijación covalente de estos
reactivos: acrilamida, celulosa e isotiocianato.
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Los mejores resultados se obtienen con el poliestireno y el polivinilo por su transparencia,

rigidez y propiedades adsortivas, tienen gran afinidad por las proteínas. Tubos y placas de
microtitulación requieren menor cantidad de reactivos y muestra, por lo que son aptas para
la automatización.
Inmunoreactivos
 Particulados; células.
 Solubles: los más utilizados son las proteínas, pero también se pueden utilizar
carbohidratos, glicoproteínas, nucleoproteínas, ácidos nucleicos, etc., unidos a la fase
sólida. El método más empleado para fijar proteínas a fase sólida es la adsorción.
También se ha utilizado la unión covalente para disminuir las perdidas por lavado durante
el procedimiento del ELISA. Otra variante es la adsorción-fijación, en la que la proteína
adsorbida es fijada utilizando glutaraldehído.
Adsorción
Las moléculas que se adhieren con facilidad y regularidad a los polímeros son: proteínas,
lipoproteínas, glicoproteínas, algunos lipopolisacáridos y el ADN desnaturalizado. La unión
que se establece entre la fase solida Ac-Ac es de tipo físico, produciéndose una reacción de
equilibrio entre las porciones fija y libre del antígeno.
En el curso de la reacción ocurre una liberación gradual del material adherido, lo que
puede modificar significativamente el sistema. Se minimizan estos cambios estandarizando
la adsorción, concentración de reactivos, pH, tiempo de incubación y temperatura.
Antígenos
Una de las dificultades es la obtención del antígeno adecuado. Por su sensibilidad, es
necesario contar con antígenos purificados y estables que aseguren la reproducibilidad. Los
antígenos parasitarios en general son mezclas complejas de macromoléculas inmunogénicas,
entre las que se hallan antígenos específicos y sustancias antigénicas que provienen del
medio de cultivo o del huésped.
La purificación de antígenos ha mejorado sustancialmente con el empleo de la ingeniería

109
genética, AcMo y sueros monoespecíficos. Las concentraciones del antígeno se determinan

en cada lote en base a las titulaciones, tanto del antígeno y el anticuerpo como de los
conjugados enzimáticos.
Enzimas/marcadores
 Peroxidasa de rábano.
 Fosfatasa alcalina.
 B-galactosidasa.
 Glucosa oxidasa.
El conjugado se forma por la unión de una enzima marcadora con un anticuerpo homologo.
Condiciones
 Deben tener actividad específica, pureza, estabilidad y solubilidad.
 Ser de fácil medición y detección.
 No se reduce la actividad por la conjugación.
 Bajo costo.
 Estables en amplio intervalo de condiciones del ensayo y con grupos funcionales
adecuados para su unión a antígenos o anticuerpos.
Lavado
Luego de la incorporación de cada componente (antígeno, anticuerpo, conjugado, sustrato
enzimático), debe efectuarse una serie de lavados con el fin de eliminar el exceso que no se
haya fijado (físico-inmunológico) al soporte sólido. Dependiendo del ensayo, habitualmente
se realizan entre 3-6 en cada una de las etapas.
El tiempo también depende del ensayo, como solución se emplea buffer pH 7.2, que tiene
además Tween 20, el cual facilita la separación de las sustancias actuando como humectante,
detergente y fungicida.
Se recomienda lavar el doble de veces que establece el inserto debido a que cuando se
está vertiendo el líquido de lavado en cada pozo, por lo general se traspasa de pozo lo que
crea complicaciones, para no tener falsa negatividad o positividad por contaminación de los
pozos.
110
Solución de parada
Son utilizadas para detener las reacciones de ELISA. Va a detener la reacción hasta que se
lea el resultado para que le dé tiempo al bioanalista de introducir en el equipo las pruebas
que son cuantitativas o leer las que son cualitativas para realizar el reporte.
Sustrato/reveladores
Cada enzima tiene su sustrato, los sustratos emiten un color, dependiendo del tipo. Ese viraje
cambia cuando agregamos la solución de parada. Algunos de los sustratos son:
 OPD, TTB, ABTS, DAB
 PNPP, NAPFB, NARD, BCLP
 ONPG
 LS
Aplicaciones
 Investigación del cáncer: Las técnicas basadas ELISA están disponibles y son utilizadas
en el laboratorio clínico para probar los primeros tiempos de cánceres incluyendo cáncer
ovárico y de pecho.
 Prueba de droga: Las concentraciones de drogas ilícitas, tales como cannabinoides, las
anfetaminas, narcóticos, cocaína, benzodiacepinas, y metadona, pueden ser resueltas usando
ELISA en muestras de orina. El método se puede también utilizar para vigilar los niveles de
concentraciones farmacéuticas de la droga en los pacientes que experimentan tratamiento.
 Prueba de embarazo: Para la detección de la gonadotropina coriónica humana (hCG) en

la orina.
 Determinación de anticuerpo de la plaqueta: La detección de los anticuerpos de la

plaqueta en suero se utiliza para determinar a los pacientes que sufren de desórdenes tales
como púrpura trombocitopénica idiopática y lupus eritematoso sistémico.
 Alergénicos de la comida: Descubrir la presencia de alergénicos para la etiqueta

legalmente requerida del ingrediente.
111
 Detección del VIH, Virus del Nilo del Oeste, Virus de la Enfermedad de Newcastle
(NDV), toxoplasmosis, sífilis, enfermedad de Lyme, Carcinoma Escamoso, Anemia
perniciosa, entre otros.
Ventajas y desventajas de los distintos tipos de ELISA
Ventajas Desventajas
 Alta sensibilidad, esto debido al uso

de anticuerpos secundarios, que
hacen posible que se amplifique la
señal.
 Posee una flexibilidad alta, debido a
que un mismo anticuerpo secundario  El uso de anticuerpos
puede emplearse con diferentes secundarios puede dar
ELISA indirecto
anticuerpos primarios. lugar a reactividad
 Beneficio económico por lo cruzada.
mencionado por la flexibilidad
mencionada.
 El anticuerpo primario mantiene
intacta su inmunoreactividad al no ir
conjugado.
 El antígeno debe ser lo
suficientemente grande
para poder permitir la
unión al mismo de dos
 Alta sensibilidad y especificidad,
anticuerpos
ELISA sandwich debido al uso de dos anticuerpos
simultáneamente.
frente al mismo antígeno.
 No siempre es fácil
contar con pares de
anticuerpos que
funcionen bien.
 Alta sensibilidad
 Permite la detección de antígenos de
 Es complejo.
ELISA pequeño tamaño y en bajas
 Requiere el uso de
competitivo concentraciones.
antígeno de inhibición.
 No requiere procesamiento precio de
las muestras a analizar.
112
Kits de ELISA
Los kits ELISA, diseñados para determinar la presencia y/o concentración de un
determinado antígeno en una muestra problema, son inmunoensayos que pueden ser
diseñados en el propio laboratorio. Como ejemplos tenemos los kits de ELISA recubiertos y
no recubiertos.
Kits Recubiertos
Están listos para usar y se han probado para proporcionar la menor variabilidad posible
entre ensayos e intraensayos y la mayor consistencia posible de lote a lote. Los kits ELISA
con placas prerecubiertas ayudan a garantizar que obtenga un rendimiento ELISA constante
y están diseñados para laboratorios que requieren kits validados y probados
exhaustivamente. La estructura típica del producto de los kits ELISA recubiertos incluye:
 Placa de tira de 96 pocillos recubierta previamente con anticuerpo de captura

 Estándar calibrado
 Detección de anticuerpos biotinilados
 Conjugado de estreptavidina-HRP (y tampón de dilución de HRP)
 Tampón de ensayo (para estándar y muestra)
 Tampón de lavado
 Solución de sustrato TMB
 Detener la solución
Kit no recubierto
Tienen los reactivos necesarios para recubrir sus propias placas, procesar durante la noche
y ejecutar el ensayo. Las configuraciones del kit proporcionan opciones flexibles y fáciles
de usar. Los kits sin recubrimiento son ideales para usuarios experimentados de ELISA con
un presupuesto con requisitos menos estrictos para la varianza entre e intraensayos. La
estructura típica del producto de los kits ELISA sin recubrimiento incluye:
 Capturar concentrado de anticuerpos
 Estándar calibrado
 Detección de anticuerpos biotinilados
 Conjugado de estreptavidina-HRP
113
 Tampón de ensayo
 Diluyente de muestra
 Solución de sustrato TMB
 PBS concentrado
Las placas son opcionales para tamaños de placa de 10 y 20. El tampón de lavado y la
solución de parada se venden por separado.
Equipos
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes hasta
las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su capacidad de
adsorción (en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente claros que
permitan realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad (por ejemplo, con

384 y 1536 pocillos), adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas
robotizados (HTS, High-throughput system).
Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada
uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional,
con capacidad de leer todas las
longitudes de onda del ultravioleta
y el visible de manera continua, los
lectores de ELISA disponen de
sistemas de filtros que solo
permiten la lectura de una o pocas
longitudes de onda; son la que se
corresponden con las necesarias
para determinar la densidad óptica
de los cromógenos más
comúnmente utilizados.
114
Métodos de lectura de resultados Colorimetría
En estos ensayos se obtiene un producto de reacción coloreado que absorbe luz, siendo
la densidad óptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medido. Para
todos los ensayos enzimáticos, la etapa final es la adición del substrato enzimático, este es
escogido por su rendimiento en la reacción enzimática. Para ensayos colorimétricos, la tasa
de desarrollo de color es proporcional, dentro de un cierto rango, a la cantidad de conjugado
enzimático presente.
115
GALERIA FOTOGRAFICA PRÁCTICA DE ELISA

A continuación, se muestran fotos reales de un Elisa tipo sandwich obtenidas a través del
canal de YouTube WeSapiens.org, esto para mostrar al lector como seria cada uno de los
componentes y procedimientos que se comentaron en el día a día de un bioanalista.
116
ETAPAS Y UTILIDAD DEL ELISA: COVID-19
En la sangre de un paciente infectado por el virus SARS-CoV-2, pueden detectarse los

anticuerpos producidos con una prueba de ELISA.
Procedimiento explicado por: Dra. Carolina Vaisman.
1.-En el pocillo de la placa, donde está absorbido el antígeno específico de SARS-CoV-2, se

agrega el suero del paciente.
2.-Si el paciente tiene anticuerpos contra el SARS-CoV-2, éstos reconocen al antígeno

formando el IC (inmunocomplejo). Entre cada paso la placa es lavada con una solución de
detergente suave para remover células, proteínas o anticuerpos que no son específicos.
3.-Se agrega a continuación, el anticuerpo de captura o detección que está marcado con la
enzima. El exceso de anticuerpo se elimina con un lavado.
4.-Se agrega el sustrato de la enzima. Se incuba.
5.-En los pocillos que contienen muestras de pacientes que han sido infectados con el SARS-
CoV-2 y por lo tanto tienen anticuerpos contra el virus, los anticuerpos marcados con la con
la enzima actúan sobre sustrato el cual cambia de color, lo que indica una prueba positiva.
6.-Este cambio de color si bien puede verse a simple vista, se lee o cuantifica mediante un
espectrofotómetro o lector de placa.
7.-Si el paciente no hubiera sido infectado con COVID-19, el anticuerpo ligado a la enzima
no se adhiere a nada en el pozo y el sustrato no cambia de color. Esto representaría una
prueba negativa.
117
INSERTO DE ELISA
118
119
120
121
122
123
124
BIBLIOGRAFÍA
Libros
 Lequin, R.M. Inmunoanálisis enzimático (EIA)/Análisis de inmunoadsorción
Enzimática (ELISA). Química clínica. 2005.
 Nakamura Robert M, Tucker Ernest S y Carlson Ian H. (1993). Diagnóstico y

Tratamientos Clínicos por el Laboratorio. 9a edición. Ediciones Científicas y Técnicas, S.
A.
Páginas web
 Barnett, C. (2019). Usos de ELISA.News Medical Life Sciences. Recuperado de
https://www.news-medical.net/life-sciences/ELISA-Applications-
(Spanish).aspx#:~:text=La%20detecci%C3%B3n%20de%20los%20anticuerpos,con%20el
%20lgG%20anti%2Dhumano.
 Abyntec. (2019). Ventajas y desventajas de los distintos tipos de ELISA. Recuperado
de https://www.abyntek.com/ventajas-y-desventajas-de-los-distintos-tipos-de-elisa/
 Galvan, A, Túnez, I. (s.) Inmunoanálisis. Recuperado de
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/18%20INMUNOANALISIS.pdf
 Ortiz, D. (2019). Técnicas ELISA y Western blot. Recuperado de
https://inmunojmvucv.files.wordpress.com/2019/09/clase-prc3a1ctica-elisa-y-western-blot-
2019.pdf
 Vaisman, C (2020). Diagnóstico serológico: ELISA. Estornuda.me. Recuperado de
https://www.estornuda.me/post/diagnostico-serologico-elisa
 Merian-Ring Christoph. Bioreba: Procedimiento del test de ELISA (PDF). (2009).
[www.biorebalatina.com.ar/assets/procedimiento-test-%20ELISA.pdf]
 Wienerlab. HCV Elisa 3era generación (PDF). [https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/hcv_elisa_3_generacion_sp.
pdf]
125
Núcleo Bolívar
Laboratorio
Hecho por:
Grupo Viernes B

126
INTRODUCCIÓN
Entre los fenómenos que estudia la tecnología de recombinación del ADN está la
hibridación. La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a
partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de
un proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN y ARN para formar una
molécula de ácido nucleico de doble cadena.
Existen varias técnicas basadas en la hibridación entre ellas PCR, CGH, ISH: FISH,
CISH, SISH y las de nuestro estudio que son técnicas de transferencia o “blotting”. Dentro
de las cuales esta: Southern blot y Northern blot, se utilizan para separar y caracterizar ADN
y ARN respectivamente y Western blot para transferencia de proteínas.
Estas técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las
moleculas por su tamaño, posteriormente transferencia a una membrana para finalmente
identificar un fragmento especifico de ADN, una molecula de ARN particular o una proteina
de interes, mediante la unión especifica de otra molecula de ácido nucleico para ADN o
ARN, y anticuerpo para proteínas.
Los inmunoblot proveen información que puede ser usada para el diagnóstico
molecular de algunas enfermedades génicas, por lo tanto, son de gran importancia clínica la
cual estudiaremos a continuación de forma individual sobre cada una de estas tecnicas, junto
con su desarrollo y procedimiento.
127
CUESTIONARIO DIAGNÓSTICO DE BLOTTING
1) Explique brevemente que es el Blot.

R: Son métodos basados en la transferencia de proteínas, ADN o ARN a un soporte sólido.
2) Mencione cuales son los tipos de Blot y cuáles son los analitos que se determinan
en cada uno.
R: Northern Blot (Transferencia de ARN), Southern Blot (Transferencia de ADN), Western
Blot (Transferencia de proteínas)
3) Diga cuales el soporte y el revelada que se utiliza en cada uno de los Blot.
R: Northern Blot: quimioluminiscencia (revelado) nitrocelulosa (soporte), Southern Blot:
Autorradiografia (revelado) Agarosa, nylon (soporte), Western Blot: Colorimetría (revelado)
Gel de poliacridamida (Soporte)
4) Mencione los pasos que se utilizan en las pruebas de Blotting.

R:
a. Se separa el analito a estudiar (proteínas, ADN o ARN) por Electroforesis en
un gel.
b. Realizamos el Blotting, que consiste en transferir las muestras separadas a
una membrana.
c. Luego se procede a marcar la membrana, con el marcador correspondiente al
método empleado. (Southern, Northern, Western)
d. Posteriormente se realiza la lectura o revelado (quimioluminiscencia,
colorimétrico, autorradiagrafia)
5) Diga cuál es el uso más frecuente del western blot.

R: Mayormente el Western Blot es utilizado como prueba confirmatoria para los pacientes
que pueden presentan VIH.
128
Principio del Blot

Los Blotting son métodos basados en la transferencia de proteínas, ADN o ARN a un soporte
sólido. Para llevar a cabo un método de Blotting:
1) Se separa el analito a estudiar (proteínas, ADN o ARN) por Electroforesis en un gel.
Estas son separadas dependiendo de su tamaño y carga.
2) Realizamos el Blotting, que consiste en transferir las muestras separadas a una

membrana (generalmente de nylon o nitrocelulosa).
3) Luego se procede a marcar la membrana, con el marcador correspondiente al método

empleado (Southern, Northern, Western)
4) Posteriormente se realiza la lectura o revelado (quimioluminiscencia, colorimétrico,

autorradiagrafia)
Antes de iniciar a conocer los tipos de inmunoblot debemos hablar o manejar unos
conceptos básicos en el cual se fundamenta este tipo de inmunoensayo.
Quimioluminiscencia: se entiende el fenómeno por el que, en algunas reacciones químicas,

la energía liberada no sólo se emite en forma de calor o de energía química, sino también en
forma de luz. Es un fenómeno que acompaña a algunas reacciones químicas y bioquímicas
que sucede porque un electrón que estaba en un nivel superior baja a un nivel inferior; al
bajar necesita menos energía para poder dar una vuelta alrededor del núcleo por lo que libera
la energía sobrante en forma de fotones que al ser libres producen luz. Así, ciertas sustancias
tienen la propiedad de emitir luz cuando, al absorber energía de la reacción oxidativa de su
propia molécula, son colocadas en un estado de 'excitación electrónica'. La emisión de luz
se producirá al volver a su estado 'basal', con lo que la energía química absorbida se cederá
en forma de fotones (radiación electromagnética), fácilmente cuantificables.
Otra cosa que debemos de tener claro son 3 procesos que ocurren en los Blot:
• Capilaridad: es una propiedad de los fluidos que depende de su tensión superficial,
a su vez, depende de la cohesión del fluido, la cual le confiere la capacidad de subir o bajar
por un tubo capilar. Cuando un líquido sube por un tubo capilar, es debido a que la fuerza
129
intermolecular o cohesión intermolecular es menor que la adhesión del líquido con el

material del tubo; es decir, el líquido sigue subiendo hasta que la tensión superficial es
equilibrada por el peso del líquido que llena el tubo. En el caso de la capilaridad, las
moléculas del líquido interaccionan más fuerte con las moléculas situadas en la pared del
tubo (adhesión), que entre ellas (cohesión), provoca la capilaridad
• Difusión: Es el desplazamiento de las moléculas de una sustancia, de una zona de

mayor concentración a otra de menor concentración; esto permite que la sustancia se
distribuya de manera uniforme en el espacio que la contiene. La difusión de moléculas
persiste mientras exista un gradiente de concentración entre las diferentes partes del sistema.
La difusión termina cuando se alcanza el equilibrio y la concentración de la sustancia es
igual en todo el sistema.
• Electroforesis: Es un proceso en el que un gradiente de potencial produce el

transporte de las partículas cargadas. En el transporte electroforético, a la fuerza del campo
se opone la resistencia viscosa del medio, lo que produce, cuando se igualan, una velocidad
constante de las partículas. Así pues, la movilidad electroforética de una molécula depende
directamente de su carga e inversamente del coeficiente de rozamiento, que a su vez depende
directamente del tamaño y la forma de la molécula y la viscosidad del medio. La migración
de las partículas depende del pH del medio en que estén, ya que su carga neta depende del
pH.
Hay 3 tipos de ensayo de Blotting:

• Northern Blot (Transferencia de ARN)
• Southern Blot (Transferencia de ADN)
• Western Blot (Transferencia de proteínas)
Northern Blot
Es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un
péptido dado en una muestra de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete
a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras
130
esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente
en la que se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o
químicamente.
Procedimientos del Northern Blot

1) El procedimiento comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido
homogeneizado. El ARNm se puede aislar mediante cromatografía para retener solamente
los ARN con colas de poli(A).
2) Las muestras de ARN se separan mediante electroforesis en gel. Dada la fragilidad

de los geles y la dificultad para que las sondas penetren en la matriz, las muestras de ARN,
separadas por tamaño tras la electroforesis, se transfieren a una membrana de nailon, bien
por capilaridad o empleando un sistema de vacío.
3) Los sistemas de capilaridad iónica se utilizan para transferir el ARN desde un gel de
electroforesis a una membrana de northern blot. Una membrana de nailon cargada
positivamente es el soporte más eficaz para realizar la hibridación en el northern blot ya que
los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas
membranas.
4) El tampón de transferencia que se usa en el ensayo suele contener formamida, dado

que esta reduce la temperatura de interacción de las muestras, lo que evita la utilización de
altas temperaturas que podrían desnaturalizar las moléculas de ARN.
5) Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza mediante enlaces

covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o
calor.
6) Después del marcaje de la sonda, ésta se hibrida con el ARN en la membrana. Las
condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación
están determinadas por las condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de ARN
bicatenario, bases desemparejadas y composición de las mismas.
131
7) Finalmente, la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de

forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma. Estas
señales pueden cuantificarse mediante densitometría. Para crear controles y poder
asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar
posteriormente la determinación empleando chips de ADN o RT-PCR.
Importancia Clínica del Northern Blot

El ensayo northern permite observar un patrón particular de expresión genética entre
tejidos, órganos, estadios del desarrollo, infecciones causadas por patógenos y durante el
curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la
sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células
cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes.
Desde que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una
idea de su tamaño, sugerir ajuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La
variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores
132
en el proceso de transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso

determinar qué región del RNA ha sido delecionada.
Southern Blot
Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una
secuencia de ADN concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea
la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN
de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa
la hibridación de la sonda.
Procedimientos del Southern Blot

1) Extracción del ADN: Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano.
2) Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción: El ADN extraído de la
muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN
bicatenario en donde tenga una secuencia característica.
3) Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN
resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante
la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el
electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa
4) Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot"): Tras la electroforesis, las

moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa,
impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA
monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando
así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido,
es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de
Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern.
5) Hibridación con sonda radioactiva: Una sonda de locus único es una molécula
pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de restricción
concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex)
133
depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y

del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un
isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético
polimórfico en un solo cromosoma humano.
6) Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de hibridación de

la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante
autorradiografía. En esta técnica, La membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a
una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico,
el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía.
7) Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: En un análisis legal de

DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras
el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad
con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una
segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente.
134
Importancia Clínica del Southern Blot

El Southern Blot es una técnica que puede proveer información que puede ser usada
para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades génicas, ejemplo de ellas serían el
Síndrome de Angelman, Síndrome de Prader-Willi y Síndrome X frágil. Esta técnica resulta
ser la más sensible para el diagnóstico de algunas patologías como es el caso del Síndrome
Angelman y el Síndrome de Prader-Willi. Otra enfermedad que también puede ser
diagnosticada por el Southern Blot es el Síndrome de X frágil, el uso de esta técnica para
esta enfermedad permitirá cuantificar el número exacto de repeticiones y metilaciones,
causantes de la enfermedad.
Western Blot
Técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas
específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos
celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto: separación por tamaño,
transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de
proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.
Procedimientos del Western Blot

1) Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente
peso molecular.
2) Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban

con el suero problema.
3) Los anticuerpos se detectan añadiendo una anti-IgG humana marcada con una enzima
(peroxidasa) que produce una banda coloreada al añadir un sustrato.
4) Esta técnica identifica anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas. Las
proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
5) Luego se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico y un tampón de

transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en
el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo):
135
esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más
papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sándwich.
6) se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de

magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible.
7) Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la
membrana.
8) Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant
Blue (un colorante de para comprobar que en efecto una parte importante del material
proteico ha pasado a la membrana).
Importancia Clínica del Western Blot

En la práctica clínica, el Western Blot se utiliza para diagnosticar enfermedades
infecciosas, más frecuentemente famoso, el VIH. Algunos laboratorios clínicos
136
inmunofluorescencia emplean técnicas de Western Blot como confirmación, así como

pruebas. Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
Northern Souther Western
Determinación ARN ADN Proteínas
Método Capilaridad Difusión Simple Electrotransferencia
Gel de
Soporte Nitrocelulosa Agarosa, Nylon
poliacridamida
Revelado Quimioluminiscencia Autorradiografia Colorimetria
Marcador/Tin- Tinta china, Azul de coomassie,

P32
ciones negro amido oro coloidal
137
REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
Herrera, C. (s. f.). Fundamentos de técnicas blotting: Southern, Northern, Western.

Slidershare. https://es.slideshare.net/CarolinaHerrera151/fundamentos-de-tcnicas-blotting-
southern-northern-western
Método: Western blot (transferencia semi-seca). (2017, 27 octubre). Conogasi.

http://conogasi.org/articulos/metodo-western-blot-transferencia-semi-seca/
colaboradores de Wikipedia. (2021, 18 febrero). Southern blot. Wikipedia, la

enciclopedia libre. https://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
Campillo-Pedroza, N. (2015). Estandarización de un protocolo para Northern blot no

radioactivo usado en la detección de pequeños RNA en células Vero. Redalyc.org.
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=77642873018
Southern Blot | NHGRI. (s. f.). Genome.gov. https://www.genome.gov/es/genetics-

glossary/Southern-Blot#:%7E:text=Southern%20blot%20es%20una%20t%C3%A9cnica,
muestra%20de%20sangre%20o%20tejido.&text=Los%20fragmentos%20de%20ADN%20
son,un%20marcador%20radiactivo%20o%20qu%C3%ADmico.
Técnicas de Biología Molecular en el Diagnóstico en Dermatología. (s. f.). UMNSM.

https://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas.htm

Practicas Del Laboratorio de Inmunologia II

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Universidad de Oriente

Ciudad Bolívar, Abril del 2021

El presente trabajo pretende proporcionar al estudiante de la carrera de Bioanálisis

Ciudad Bolívar, Abril del 2021

El análisis del complemento es de gran importancia ya que mide la cantidad o la actividad

El sistema del complemento hace parte de una de las

Factores para vía clásica: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4

2. ¿Cuáles son las funciones del sistema del complemento?

El sistema de complemento actúa en tres aspectos biológicos, en primer lugar, participa en

3. ¿Cómo se activan la vía alterna y clásica del sistema del complemento?

❖ Vía alterna o Properdin

a. Pequeñas cantidades de C3b, se anclan en la membrana y son reconocidas por el factor

b. El properdin puede actuar también, la vía alterna al reconocer sus ligandos en la

• Se inicia: por C3b

- La C5 convertasa de la vía clásica cataliza la rotura de unidades de C5

4. ¿Cuándo son necesarias las pruebas del sistema del complemento?

5. ¿Cuáles son las pruebas para la determinación de la vía clásica y alterna?

Para evaluar el sistema de complemento se utiliza pruebas tanto cuantitativas como

❖ Técnica KENT Y FIFE (CH50): Ensayo CH50: La reacción se inicia con la

❖ Prueba de C4 del complemento: Mide la cantidad de proteínas C4 que hay en la

6. ¿Qué condiciones pueden producir alteraciones en las proteínas del sistema de

Pueden observarse descensos en los componentes del complemento en:

• Infecciones microbianas recurrentes (generalmente bacterianas)

También se puede observar una mayor actividad del complemento en los

contendrán la muestra de suero.

5. Al cabo de 24h se ha creado un precipitado fruto de la

❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta

ENSAYO INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMAS (ELISA)

Representa una aplicación popular del inmunoensayo sándwich heterogéneo de fase

❖ PASOS GENERALES PARA LA TÉCNICA DE ELISA

5. Adición del anticuerpo secundario

6. Unión del anticuerpo secundario al

7. Lavado del pocillo para eliminar el

8. Adición del substrato.

El analizador de Elisa está provisto de rejillas o filtros de difracción, los cuales

Los valores de la absorción de la concentración sabida se pueden trazar como mando

Recuperación del pico

Análisis de las linearidades

es proporcional a la concentración de C3 en la muestra y puede medirse

b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda no emplear

c) Sustancias interferentes conocidas: no emplear sueros hemolizados o contaminados. No

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: se recomienda usar suero

Calibrador Proteínas diluido 70 ul

- Realizar diluciones 1:10 de las muestras en solución fisiológica.

❖ ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

La nefelometría cuantitativa es un examen de laboratorio para medir en forma rápida

La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante solo es afectada la

• Se usa en instrumentos automatizados que mide la sensibilidad de los antibióticos,

• Detección de complejos inmunes Cuando una muestra biológica contiene un antígeno

❖ PATOLOGÍAS RELACIONADAS A LAS DEFICIENCIAS DE LAS

Aumento de los niveles de IgM: Disminución de los niveles de IgM

● Linfoma (cáncer del tejido linfá- ● Agammaglobulinemia (muy rara)

tröm (cáncer de los glóbulos blancos en la ● Mieloma múltiple

Aumento de los niveles de IgA Disminución de los niveles de IgA

Calculating and evaluating ELISA data, (s.f). Abcam.Recuperado de:

Cetola V., (2000). Método inmunoturbidimétrico para la determinación del

Complemento (s.f). Labtestonline. Recuperado de:

Hernández, L., González, C., (2002), Introducción al Análisis Instrumental. Editorial:

Martínez E., (2012).Determinación de biomasa. Slideshare. Recuperado de:

Medida de los analitos por fotometría y espectrofotometría. [Blog]. Recuperado de:

Rodríguez, F. (2019). Determinación de IgG por Inmunodifusión Radial (IDR).

Spike and-Recovery and Linearity of Dilution Assessment for ELISA. (s.f).

Ciudad Bolívar, Abril del 2021