PRINCIPIOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO

OBJETIVOS:

Describir los principios básicos de la citometría de flujo

Conocer las aplicaciones de la citometría de flujo en el área de hematología, especialmente en el

diagnóstico de neoplasias hematológicas.

CITOMETRÍA DE FLUJO

Tecnología que permite la medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de

partículas individuales en suspensión (usualmente células), mientras estas pasan en un chorro de
fluido a través de un rayo de luz.

CARACTERÍSTICAS QUE SE PUEDEN ESTUDIAR DE UNA CÉLULA

 Tamaño relativo (Forward scatter-FSC)

 Granularidad relativa o complejidad interna (Side Scatter-SSC).

 Superficie de membrana, antígenos citoplasmáticos y nucleares, contenido de ADN y ARN

 Intensidad fluorescente relativa (FL1,FL2, FL3,FL4, FL5 y FL6)

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

 Rápidez: puede analizar aprox. 35000 eventos/seg.

 Alta sensibilidad: puede detectar una célula tumoral en 1.000.000 de células analizadas.

 Elevado número de células analizadas incrementa la precisión del resultado.

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

 Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas, neoplasmas linfoproliferativos y

síndromes mielodisplásicos

 Detección de Enfermedad Mínima Residual.

 Recuento absoluto de células CD34+.

 Diagnóstico de Hemoglobinuria Paroxística Nocturna. Mutación gen PIG-A (CD55-/CD59-)

 Cuantificación de enzimas eritrocitarias.

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

 Determinación de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK

en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria.

 Recuento absoluto de LT CD4+ en pacientes con VIH.

 Análisis de glucoproteínas de membrana plaquetaria para el diagnóstico precoz de

trombopatías congénitas: CD41(gp IIb), CD42(gp Ib), CD61(gp IIIa).

 Análisis de ploidia: cuantificación del DNA mediante tinción con un colorante fluorescente
(yoduro de propidio).

Dispersión de la luz

 La luz se dispersa cuando se encuentra con una partícula; esto depende de las
propiedades físicas de la partícula (tamaño y complejidad interna).

 La luz se dispersa en un ángulo pequeño en una cantidad proporcional a la superficie

celular o tamaño de la partícula iluminada. Dispersión frontal o Forward scatter.

 La luz que se dispersa lateralmente (side scatter) en un ángulo cercano a 90°C, es

proporcional a la complejidad interna de la partícula o la granularidad celular.
Forward scatter-FSC
Side Scatter-SSC

Intensidad fluorescente relativa

COMPONENTES DEL CITÓMETRO

 Sistema de fluidos o transportador de fluidos: para introducir y focalizar las células a

evaluar.

 Componente óptico: para generar y colectar las señales de luz

 Componente electrónico: convierte la luz detectada en señales electrónicas.

SISTEMA DE FLUJO

 Transportar las partículas en suspensión hasta el rayo láser para su análisis

(interrogación).

 Las partículas deben pasar por el centro del rayo láser .

 Solamente una célula o partícula debe pasar por el láser a la vez (500-5000 células por
segundo).

 La muestra es inyectada en el centro de un chorro de fluido que la envuelve (sheat fluid)

en la cámara de flujo.

Sistema de fluidos
  El flow cell hace que la muestra se mantenga en el centro del flujo (sample core) y es
transportada hasta el punto de interacción con el láser.

 Presiones de la muestra y fluido envolvente son diferentes

Componente óptico

 Genera y colecta las señales de luz .

 Consta de dos partes: la óptica de la excitación y la óptica de la recolección.

1-Óptica de excitación depende de: un láser y lentes para regular y focalizar el rayo láser

2- Óptica de la recolección depende de : lentes de colección de luz emitida por la interacción de la

partícula con el rayo láser y un sistema de espejos ópticos y filtros para dirigir las longitudes de
onda especificadas por la luz colectada hacia detectores ópticos designados

Componente óptico
FLUORESCENCIA

 Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal
emitiendo un fotón.

 Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el
fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido

 Fluorocromo: compuesto que absorbe la luz láser y que emite un rayo luminoso de
diferente longitud de onda.

 Espectro de absorción: rango de longitudes de onda en las cuales un compuesto

fluorescente puede excitarse.

 Espectro de emisión: rango de longitudes de onda de los fotones emitidos.

 Las diferentes longitudes de onda corresponden a distintos colores.

  Cuando un colorante fluorescente se conjuga con un Ac monoclonal, puede usarse para
identificar un tipo celular específico con base a los marcadores de superficies presentes
en la membrana de la célula.

Componente electrónico

 Convierte las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales (pulsos de voltaje)

para su análisis en el computador.

 Analiza los pulsos de voltaje.

 Señales electrónicas o pulsos de voltaje: señales análogas en varias magnitudes de 1 a 10

V y pueden ser procesadas como pico de amplitud (altura), integral (área), ancho
(duración), o la forma del pulso.

Componente o sistema informático

 Almacenamiento en modo de Lista: parámetros medidos se pueden almacenar de forma

permanente o temporal.

 Gating: ventana electrónica que se puede establecer con un cursor en la pantalla en forma
rectilínea o amorfa para seleccionar un grupo de células con características similares, con
el fin de analizarlas.

 Gráficos: computador puede proporcionar pantallas gráficas en varias formas.

ESCALAS

• Se expresan en cualquiera de las escalas logarítmicas o lineales.

FSC Ej: Lineal

FL-1 Ej: Logarítmica

GATING

 Permite la selección de subpoblaciones definidas en los diagramas monoparamétricos

(Histogramas) o biparamétricos (dot-plots).

 Define las células de interés para estudios posteriores.

Dispersogramas

INTERPRETACIÓN GRÁFICOS BIPARAMÉTRICOS

DOT-PLOT SSC vs FSC - Sangre Periférica
MARCADORES DE INMUNOFENOTIPO

Detección, identificación y localización de diversos componentes celulares mediante

reconocimiento de la reacción específica entre estos con los anticuerpos monoclonales.

 CD34, HLA-DR, tdt: Precursores hematopoyéticos

 CD45: Antígeno leucocitario común.

 CD33, CD13, CD15, CD117, CD65, MPO: Linaje mieloide

 CD2,CD3,CD5,CD7, CD4, CD8: Linfoide T

 CD10, CD19,CD20, CD22, CD24,CD79a: Linfoide B

 CD14, CD11b, CD4, CD68: Monocitos

 CD41 (gp IIb), CD 42 (gp Ib), CD61 (gp IIIa): Línea megacariocítica

 CD71 (TFR), CD235a (antiglicoforina A): Línea eritroide

 Consorcio científico independiente, cuyo objetivo es la estandarización e innovación de

Inmunofenotipo por Citometría de Flujo.

 Desarrollar y estandarizar test de Citometría de Flujo rápido, preciso y con alta

sensibilidad, para el diagnóstico, clasificación y pronóstico de las neoplasias
hematológicas, así como también para la evaluación de la efectividad del tratamiento.