CAROLINA RAMÍREZ GONZÁLEZ 2º LCB A TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO

ACTIVIDADES UNIDAD 5: TÉCNICAS DE

IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES
CELULARES.
1. Explica el fundamento de la citometría de flujo.
La citometría de flujo es una técnica de análisis de poblaciones celulares en
suspensión.
Consiste en pasar una suspensión de células u otras partículas en un flujo de líquido
isotónico a pasar, alineadas de una en una por delante de uno varios detectores que
recogen y miden sus características físicas y/o químicas, al mismo tiempo que se las
ilumina con un haz de luz, normalmente un láser.

2. ¿Qué requisitos debe cumplir una suspensión celular destinada al análisis por
citometría de flujo?
- Ser representativa del tejido que es objeto de estudio.
- Ser de alta calidad, con pocos agregados y restos y bajo coeficiente de variación.
- Que preserve las características celulares.
- Que contenga suficiente muestra celular.

3. Cita los componentes básicos de un citómetro de flujo y explica qué función tienen.
Los componentes básicos de un citómetro de flujo son los siguientes:
- Sistema hidráulico: Conduce la suspensión celular a una velocidad constante y
controlada a través de la cámara de flujo o zona de detección, donde incide el
haz de luz. Está formado por un capilar por el que pasa un líquido isotónico que
envuelve la suspensión.
- Sistema de iluminación: Proporciona el haz de luz que ilumina la muestra,
generalmente un láser. La luz emitida es una mezcla de longitudes de onda, las
cuales se define por la energía emitida por el electrón al caer de una órbita más
alta a otra más baja, las más utilizadas son las de 488, 568, 630 y 647 nm. Los
emisores láser más utilizados son los de argón con luz monocromático de 488
nm.
- Sistema óptico: a medida que las células o las partículas van atravesando el haz
luminoso, el sistema detecta la luz dispersada y selecciona la fluorescencia
emitida. El sistema recoge la luz emitida por las células.
- Sistema electrónico: Detecta y amplifica la respuesta de las células. Transforma
las señales en forma digital y controla el proceso de separación celular. Existen
dos tipos de detectores, el fotomultiplicador que detecta la señal de

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fluorescencia y luz dispersada a 90º y el fotodetector diodo que detecta la

dispersión frontal de la luz.
- Sistema de adquisición y análisis de datos: Permite la adquisición
multiparamétrica, el análisis en tiempo real de los datos y el análisis de las
subpoblaciones seleccionadas. Procesa la señal obtenida y proporciona la
información estadística de los datos, representándolos en forma de histogramas
monoparamétricos o biparamétricos.

4. Explica en qué consiste el control de calidad diario de un citómetro de flujo.

Determina las mismas variables que se calculan durante el establecimiento de la
línea base para calcular su variación a lo largo del tiempo. Se utilizan:
- Controles conocidos: monitorizan las prestaciones o la reproductibilidad de los
reactivos y la calidad de los métodos de preparación celular.
- Controles negativos: descartan la unión inespecífica del fluorocromo y
seleccionan el umbral de autofluorescencia.
- Controles positivos: comprueban que la técnica funciona.

5. ¿Cómo se obtiene, analizan y expresan los resultados de un análisis realizado

mediante un citómetro de flujo?
Los citómetros de flujo analizan las suspensiones celulares a una velocidad entre
500-1000 células/segundo.
Se basa en la obtención de los porcentajes de células fluorescentes y de la media de
intensidad de fluorescencia. Los datos obtenidos se comparan entre las muestras
problemas y los controles. Para que el resultado sea válido estadísticamente, hay
que repetir los experimentos tres veces. Para analizar los resultados, se utilizan
filtros para poder obtener un resumen de los datos. Obtenemos información de la
concentración, en células o partículas/mL, el porcentaje de células positivas y
negativas para cada canal y la intensidad media de fluorescencia.
Los datos los expresamos mediante histogramas de frecuencia.

6. Indica algunas aplicaciones de la citometría de flujo.

- A escala supracelular: organismos pluricelulares, esferoides e hibridomas.
- A escala celular: protoplastos vegetales, células animales, levaduras y bacterias.
- A escala subcelular: viriones, liposomas, cromosomas, orgánulos y núcleos.
- A escala molecular: proteínas, ácidos nucleicos e inmunocomplejos.

7. Explica qué es el inmunofenotipado de superficie y cita alguna de sus aplicaciones.

Para identificar y clasificar las células se emplea la determinación de antígenos
mediante anticuerpos monoclonales (producidos por un solo clon de linfocitos B)
marcados con fluorocromos.
El inmunofenotipo de superficie identifica subpoblaciones celulares.

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8. Explica qué es el panning para linfocitos.

Es un método sencillo que permite separar los linfocitos T de los B. Se utilizan placas
sensibilizadas con anticuerpos específicos de los marcadores de superficie de las
subpoblaciones que se quiere separar (por ejemplo, anti-CD4 y anti-CD8). Las células
de interés podrán unirse a los anticuerpos mientras que la otra población podrá
eliminarse mediante lavados.