Tema 4

Técnicas de identificación de
poblaciones celulares
4.1. Citometría de flujo: características

Se trata de forzar a una suspensión de células u otras partículas incluidas en un

flujo de líquido isotónico a pasar, alineadas y de una en una, por delante de uno
o varios detectores capaces de recoger y medir sus diversas características
físicas y/o químicas, a la vez que se las ilumina con un haz de luz,
habitualmente un láser.
 4.1. Citrometría de flujo

La citometría de flujo es una técnica de análisis de poblaciones celulares en

suspensión.
Las características analizadas por la citometría
de flujo son el reflejo de dos grupos de
parámetros:
• Los parámetros derivados de la luz que se dispersa al
incidir sobre la célula o partícula. Se relacionan con el
tamaño y la granularidad.
• Los parámetros asociados con la luz generada como
consecuencia de la presencia de fluorocromos sobre la
célula o partícula (natural o artificial).
La TABLA 4.1 resume algunos parámetros medibles por citometría de flujo.
 Preparación de suspensiones celulares

La suspensión celular que se va a analizar mediante citometría de flujo debe

cumplir una serie de requisitos:

üSer una suspensión representativa

üSer una suspensión de alta calidad, pocos agregados y bajo coeficiente

de variación.

üSer una suspensión que conserve las características celulares.

üSer una suspensión que contenga suficiente muestra celular.

Las suspensiones celulares se pueden preparar a
partir de la disgregación de material fresco.
Cuando el tejido es sólido métodos
mecánicos o enzimáticos basados en tripsina,
proteasas, colagenasas, hialuronidasas o mezclas.

Si se pretende analizar el
inmunofenotipo de superficie, se deberán
emplear métodos que aseguren que los
antígenos celulares no son destruidos
por el procedimiento.
El inmunofenotipo por
citometría de flujo posibilita el
diagnóstico diferencial entre
las células plasmáticas
normales o reactivas y las
neoplásicas, así como la
identificación de la expresión
de anticuerpos relacionados
con el pronóstico de la
enfermedad.
 4.2. Funcionamiento
La suspensión de células se conduce mecánicamente
hasta una sección que la convierte en una fina
corriente de fluido que, finalmente, se dispersa en
unas microscópicas gotitas sobre las que incidirá un
haz de luz láser.

Cada célula dispersa esta luz en varias direcciones, y diversos fotodiodos y

tubos multiplicadores la recogen. Con base en esta dispersión de la luz se
cuantifican dos parámetros físicos de las células:

• Forward scattering (FSC) (dispersión frontal a 0 grados). Tamaño

• Side scattering (SSC) (dispersión lateral a 90 grados). Complejidad,
superficial y granularidad
Si estas células han sido incubadas con anticuerpos específicos
de los diferentes marcadores de membrana conjugados con
fluorocromos, emitirán luz.

Un citómetro de flujo puede tener hasta 6 canales que permitan

detectar 6 fluorocromos de manera simultánea.
Ventajas y desventajas

Las principales ventajas de la Las desventajas y

citometría frente a otros métodos limitaciones de la
que usan fluorocromos son: su citometría tienen que ver
objetividad, su elevada con los costes de
sensibilidad, la velocidad de instrumentación y la
análisis y la posibilidad de imposibilidad de visualizar
efectuar mediciones simultáneas las células analizadas.
sobre una sola célula, así como
una separación celular en
los sorters.

https://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDrWo4
 Unidad 4
Segunda parte
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema hidráulico

Conduce la suspensión de células a una velocidad

constante y controlada a través de una cámara
de flujo.

Está formado por un capilar por que pasa el

líquido isotónico

Las células y el líquido isotónico pasan al mismo

tiempo por el capilar, permitiendo que circulen
cada célula una a una.
 Sistema de iluminación

Luz láser con longitudes de onda conocidas:

- Las longitudes de onda conocidas en citometría de flujo son:

- 488 : emisores de argón con luz monocromática.
- 568
- 630
- 647

Sistema óptico

Este sistema va a enfocar la iluminación : la que se dispersa y la que

emite por medio de la fluorescencia emitida.

Está formado por:

1. Fluorescencia: Lo hace a 90 grados.
2. Señal de luz a 90 grados
3. Dispersión de la luz hacia delante.
4. Filtros de absorción o de interferencia
Sistema electrónico

Proporciona una iluminación de intensidad constante, detectando

y amplificando la respuesta de las células en forma de pulso
fluorescente durante microsegundos.

Fotomultiplicadores:
Fotodetectores:
detecta la luz
detecta la dispersión
dispersada
lateralmente frontal de la luz
Sistema de análisis de datos

Permite obtener los datos del análisis a tiempo real de las

subpoblaciones seleccionadas.

Representación mediante histogramas

 El análisis de los datos obtenidos por
citometría
Análisis de datos basados en:

- Cantidad de células (%) fluorescentes

- Media de intensidad de fluorescencia

TENEMOS LOS DATOS Y

AHORA QUE???

HACEMOS COMPARACIONES E NUESTRAS

MUESTRAS CON OTROS CONTROLES.

GRÁFICOS O TABLAS
 Importante:
Todos los datos son almacenados en un
formato estándar y que podemos
obtener estadísticas sobre el resultado

Debe existir una serie de filtros en esas

estrategias para que cualquier software
pueda leer o interpretar los datos más
genéricos
4.4.2. La presentación de los resultados
Histogramas de frecuencias:
- Histogramas monoparamétricos: se representan en cada valor de X (intensidad
de fluorescencia y el número de células que emiten esa intensidad)

- Histogramas biparamétricos: Dos parámetros : la función de la intensidad con

respecto a cada parámetro.

Diagramas de dispersión o dot-plots:

Se producen en aquellas células que
tienen unas características similares
en función del tamaño y emisión de
fluorescencia.
Diagramas de contornos o contour –
plots: Representación en 3D
configurada por dos parámetros.

Nº células con determinado

parámetro
Aplicaciones de la Citometría de Flujo
Aplicaciones por ámbito

Las aplicaciones se desarrollan en distintos

ámbitos, entre los cuales destacan:

La rutina clínica.

La investigación clínica.

La investigación básica.

La biotecnología.

La investigación del medio ambiente.

La microbiología, tanto clínica como básica.

 Tipos de Análisis

Mediante citometría de
flujo se pueden
analizar:

A escala
A escala molecular: supracelular:
proteínas, ácidos organismos
nucleicos e pluricelulares,
inmunocomplejos. esferoides e
hibridomas.

A escala celular:
A escala subcelular:
protoplastos
viriones, liposomas,
vegetales, células
cromosomas, animales, levaduras
orgánulos y núcleos.
y bacterias.
Determinación de poblaciones celulares
en sangre periférica
Identificación y clasificación de las células tanto normales como patológicas se
emplean:

Antígenos que reaccionan a los

anticuerpos monoclonales
marcados con fluorocromos

Para la identificación y clasificación de las células

1. El inmuno-fenotipado de superficie permite identificar subpoblaciones

celulares mediante anticuerpos monoclonales de especificidad conocida.
Proporciona información sobre el linaje celular, el estadio de maduración
hematopoyética.

2. La detección de antígenos intracelulares requiere el uso de técnicas de

permeabilización que preserven los epítopos que se quiere determinar.
MONITORIZACIÓN DE LOS LINFOCITOS
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida, inmunodeficiencias
primarias, monitorización de enfermedades autoinmunes o el
seguimiento de trasplantes de médula ósea.

Linfocitos T totales: se
utiliza un anticuerpo anti Linfocitos B: anticuerpo
monoclonal anti CD19.
CD3.
 Fenotipaje de leucemias y linfomas

Mejoran la precisión en
Estudios de los
el diagnóstico :
marcadores de las
maduración y linaje de
leucemias linfoides
células malignas

Técnicas convencionales no
tienen suficiente Importancia de citometría de
sensibilidad para flujo:
diagnosticar - Detección de pequeñas
tempranamente pacientes poblaciones celulares en
que se pueden beneficiar leucemias agudas precoz.
de trasplante.
La leucemia es un cáncer de las
células primitivas productoras de
sangre. Con mayor frecuencia, la
leucemia es un cáncer de los glóbulos
blancos, pero algunas leucemias
comienzan en otros tipos de células
sanguíneas.

•Leucemia linfocítica aguda (LLA)

•Leucemia mielógena aguda (LMA)
•Leucemia linfocítica crónica (LLC)
•Leucemia mielógena crónica (LMC)
Citometría de flujo tiene el grado
de sensibilidad para detectar
células plasmáticas tumorales

Muestra total de sangre o

médula ósea (lisis y fijación).

Algoritmo: serie de La separación por gradiente de

reglas que se siguen densidad solo se hace en
para determinar algo aquellas que sean muestras
contaminadas (células
necróticas)
Estudios síndromes
linfoproliferativos.
INMUNOFENOTIPO: Algoritmo
¿Qué más podemos medir en la citometría de
flujo?

Expresión de
inmunoglobulinas ayuda a:

Establecer ratio de células

plasmáticas sanas / patológicas
Fenotipaje de otras poblaciones celulares

Marcaje de
ETAPAS antígenos con
anticuerpos
conjugados con
fluorocromos
Concentraciones celulares:
Líquidos biológicos

Dispersión celular: lavado

bronco-alveolar, esputo inducido

Disgregación mecánica y
enzimática

Estimulación celular controlada

Inmunofenotipado de superficie se puede
aplicar en:

Detección de leucocitos activados

Detección de aloanticuerpos o
autoanticuerpos

Diagnóstico de deficiencias en moléculas

de adhesión (Glucoproteínas)

Identificación de basófilos circulante

- Aloanticuerpo: anticuerpo producido en un individuo que está dirigido
contra antígenos eritrocitarios que él carece, presentes en otro individuo de
su misma especie.

- Autoanticuerpo: anticuerpo producido en un individuo que está dirigido

contra antígenos que expresan sus propios eritrocitos
• Cuantificación de moléculas
Desarrollado diferentes técnicas con fines diagnósticos.

1. Microesferas con distintas intensidades de fluorescencia para detectar y

cuantificar proteínas solubles.
Ventaja: Cuantificar múltiples proteínas al mismo tiempo (1 sola
muestra).
q Posibilidad de análisis proteínas (solubles e intracelulares).
Como por ejemplo citoquinas o factores de crecimiento

q Diagnóstico de enfermedades infecciosas (detección de anticuerpos

relacionados con diversos patógenos)

q PAK (Son kits con partículas que permiten realizar ensayos ante
det. Enfermedades cardiacas o enfermedades autoinmunes)

1.Cuantificación de proteínas

2.Cuantificación de anticuerpos
u 1. Cuantificación de proteínas u 2. Cuantificación de anticuerpos

- Cada microesfera utilizada en el Se puede aplicar para detectar

laboratorio tiene una intensidad
de fluorescencia característica y
recubierta con anticuerpos
específicos (frente a una proteína
determinada)
anticuerpos frente a los agentes
patógenos.
Se le conoce como MULTIPLEX BEAD
ASSAY = Ensayo de perlas múltiples

- Luego se añade un anticuerpo de

detección que reconoce otro Permite determinar la respuesta
epítopo de la proteína que se va a humoral inducida
analizar conjugada con la
ficoeritrina (fluorocromo
compuesto que absorbe el color Se emplean microesferas recubiertas
rojo). de antígenos purificados.
Cada microesfera tiene una
intensidad de fluorescencia diferente
 Proteínas
u 1. Preparar las microesferas
recubiertas de anticuerpos específicos
de las proteínas que quiere
determinar en la muestra problema
u 2. Incubar la muestra problema y los
controles para realizar la curva
patrón.
u 3. Incubar la mezcla de anticuerpos
con la ficoeritrina (fluorocromos)
u 4. Introducimos las muestras en el
citómetro de flujo.
u 5. Analizar los archivos en el programa
Anticuerpos
u 1. Preparar las microesferas
recubiertos de los antígenos
específicos
u 2. Incubar la muestra problema
y los controles
u 3. Incubar las muestras de
sueros a la dilución adecuada
con las microesferas. Si hay
anticuerpos específicos (se
fijaran)
u 4. Lavar las microesferas
u 5. Añadir el reactivo de
detección con la ficoeritrina
u 6. Lavar microesferas
u 7. Meter las muestras en el
citómetro.
8. Analizar los archivos
https://www.youtube.com/watch?v=YvzxnnwZD9c

https://www.youtube.com/watch?v=zi6M
EkKJwNs
4.6. Otras técnicas de separación celular

4.6.1. Panning para linfocitos

Para ello se utilizan placas de plástico

tapizadas con anticuerpos específicos que se
unen selectivamente a los linfocitos B.

Para la separación de poblaciones de

linfocitos mediante panning será necesaria la
utilización de placas sensibilizadas con
anticuerpos específicos de los marcadores de
superficie de las sub ¡poblaciones que se
quiere separar (por ejemplo, anti-CD4 y anti-
CD8).
4.6.2. Separación celular inmunomagnética

La técnica más conocida es la

denominada Magnetic Activated Cell
Sorting (MACS) que utiliza partículas
superparamagnéticas de 50 nm que
permiten el marcado magnético de las
células con anticuerpos.

üSelección positiva: la población

deseada es marcada magnéticamente y
aislada en la fracción celular retenida.

üSelección negativa: eliminación de las

células no deseadas mediante marcado
magnético y elución de la fracción que
contiene la población deseada no
marcada.
SEPARACIÓN CON MICROESFERAS DE PLÁSTICO NO
MAGNÉTICAS

Incubar la suspensión celular

con microesferas durante 10-20
min a T º ambiente.

Durante la incubación las

células se unirán en
microesferas.

Filtración para que pase las

células no unidas a la
microesfera.

Añadimos una sustancia tampón

para separar las células de las
microesferas.
Técnica de inmunotoxicidad

Capacidad lítica del complemento para eliminar las

poblaciones no deseadas

Células que queremos eliminar se marcan con anticuerpos

monoclonales específicos + complemento (de conejo)

Incubación durante 1h a 37 º C. Las células lisadas por el

complemento se eliminan con lavados (x2).

VENTAJAS: Rápida, barata, no causa daño a las células y

buen rendimiento (eliminación casi del 100%)

USOS: Purificación celular y enriquecimiento de poblaciones

celulares.
Fin del Tema 4. Ahora a examen!!!