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Meraz Cruz, N.; Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M.
© ISSN-0188-137X
MENSAJE BIOQUÍMICO
Mens. Bioquím. 46 (2022) 67-77
*Correspondencia: INMEGEN, Periferico Sur 4809, Arenal Tepepan, Tlalpan, C.P. 14610, CDMX, México.
Tel +52(55)53501900 ext 1190, lnpatino@inmegen.gob.mx
Resumen Abstract
La citometría de flujo es una herramienta Flow cytometry is a biotechnological tool that
biotecnológica que nos permite medir de manera allows us to quickly measure individual physical
rápida características físicas y químicas de manera and chemical characteristics of each of the cells
individual de cada una de las células suspendidas en suspended in a solution. This technology allows us
una solución. Esta tecnología nos permite evaluar to evaluate multiple parameters simultaneously in a
múltiples parámetros de manera simultánea en una sample, making it a powerful analytical technology.
muestra, lo que la hace ser una tecnología analítica It is currently used in the clinic, for the diagnostic
de gran alcance. En la actualidad es empleada en la of hematological and immune diseases, as well as in
clínica, para uso diagnóstico de enfermedades basic research, in the development of complex
hematológicas e inmunes, así como en la experiments for the understanding of studies related
investigación básica, en el desarrollo de to health. Therefore, it is crucial to consider the
experimentos complejos para la comprensión de requirements for the design of the antibody panel,
estudios referentes a la salud. Por lo que es the handling of the samples and the optimization of
importante tomar en cuenta los requerimientos the cytometer settings to obtain reliable and
necesarios para el buen diseño del panel de accurate results.
anticuerpos, el manejo de las muestras y la
optimización de los ajustes del citómetro para
obtener resultados confiables y precisos.
Palabras claves: citometría de flujo, fluoróforos, Keywords: flow cytometry, fluorophores, cellular
parámetros celulares, muestra, optimización. parameters, sample, optimization.
Fluoróforos
1. Sistema de fluidos.
Figura 2. Componentes de un citómetro. Se indica los tres sistemas que componen a un citómetro, así como el flujo del procesamiento
de la señal y la detección.
Hoy en día existen tres mecanismos para lograr • El primer mecanismo de alineación utilizado es
la alineación o enfoque de las células o partículas a el enfoque hidrodinámico, que consiste en la
estudiar al momento de pasar por el punto de inyección de la muestra en el centro de una
interrogación. corriente, conocida también como fluido
envolvente y este puede ser agua o una solución
© 2022 Mensaje Bioquímico. Todos los derechos reservados. ISSN-0188-137X
Comité Editorial: González Andrade, M.; Hernández Alcántara, G.; Martínez González, J.J.;
Meraz Cruz, N.; Ramírez Silva, L.H. y Vilchis Landeros, M.M.
Publicado por el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina; UNAM.
70 Patiño-Uriostegui, et al. Mens. Bioquim. 46 (2022): 67-77
Figura 3. Sistemas de alineación de la muestra y representación de cada tipo de enfoque. A) Enfoque hidrodinámico el cual esta
dado por el fluido envolvente. B) Enfoque acústico, la alineación esta dada por ondas sonoras. C) Enfoque microcapilar.
La óptica de colección consiste en lentes y función, que se encuentre teñida con un colorante
filtros ópticos que permiten que las señales fluorescente o fluoróforo sensible a la fuente de luz
luminosas se dirijan a los detectores adecuados. Un (4) (Figura 2B).
lente de colección se encarga de dirigir la luz
desviada frontalmente por la célula (FSC, por sus 3. Sistema electrónico
siglas en inglés “forward scatter”) hacia el detector
correspondiente, mientras que otro lente se encarga Las señales luminosas generadas cuando el láser
de dirigir la luz desviada lateralmente (SSC, por sus incide en la célula son recolectadas por detectores
siglas en inglés “side scatter”) al detector de luz, que traducen las señales luminosas a señales
comprometido (5). electrónicas (2). Los dos tipos principales de
detectores luminosos son los fotodiodos de silicón y
La membrana celular produce una desviación de los fotomultiplicadores. Los fotodiodos de silicón
luz con ángulo pequeño de 0.5 a 5° con respecto al son utilizados principalmente para detectar la
eje del láser, conocida como dispersión frontal o dispersión de luz frontal (FSC), la cual es una señal
FSC que refleja el tamaño de la célula. Por otro fuerte y los fotomultiplicadores, o PMT por sus
lado, la luz que se interna dentro de la célula, se siglas en inglés ”Photomultiplier tubes”, por ser
encuentra con componentes intracelulares que más sensibles a la luz son utilizados para captar
desvían la luz en cualquier ángulo, esto se conoce señales más débiles, como la dispersión lateral
como dispersión lateral o SSC y nos proporciona (SSC) y fluorescencia (6).
información de la complejidad de las células, la
dispersión de luz que se toma en cuenta para Aplicaciones de la citometría de flujo
calcular el parámetro SSC es la que tiene un ángulo
de aproximadamente 90° (5) (Figura 4). La citometría de flujo nos permite evaluar
diferentes parámetros biológicos en las células de
manera individual, evaluando tantos parámetros
como anticuerpos se dispongan, teñidos con
distintos fluoróforos en una misma célula, estos los
podemos clasificar en 5 parámetros (Figura 5).
Figura 5. Aplicaciones de citometría de flujo. La figura nos describe algunas de las aplicaciones mas relevantes, que se realizan por
citometría de flujo.
celular y su relevancia en la pregunta biológica, de con un anticuerpo irrelevante (isotipo) que está
esta manera podemos igualar las intensidades de marcado con el mismo fluoróforo.
fluorescencia, otorgándole al antígeno que se
encuentra en menor proporción un anticuerpo • Controles de fluorescencia menos uno (FMO)
conjugado con un fluoróforo más brillante y al
antígeno de mayor expresión seleccionar un Los controles FMO están diseñados para
anticuerpo con un fluoróforo menos brillante (3). Es identificar los efectos del traslape de espectros de
de suma importancia asegurarse que los fluoróforos otros fluorocromos en el detector de interés y nos
seleccionados se pueden excitar con los laser que sirve para situar la región positiva del marcador de
cuenta el citómetro a utilizar y verificar el espectro interés (12). Un control FMO contiene todos los
de emisión de cada uno de los fluoróforos, buscando fluoróforos en un panel, excepto el que se está
aquellos que en el espectro de emisión se evaluando (12). Por ejemplo, en un panel de tres
encuentren lo más alejados uno del otro, entre colores (CD3-FITC, CD4-PE, CD8-APC) hay tres
menos sea el traslape de los fluoróforos a usar, se controles FMO por separado, uno de los controles
garantiza una mejor resolución de la señal de sería el Control CD3-FMO que estaría marcado con
fluorescencia y por lo tanto resultados confiables. CD4-PE y CD8-APC, con excepción de CD3-FITC;
el control CD4-FMO contiene CD3-FITC y CD8-
B. Controles en un experimento APC excepto CD4-PE y por último el control CD8-
FMO marcado con CD3-FITC y CD4-PE a
Otro punto importante e indispensable es la excepción del CD8-APC, así como se muestra en la
preparación de los controles del experimento, ya tabla 2.
que estos sirven para optimizar los ajustes de la
adquisición en el citómetro, así como para la Tabla 2. Panel de 3 colores y control de fluorescencia menos
interpretación y presentación de los resultados (10). uno (FMO). Se muestra un panel de 3 colores con sus
respectivos controles FMO, donde cada control contiene el panel
de marcaje excepto el que se esta midiendo.
Los controles se deben aplicar a cada uno de los
experimentos que se realicen para lograr una
evaluación precisa. Estos controles son:
• Control de autofluorescencia
- La autofluorescencia debe ser la misma para Algunas de las sustancias más usadas para
las poblaciones negativa y positiva usadas para permeabilizar es el Triton X-100, saponina y NP40,
el cálculo de la compensación en cada y entre los agentes usados para fijar se encuentra el
detector. formaldehído, paraformaldehído y etanol.
Figura 6. Adquisición de la muestra. El diagrama nos muestra el flujo de trabajo para la adquisición de la muestra, así como la
realización de los ajustes adecuados en los detectores a usar, para la correcta compensación.
Figura 7. Tipos de gráficas. La figura representa una población de células marcadas con anticuerpos CD44, CD24 y su representación
en los diferentes tipos de gráficas usadas en citometría de flujo: gráfica de puntos, pseudocolor, zebra y densidad.