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Universidad Nacional de Río Cuarto

Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales


Departamento de Biología Molecular

ASIGNATURA LABORATORIO II-(2146)

TEMA: AUTOMATIZACION EN HEMATOLOGIA

El hemograma es uno de los exámenes de laboratorio más solicitados, ya que no solo


constituye una de las formas de estudio inicial del paciente permitiendo una evaluación global
del sistema hematopoyético, sino también por su valor como control evolutivo y terapéutico.

Las determinaciones básicas que constituyen el hemograma automatizado incluyen:

 Recuento de leucocitos (WBC)


 Diferencial leucocitario (DIFF) de 3 o 5 poblaciones  valores Absolutos (#) y Relativos
(%)
 Recuento de eritrocitos (RBC)
 Determinación de la concentración de Hemoglobina (Hb)
 Hematocrito (Hto)
 Índices hematimétricos (VCM / HCM / CHCM)
 Plaquetas (PLQ)

La evolución ha sido grande y vertiginosa hacia los últimos años, desde el método manual
hasta los equipos más sofisticados de la actualidad, que cuentan con tecnologías combinadas
de análisis, ingeniería y software innovadores que permiten mayor eficiencia y seguridad en
el informe de resultados.

Generación de Autoanalizadores según avance tecnológico:

1° Generación  Hemograma Manual

2° Generación  Hemograma Semiautomatizado

3° Generación  Hemograma Automatizado con Recuento e histogramas de glóbulos rojos


(GR), Plaquetas (Plq) y Glóbulos blancos (GB) con Diferencial de 3 poblaciones de Leucocitos.

4° Generación  Hemograma Automatizado con Recuento y dispersograma de GB, y


Diferencial de Leucocitos en 5 poblaciones

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La aplicación de nuevas tecnologías ha permitido la incorporación de nuevos parámetros,
además de los recuentos celulares:

 índices hematimétricos (HCM/ CHCM/RDW)


 índices plaquetarios (VPM)
 ALARMAS  GB frágiles/ GR resistentes a la lisis/ Linfocitos atípicos/ Eritroblastos/
Blastos/ células inmaduras/ granulaciones tóxicas/ alteraciones en la morfología de
GR, etc
 Reticulocitos / Fracción de reticulocitos inmaduros (FRI)/ Índices reticulocitarios
 % de GR Hipocrómicos

Los beneficios de la automatización implican:

 mejora en la productividad, permitiendo procesar grandes volúmenes de muestras en


menos tiempo y rapidez en la obtención de resultados
 mayor precisión, exactitud y reproducibilidad de los resultados, ya que se utilizan
calibraciones y controles de calidad tanto internos como externos
 reducción de errores analíticos
 estandarización del trabajo
 la incorporación de nuevos parámetros que permiten ampliar la capacidad diagnóstica
y pronóstica (como la incorporación de los Índices hematimétricos y plaquetarios, %
de GR Hipocrómicos, Reticulocitos, incorporación de sistema de Alarmas, etc)
 disminución del número de frotis a revisar al microscopio
 indicación de alarmas que orientan a revisar en el frotis
 reducción de costos operativos
 aumento en bioseguridad
 competencia en un ambiente globalizado

Todo esto lleva a una mejora integral del resultado, lo que permite trabajar con un alto
nivel de confianza.

Limitaciones de la automatización:
 la metodología varía con el tipo de instrumento
 costos de mantenimiento: reactivos, servicio técnico, controles de calidad
 el personal que lo manipula debe conocer operatividad y cuidados de rutina
(capacitación del personal)
 existen interferencias (ej: lipemia marcada, presencia de esquistocitos,
pseudotrombocitopenia por plaquetas gigantes, crioaglutininas, presencia de
eritroblastos, etc) que el personal debe estar preparado para identificar

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Actualmente existe un elevado número de Autoanalizadores, todos ellos de gran calidad,
que se diferencian por un mayor o menor grado de automatización o de tecnologías
combinadas.
La elección de un determinado tipo de autoanalizador depende, entre otros factores, de
los requerimientos y necesidades propias de cada laboratorio.

Los primeros contadores hematológicos fueron SEMIAUTOMATIZADOS, requerían de una


dilución manual previa al recuento celular (a cargo del operador) y estaban basados en el
principio de la IMPEDANCIA ELÉCTRICA, solo eran capaces de realizar conteos electrónicos
globales de eritrocitos y leucocitos.
Avances posteriores en la automatización permitieron la discriminación de la población de
leucocitos en tres poblaciones (linfocitos, células medias y neutrófilos)
Los diversos contadores multiparamétricos actuales del mercado además del uso de la
FOTOMETRÍA para la Hemoglobina (Hb), se basan en PRINCIPIOS ELÉCTRICOS, ÓPTICOS o en
ambos, asociados o no a MÉTODOS QUÍMICOS (coloración histoquímica o destrucción
química dirigida con preservación de tipos celulares específicos), INMUNOFLUOROMETRÍA
(células marcadas con Ac monoclonales asociados a fluorocromos), FLUOROMETRÍA
(marcación con fluorocromos sin la intervención de Ac monoclonales), entre otros, para el
conteo de los diferentes tipos celulares (Eritrocitos, Leucocitos, Plaquetas en las versiones más
básicas, y Reticulocitos en los más avanzados) como así también la diferenciación de
leucocitos en cinco poblaciones (Neutrófilos, Eosinófilos, Basófilos, Linfocitos y Monocitos).
Cada fabricante utiliza una tecnología patentada (principio/fundamento), y varía según la
marca y el modelo.

TECNOLOGÍAS DE LOS SISTEMAS AUTOMATIZADOS

 Determinación de la Hb MEDICIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA


 Determinación de poblaciones celulares:
o IMPEDANCIA ELÉCTRICA
o DISPERSIÓN ÓPTICA
o RADIOFRECUENCIA
o Coloración o marcación:  CITOQUÍMICA (ej: Peroxidasa)
FLUOROCROMO (colorantes para ADN/ARN:
yoduro de propidio /polimetina)
INMUNOMARCACIÓN (CD3/CD4/CD8, CD61)

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DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA HB

Es el método más uniforme en todos los instrumentos, se basan en convertir la Hb en un


pigmento final (cambia según la marca), y su posterior medición espectrofotométrica

 Método de la cianmetahemoglobina (Beckman Coulter)

Convierte la Hb en cianmetahemoglobina (HiCN) y la lectura espectrofotométrica se


realiza alrededor de 540 nm

Requiere del uso de reactivo tipo Drabkin que contiene cianuro de potasio y ferrocianuro
de potasio. Por lo tanto el efluente residual del instrumento puede no cumplir con los
estándares ambientales de algunos países.

 Métodos no ciamidas: métodos alternativos, libres de cianuro


o Laurilsulfato de sodio (LSS) (Advia Sysmex)
o Azida Sódica (Cell-Dyn)

Estos métodos además de ser más seguros (por ser libres de cianuro), de tener buena
correlación con el método de HiCN y de tener menor interferencias con las muestras, son
promisorios en cuanto a futuras mejoras de calibración y validación de nuevas mediciones
de Hb.

DETERMINACIÓN DE CÉLULAS

IMPEDANCIA ELÉCTRICA (principio Coulter)


El método eléctrico o impedancia eléctrica, descrito por Coulter en 1956 es el más
empleado en sistemas automatizados de recuento celular sanguíneo. Se basa en la propiedad
de las células de NO ser conductoras de la electricidad.
Las células suspendidas en una solución salina isotónica conductora, se hacen pasar
mediante un sistema de arrastre continuo, a través de un orificio (orificio de apertura) por un
tubo de aspiración, inmerso en dicha solución. Por dentro y fuera de dicho orificio se disponen
electrodos, que establecen una diferencia de potencial. Cuando una célula pasa por el orificio
de apertura, se genera una resistencia entre ambos electrodos, que se registra como un
impulso.
Se utiliza un Enfoque Hidrodinámico para conseguir una trayectoria uniforme de las
células por el centro de la región sensible del orificio de apertura (flujo en hilera, que fluyan
por el flujo central sin mezclarse con el líquido de arrastre). Con esto se evita que las células
pasen por el borde de orificio o que, una vez que atravesaron éste, retrocedan e interfieran

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con la lectura de las células que le siguen. Esto mejora la exactitud y reproducibilidad del
recuento y previene la generación de pulsos anormales.
El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular (n° de
partículas que pasan a través de la apertura). Y puesto que la amplitud de cada impulso es
directamente proporcional al tamaño de cada partícula, es posible determinar el volumen de
cada célula.

FIG.1. Principio de Impedancia para el recuento celular.

FIG.2. Impedancia eléctrica.


La amplitud de los pulsos es
directamente proporcional
al tamaño de la partícula
(volumen celular)

El recuento de células se hace directamente por medio de la relación de recuento efectuado


en un tiempo y volumen pre-establecido de la muestra.
Los datos obtenidos, son expresados en un gráfico de histograma para cada población celular,
obtenido a partir del n° y tamaño de los pulsos. La distribución de los mismos permite
identificar las poblaciones celulares:

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A)

B)

C)

FIG. 3. Gráficos de histograma por impedancia de leucocitos (A), eritrocitos (B) y plaquetas (C)

Para el recuento de glóbulos blancos (WBC), se utiliza un reactivo lisante, que rompe
los GR y permea (crea poros) en la membrana de los leucocitos, con difusión del citoplasma
de los mismos, quedando la membrana colapsada, pegada al núcleo (se mide volumen
nuclear). Este reactivo además acompleja la Hb (para su medición espectrofotométrica).

La muestra luego de ser aspirada, se distribuye en diferentes canales para efectuar cada
medición.

 CANAL Hb y WBC

MUESTRA + LISANTE + RVO HB  * Hb

*WBC + Diff3 (Li/Cel medias/Gran) + HISTOGR LEU

 CANAL DE PLQ y RBC

MUESTRA + DILUYENTE  *RBC + INDICES HEMATIMÉTRICOS + HISTOGR. RBC

* PLQ + HISTOGRAMA PLQ + INDICES PLQ

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DISPERSIÓN ÓPTICA (CITOMETRÍA DE FLUJO)

En los equipos considerados de 4° generación, vemos interactuar diferentes


tecnologías, que utilizan la citometría de flujo como nuevo fundamento de lectura.
Los métodos ópticos se basan en las alteraciones de la dispersión de luz generadas por
una célula al pasar por un campo óptico.
Las células se inyectan en una celda de flujo, donde son forzadas a pasar
individualmente (en fila india) a lo largo de una cámara de lectura, mediante la creación de un
flujo hidrodinámico (líquido isotónico, con fluido laminar del líquido envolvente), sobre la que
incide perpendicularmente un haz de luz (halógena/laser). Cada vez que una célula se
interpone en el camino óptico del haz de luz, produce una dispersión, que es captada por
detectores situados a diferentes ángulos, dependiendo del tamaño, y complejidad de cada
célula.
La citometría de flujo puede utilizarse como tecnología primaria o en combinación con
otros métodos, ya que si además éstas células se someten a una marcación (citoquímica/
fluorocromo/ inmunomarcación) se pueden identificar detectando la intensidad de dicha
marcación.

FIG. 4. Principio de Dispersión


lumínica (método óptico) para el
recuento celular

Los detectores se sitúan a diferentes ángulos:


 Dispersión frontal (Forward Scatter): tamaño
 Dispersión lateral (Side Scatter): complejidad (granularidad)
 Otros detectores (citoquímica/ fluorocromos)  identificación de Basófilos/
Eosinófilos /Reticulocitos (según la marca del autoanalizador)

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Además del tamaño y concentración de las células, permite analizar la complejidad de la
estructura celular (asociada a la granularidad y características del núcleo) y así diferenciarlas.
Esto es especialmente útil en el análisis de las poblaciones de leucocitos.

Los datos del recuento son representados en un gráfico dot-plot:

FIG.5. Lectura de un diagrama dot plot:

A: células de gran tamaño y escasa complejidad


B: células de gran tamaño y gran complejidad
C: células de pequeño tamaño y escasa complejidad
D: células de pequeño tamaño y gran complejidad

FIG. 7. Determinación de Eosinófilos (Eo) con


luz despolarizada a (90°). Los Eo se estiman
independientemente porque se superponen a
FIG.6. Recuento diferencial leucocitario los Neutrófilos. (Cell Dyn.)Tecnología MAPSS.
(autoanalizador Advia), usando dispersión óptica
(eje y) y tinción de Peroxidasa (eje x). Los Basófilos
se estiman independientemente porque se
superponen con los monocitos

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De esta forma la población de leucocitos se clasifica en 5 grupos: Neutrófilos, Eosinófilos,
Basófilos, Linfocitos y Monocitos:

A B

FIG. 8. Diagramas dot plot de leucocitos, con discriminación en 5 subpoblaciones


A) Advia B)Cell Dyn Ruby

Las plaquetas y eritrocitos también se pueden contar por este método (óptico), y los datos
obtenidos clásicamente se grafican en histogramas (como los vistos para impedancia):

A B

FIG. 9. Diagramas de histogramas


(método óptico) de plaquetas (A) y
eritrocitos (B)

El recuento de plaquetas ópticas es útil en aquellas situaciones especiales en las cuales el


recuento de impedancia puede tener interferentes y no ser fiable.

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RADIOFRECUENCIA/CONDUCTIVIDAD

Los contadores más completos de la Coulter poseen el sistema multiparamétrico de la VCS


(Volumen, Conductividad y Scatter)

 Volumen  impedancia
 Conductividad/ Radiofrecuencia  complejidad interna
 Scatter  dispersión de luz  tamaño/complejidad

El principio VCS evalúa simultáneamente el volumen, la conductividad y el Scatter


(dispersión) de la luz de la célula:

El volumen celular se determina por el clásico principio Coulter: impedancia en corriente


directa (baja frecuencia)

La conductividad celular se determina por la corriente alterna (radiofrecuencia/alta


frecuencia), que penetra en interior celular a través de su bicapa lipídica y emite señales
eléctricas compatibles con su composición interna (incluyendo la composición química y
volumen nuclear)

El Scatter de luz es la medida óptica de un haz de luz láser, que al incidir sobre la célula,
dispersa luz a medios ángulos (MALS) y representa la granulosidad de la célula determina
granularidad celular, lobularidad nuclear y características de superficie

A B C D

Volumen Conductividad Scatter


VCS

FIG. 10. Principio VCS (Beckman Coulter).


Evaluación del volumen (A), conductividad (B) y Scatter (C). El principio VCS asocia volumen,
conductividad y sactter (D)

Todos los fabricantes tienen un modelo base que utiliza impedancia. Los modelos
más complejos o avanzados utilizan impedancia concomitantemente con otros principios.

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En las versiones que incluyen otras tecnologías de medición, además de los dos canales
para HB/WBC y PLQ/RBC, pueden utilizar un tercer canal (o más) para una medición particular,
por ejemplo: identificación de Basófilos (Peroxidasa), identificación de Eo (luz despolarizada a
90°, tecnología MAPPS), tecnología VCS para la diff en 5 poblaciones, etc

 CANAL Hb y WBC
 CANAL DE PLQ y RBC
 3° CANAL  ejemplo: Diff VCS /Ba (peroxidasa)/Eo (luz desp 90°)  según
marca y modelo

MÉTODOS ADICIONALES:

 NRBC (células nucleadas de serie roja)actualmente aquellos equipos que los miden,
los cuentan automáticamente y se corrige el recuento de WBC

 RETICULOCITOS  Hay equipos que determinan reticulocitos con fluorescentes (Tiazol


naranja, Auramina O, Polimetina, Clorifosfina O, Acridina naranja) o con colorantes
supravitales (Oxazina 750, nuevo azul de metileno), dependiendo la marca.
Los reactivos fluorescentes tiñen los restos de RNA de la célula, identificándose
subpoblaciones de reticulocitos de acuerdo con la intensidad de fluorescencia (elevada, media
y baja).
Se obtienen valores porcentuales (%) y absolutos (#), algunos además pueden
determinar sus índices derivados: Fracción de Reticulocitos Inmaduros (IRF), Hemoglobina
Reticulocitaria (RHE), ancho de distribución de la Hb reticulocitaria.
La IFR es de especial interés ya que permite identificar con mayor antelación la
recuperación de la Médula Ósea post-trasplante
La RHE es de importancia en la detección precoz de la disminución de los niveles del
depósito de hierro.

 PLAQUETAS  las plaquetas pueden ser contadas por impedancia o por dispersión
óptica. Algunos equipos de 4° generación miden por impedancia, y cuando encuentran
una alarma realizan una medida por dispersión. Otros directamente miden por
dispersión. O ambas.
Las plaquetas reticuladas o inmaduras son plaquetas jóvenes que tienen alto contenido en
RNA que puede ser coloreado por un fluorocromo (como la auramina O) y ser determinado
por citometría. Es un parámetro usado para evaluar la trombopoyesis.

 Existen equipamientos que hacen marcado de extendidos automáticamente y otros


además pueden realizar el escaneo automático de extendidos, análisis de imágenes y
proyección en monitor a color y de alta resolución.

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FIG. 11. Análisis digital de la imagen.
Se basa en el reconocimiento de los leucocitos por análisis computarizado de las imágenes

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FIG. 12. Cuadro comparativo de 4 autoanalizadores y los principios de medición de diversos parámetros
hematológicos
Carbia C, Fink N, Lazarowski A. Informe automatización del hemograma: entre la ayuda, la confusión y la
controversia. XIX Congreso Argentino de Hematología, 2009.

ASPECTOS GENERALES DE LOS AUTOANALIZADORES

Básicamente hay cuatro fases para el análisis de una muestra de sangre en los diversos
contadores multiparamétricos:

1° FASE: ASPIRACIÓN Y DIVISIÓN DE LA MUESTRA


2° FASE: PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
3° FASE: DETERMINACIÓN ANALÍTICA DE LA CÉLULA O PARÁMETRO
4° FASE: PROCESAMIENTO DE LAS SEÑALES Y EMISIÓN DEL RESULTADO

FIG.13. Diagrama funcional simplificado de un sistema multiparamétrico de recuentos celulares.


Automatización en hematología. Nilda E. Fink. SAH. Hematología. Vol 9 N°1:4-16, 2005

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Los Autoanalizadores de última generación emplean escaso volumen de muestra (20-
250 uL) y en menos de 40- 60 seg suministran un informe completo.

Para el manejo de muestras, algunos poseen dos modos de procesamiento: Modo


Abierto (el operador pasa una a una las muestras manualmente, previa homogeneización) y
Modo Cerrado (carga de tubos con código de barras, pasaje de muestras automáticamente,
con autosamplers y agitadores).

Por lo general incluyen pantallas touch screen, conectividad y múltiples puertos, para
facilitar la entrada y salida de datos, mantenimiento remoto mediante internet y programas
de calidad.

Ciertos equipos han implementado el uso de reactivos concentrados para minimizar el


recambio de los mismos.

Algunos autoanalizadores son Equipos Modulares, con la posibilidad de acoplamiento


de dos o más contadores hematológicos, módulos preanalíticos, equipos para la tinción de
láminas y equipos para la visualización de las mismas, que permiten hoy en día automatizar
de forma completa todo el proceso para la elaboración de un hemograma completo.

Conocer y comprender las tecnologías actuales disponibles en el mercado, nos


permite, por un lado, trabajar mejor, informando con conocimiento acabado del tema
pudiendo sugerir nuevos parámetros indicadores de diagnóstico o tratamiento al cuerpo
médico; y además saber cuál es la oferta del mercado para comparar y elegir no bajo la presión
del oferente de turno sino bajo la premisa de las necesidades propias.

CONCLUSIONES

La automatización está establecida firmemente en el laboratorio de hematología.


Combina varios procesos en un solo sistema, disminuyendo el riesgo de error asociado a la
operatividad humana.

Tiene por visión disminución de costos operativos, mayor eficiencia, aumento de


productividad, a la vez que permite competir en un ambiente globalizado.

Los contadores automatizados, como cualquier otro instrumental de laboratorio,


deben ser manipulados de forma adecuada, esto requiere que sean Calibrados, que se realice
el Mantenimiento técnico Diario y Mensual adecuado y que su desempeño sea monitoreado
tanto por Control de Calidad Interno como Externo (PEEC).

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Comprender el principio y detalles técnicos del autoanalizador que se opera, así como
conocer interferentes, sus limitaciones, ventajas y desventajas, es de importancia para el
análisis de los parámetros medidos.

Para efectuar la validación o no de los resultados, se debe realizar un análisis no sólo


de los parámetros numéricos obtenidos, sino también de las gráficas correspondientes,
teniendo en cuenta a su vez datos del paciente (como edad, sexo, diagnóstico, etc) y en caso
de ser indicado con alarmas, realizar la verificación de la presencia de poblaciones
sospechosas al microscopio óptico. Además, se deben conocer y poner a punto técnicas
manuales que permitan verificar o solucionar parámetros espurios o discordantes en el caso
de ser necesarios.

A continuación, se presentan fotografías correspondientes a diferentes modelos de


contadores hematológicos disponibles en el mercado así como también dos modelos de
informes provistos por distintos equipos.

Además en la página del SIAL se podrá encontrar información complementaria, en


archivos pdf.

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EJEMPLO DE CONTADORES POR IMPEDANCIA (DIFF 3)

MINDRAY® BC 3200
COULTER® Ac·T diff™ Analyzer

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ADVIA® 360 Hematology System

EJEMPLO DE AUTOANALIZADORES MULTIPARAMÉTRICOS (DIFF 5)

ABOTT® CELL DYN RUBY MINDRAY® BC 5800

SYSMEX- XT2000i Hematology Analyzer ADVIA 2120


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GENERALIDADES DE AUTOANALIZADORES HEMATOLÓGICOS MULTIPARAMÉTRICOS

MODO ABIERTO MODO CERRADO

PANTALLA TOUCH SCREEN


INGRESO DE TUBOS POR ESCANEO
DE CÓDIGO DE BARRAS

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EJEMPLO DE INFORMES DE HEMOGRAMAS AUTOMATIZADOS

IMPEDANCIA MULTIPARAMÉTRICOS

BIBLIOGRAFÍA

 Automatización en hematología. Nilda E. Fink. SAH. Hematología. Vol 9 N°1:4-16, 2005


 Informe automatización del hemograma: entre la ayuda, la confusión y la controversia.
Carbia C, Fink N, Lazarowski A. XIX Congreso Argentino de Hematología, 2009
 Hemograma. Como hacer e interpretar. Raimundo Gomez Oliveira. Ed Amolca,2011
 Manual de técnicas de laboratorio en hematología. J. Vives, J Aguilar. 2 Ed. Masson,
2001
 Curso: El hemograma, del miscroscopio al laser: que debemos recordar?. COBICO,
2017
 Automatización en hematología. Maria Alegre. NotiWiener Digital N°4, 2015

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