ASPECTOS BÁSICOS DE

INMUNOCITOMETRÍA DE FLUJO
 Citometría de Flujo
Célula Medida En movimiento

Medida de las propiedades de las células

mientras están en un flujo de líquido
Detección

Identificación

Contaje

Suspensión Celular
Ac. c /Fluorocromos

La citometría de flujo se inició en la década de los 60 como un

importante avance en el proceso de contar y medir el tamaño de
partículas o células en poblaciones no homogéneas.
La inmunocitometría de flujo es una metodología
que permite obtener información sobre la
cantidad y las características de una mezcla de
células en suspensión; que al recibir una señal
luminosa de una fuente de luz láser le producen a
ésta modificaciones, que se corresponden con
varias de las características celulares.
Una reacción de inmunofluorescencia añade
otras señales provenientes de anticuerpos
marcados con fluorocromos que identifican
antígenos de estas células.
 ESQUEMA
BASICO
DE UN
INMUNOCITOMETRO
DE FLUJO
Citometría de Flujo

Marcación con
anticuerpos
monoclonales

Mezcla de células
Citometría de Flujo

La presión ejercida por una columna

de fluido obliga a las células a
“enfilarse” de a una
Citometría de Flujo

Columna de células
Citometría de Flujo

Láser

Detector
Tiene muchas aplicaciones, que abarcan desde el diagnóstico
clínico en:
• Hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje
reticulocitario, análisis de médula ósea.
• Farmacología: estudios de cinética celular.
• Inmunología: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulación
linfocitaria.
• Oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento.
• Microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a
antibióticos.
• Genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

… hasta complejos proyectos de investigación en el campo de

la biomedicina y de la biología celular en general.
 ESQUEMA FUNCIONAL BÁSICO
Difracción …… Frontal (FSC)/Lateral (SSC)
Luz Incidente Célula
Fluorocromo ……. Color según Fluorocromo

(Intensidad/Amplitud) Fotosensores (Fotones) Emisión Lumínica

Señal Eléctrica (Voltajes) → Señal Digitalizada → Computadora

 COMPONENTES DEL CITOMETRO DE FLUJO

Sistema Bombeo Líquido: Convierte la suspensión celular en

un Flujo Laminar de gotas (células) individuales que van al punto de
incidencia de luz en la cámara de flujo

Sistema Óptico-Luminoso: Fuente de la luz que incide sobre las

células y recoge las señales difractadas y fluorescentes, por un
grupo de filtros, lentes, y fotosensores.

Sistema Electrónico-Informático: Convierte las señales

digitales que son integradas para su visualizacion y presentación
gráfica

El sistema electrónico convierte todo en

señales digitales para almacenar en la
computadora
 DISPERSION LATERAL

DISPERSION HACIA ADELANTE

COLOR E INTENSIDAD
DE LA(S) FLUORESCENCIA
 La señal de dispersión
frontal (FSC) es detectada en
la dirección del haz de láser,
mientras que la dispersión
lateral (SSC) es recolectada
a 90ª de la dirección del haz
de láser.

Side Scatter (SSC) Forward Scatter (FSC)

EL USO DE VARIOS LÁSER Y MÚLTIPLES FILTROS Y LENTES PERMITE
DETECTAR Y ANALIZAR SIMULTÁNEAMENTE VARIOS PARÁMETROS
CELULARES CONJUNTOS

1 ó 2 LÁSER + 4 LENTES → 6 PARÁMETROS + FSC + SSC

LÁSER ADICIONAL + 6 LENTES → 15 PARÁMETROS + FSC + SSC

 DIGITALIZACIÓN Y
ALMACENAMIENTO
DE INFORMACIÓN

Los pulsos de “Voltaje”(señales analógicas) son

transformadas en señales digitales.
Las señales digitales se almacenan en un
soporte informático en modo de listado
(almacenamiento multiparamétrico).

Presentados como Histogramas y/o Diagramas

Biparamétricos
 Representación biparamétrica en 2D
Diagrama de puntos/dot plot

Representación
simultánea de dos
parámetros X e Y.
-+
X representa el valor
de la señal de un
FL-2 ++
parámetro.

Y representa el valor
de la señal del otro. -- +-
FL-1
El diagrama de puntos
representa las distintas
poblaciones celulares.
Cada punto representa la
combinación de valores
correspondiente a una
célula.
Una población celular
queda representada como
una nube de puntos,
manera fácil de identificar
poblaciones raras.
 SEPARACIÓN CELULAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO

LA ASIGNACIÓN DE CARGAS
ELÉCTRICAS DIFERENCIALES A
LAS CÉLULAS DETECTADAS,
SEGÚN EL TIPO DE SEÑAL
EMITIDA PERMITE LA
SEPARACIÓN, AISLAMIENTO Y
ALMACENAJE DE GRUPOS
CELULARES ESPECĺFICOS
DETERMINADOS

F.A.C.S.
(Separador Celular Activado
por Fluorescencia)
 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
La CMF presenta múltiples ventajas frente al microscopio de fluorescencia y la
inmunocitoquímica, como:
• Posibilidad de empleo de múltiple marcaje frente a uno solo de la citoquímica y
la microscopia de fluorescencia.
• Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de
tiempo(>5000/seg).
• Posibilidad de cuantificación por medio de los canales de medición de
fluorescencia.
• Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar cantidades mínimas y
caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales.
• Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epítopos celulares.
• Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo
celular.
• Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla
utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad.

DESVENTAJA: La citometría de flujo no aporta información sobre

la distribución espacial de las células estudiadas.
 PROBLEMAS CLÍNICOS ABORDABLES
MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO

• Estudio de la heterogeneidad de las células

sanguíneas o de otros tejidos.
• Neoplasias, Tipificación de leucemias / linfomas
inmunodeficiencias congénitas y adquiridas.
• Monitorización del efecto de terapia
inmunosupresora en pacientes trasplantados.
• Estudio de la ploidía y proliferación celular.
• Estudio de la apoptosis.
• Cuantificación de concentraciones de
moléculas solubles.
•Purificación de células antígeno-específicas.