CAPÍTULO 2
Principios de citometría de flujo
THOMAS A. FLEISHER  •  JOAO B. OLIVEIRA  •  SERGIO D. ROSENZWEIG
La citometría de flujo se ha convertido en una
herramienta de laboratorio estándar para evaluar
las células hematopoyéticas, lo que comprende la
identificación de poblaciones y subpoblaciones de
leucocitos, un método conocido como inmunofenoti-
pado. La aplicación clínica de esta técnica se ha visto
facilitada por el desarrollo de instrumentos y siste­
mas de análisis de datos adecuados para su uso sis­
temático en los laboratorios diagnósticos. Además, la
gama ampliada de anticuerpos monoclonales (mAb)
específicos frente a antígenos de la superficie de los
linfocitos (y otras células hematopoyéticas) conjuga­
dos directamente con una serie de indicadores fluo­
rescentes diferentes (fluorocromos) proporciona un
amplio grupo de reactivos que facilitan los estudios
en múltiples colores (policromáticos).
Las necesidades clínicas que impulsaron esta
técnica se remontan a la aparición de los recuentos
absolutos de linfocitos T CD4 como medida crucial
para la evaluación y el seguimiento de la enfermedad
en el tratamiento de los pacientes infectados por
el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
La citometría de flujo aplicada a la vigilancia de la
infección por el VIH fue seguida de la aplicación
habitual de la caracterización celular por citometría
de flujo en la evaluación de las neoplasias malignas
hematológicas y, más recientemente, del estudio
de los trastornos por inmunodeficiencias y otras
enfermedades inmunitarias.
Los recientes avances en la instrumentación y la
química fluorocromática permiten ahora realizar
estudios de citometría de flujo policromáticos de
forma habitual, con la evaluación concomitante de
los marcadores de la superficie celular y de paráme­
tros intracelulares, incluidas las proteínas intrace­
lulares, las fosfoproteínas y las citocinas, así como
la identificación de los cambios relacionados con
la activación celular y la apoptosis. La citometría
de flujo intracelular también se puede aplicar para
evaluar el estado del ciclo celular (es decir, G0-G1, S,
G2-M) mediante la tinción del ADN, lo que es útil
para evaluar a las células tumorales y la respuesta
linfocítica in vitro a diversos estímulos. Además, la
evaluación de la proliferación de los linfocitos puede
realizarse con colorantes de seguimiento celular que
permiten cuantificar las rondas de división celular
asociadas a la activación celular, y también se han
desarrollado técnicas para evaluar la citotoxicidad
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mediada por células inmunitarias. Por último, la
caracterización de los linfocitos T específicos frente
al antígeno después de la inmunización o asociados
a las respuestas inmunitarias normales o anóma­
las asociadas a estados patológicos puede lograrse
mediante el uso de la tecnología de los multímeros
y la detección intracelular de citocinas después de la
exposición al antígeno.
Este capítulo se centra en los conceptos básicos de
la citometría de flujo, incluidos las características del
instrumento, el manejo de los datos, las puertas de
los linfocitos y el uso dirigido de reactivos de prueba.
Además, ofrece una breve descripción general de la
detección de proteínas intracelulares, la activación
celular y los estudios de citotoxicidad celular, el aná­
lisis del ciclo celular, la detección de la apoptosis
y la técnica de los multímeros, centrándose en la
aplicación adecuada de estos enfoques, así como en
sus limitaciones.
INSTRUMENTACIÓN
Los componentes básicos de un citómetro de flujo,
como se muestra en la figura 2.1, son una fuente de
iluminación, un banco óptico, un sistema líquido,
un sistema electrónico y un ordenador1. Brevemente,
las células teñidas fluyen en una sola fila por el sis­
tema líquido y son estudiadas por una o más fuentes
de luz; estas fuentes generan señales luminosas, que
son detectadas por el sistema óptico hasta los foto­
detectores, que a su vez convierten la luz en señales
electrónicas para su almacenamiento y posterior
análisis. Este proceso se expone con más detalle en
la sección siguiente.
El sistema líquido se encuentra en el corazón del
citómetro de flujo y consiste en un líquido isotónico
a modo de funda que mueve el chorro de muestra
que contiene las células. Esto se logra inyectando la
muestra celular en el flujo a modo de funda, esta­
bleciendo un flujo de células (partículas) de una sola
fila centrado hidrodinámicamente que se mueven
a través del punto de análisis mientras mantienen
el flujo celular en una ubicación constante y central2.
El flujo celular centrado asegura que la iluminación
de todas las células sea prácticamente equivalente. Por
lo tanto, la diferencia en la magnitud de la señal o
señales de emisión generadas a partir de cada célula
refleja las diferencias biológicas entre las células (en
13
14 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica

FIG. 2.1  Diseño simplificado de un citómetro de flujo con una fuente de iluminación (láser)
configurado para registrar cinco parámetros. Incluye los dos parámetros no fluorescentes (luz azul)
de dispersión frontal y lateral, junto a tres parámetros fluorescentes, de luz verde (FITC), naranja (PE)
y roja (PerCP).

lugar de reflejar la variación de la energía de ilumi­
nación si las células no estaban bien centradas). El
uso del centrado hidrodinámico tiene la ventaja
adicional de producir poco o ningún cambio en la
forma de la célula, aunque puede tener algún efecto
sobre la orientación celular. La consistencia en el
mantenimiento de la forma de la célula facilita dis­
tinguir las diferencias «arquitecturales» entre tipos
específicos de leucocitos (v. la sección Selección de
poblaciones [gating])3. Sin embargo, este método
puede generar filas de una sola célula con precisión
solo hasta un flujo de 60 a 100 µl/min, lo que puede
conducir a tiempos largos de adquisición para la
detección de acontecimientos muy inusuales. Para
superar este problema, los instrumentos de citome­
tría de flujo recientemente introducidos utilizan el
enfoque acústico, que alinea las células mediante
el uso de ondas sonoras, lo que permite flujos de la
muestra de hasta 1.000 µl/min, sin ninguna pérdida
de calidad de la señal4,5.
La iluminación en los instrumentos clínicos
estándar se genera con dos o más láseres, cada uno
de los cuales proporciona una fuente de luz mono­
cromática específica (p. ej., un láser de zafiro genera
un haz de longitud de onda de 488 nm [azul]). Los
láseres modernos son pequeños y están disponibles
en múltiples longitudes de onda, incluidos ultra­
violeta (350 nm), violeta (405 nm), azul (488 nm),
verde (532 nm), amarillo (560 nm), naranja
(610 nm) y rojo (633 nm), lo que permite el uso
simultáneo de múltiples fluorocromos que tienen
diferentes requisitos de excitación6. El punto en el
que la luz ilumina la célula en los instrumentos
analíticos se produce dentro de una célula de flujo,
mientras que en los clasificadores de células, el haz
se cruza con las células que fluyen como un flujo de
aire. El banco óptico contiene lentes que dan forma
y enfocan el haz de luz para asegurar una energía de
excitación consistente en el punto de análisis.
La iluminación de una célula genera señales
fluorescentes y no fluorescentes, que se recogen y
miden acoplando por medios ópticos la señal a un
sistema de detección formado por filtros, cada uno
de los cuales está conectado a un fotodetector. Los
filtros se eligen para permitir que las señales no
fluorescentes se midan a la misma longitud de onda
que la señal de excitación (p. ej., 488 nm desde una
fuente de luz azul) para los canales de dispersión
frontal y lateral (v. sección Selección de poblaciones
[gating]), mientras que los de los canales de fluores­
cencia utilizan filtros específicos que permiten el
paso de luz con longitudes de onda específicas para
cada reactivo de fluorescencia (p. ej., verde, naranja
o rojo; v. sección sobre reactivos de fluorescencia).
El número y disposición de los fotodetectores per­
mite la evaluación simultánea de múltiples colores
(parámetros) de cada celda, con un informe que
describe un instrumento clínico modificado capaz
de evaluar 17 o más colores simultáneamente de
cada celda evaluada7.
La electrónica interna del citómetro de flujo
proporciona al sistema la capacidad de convertir
las señales luminosas analógicas (fotoelectrones)
recibidas en los fotodetectores en señales digitales
para su adquisición y almacenamiento en un orde­
nador. La intensidad de estas señales convertidas se
mide en una escala relativa que generalmente se fija
en 256 o 1.024 incrementos iguales (denominados
canales) para su visualización y análisis. Existen
varios programas de análisis especializados, y los
resultados se representan gráficamente en forma de
histogramas de un solo parámetro que muestran la
intensidad de la luz (fluorescencia) específica (eje x)
frente al número de células (eje y) (fig. 2.2) o
pantallas de dos colores en las que el eje x y el eje y
reflejan la intensidad de la luz de los dos colores y
los números de células están representadas a través
de puntos, seudocolores, contornos o diagramas de

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 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo 15

FIG. 2.2  (A) Gráfica de puntos de dispersión frontal y lateral en una muestra de sangre completa
lisada, en la que se aprecia la diferenciación en tres partes de linfocitos, monocitos y granulocitos.
(B) Gráfica de puntos con reactivos de selección (gating) de DC45/CD14, que muestra
la distribución de la fluorescencia de los tres tipos de linfocitos identificados (linfocitos,
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monocitos y granulocitos), así como un pequeño número de eritrocitos no lisados o residuos.

densidad (fig. 2.3). La mayoría de los programas
de análisis permiten al operador evaluar el número
y porcentaje de acontecimientos, la fluorescencia
media y mediana del canal y medidas estadísticas
seleccionadas para cada célula identificada, y estas
pueden agregarse en poblaciones o subpoblaciones
específicas de células. Por lo tanto, un citómetro de
flujo proporciona una plataforma con la capacidad
de evaluar múltiples piezas de información (pará­
metros) discreta generada a partir de cada célula
individual contenida dentro de un gran número de
células presentes en la muestra de estudio, y éstas se
suelen acumular a un ritmo de 1.000-2.000 (o más)
células por segundo.

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16 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica

FIG. 2.3  Histograma monoparamétrico de la expresión de CD3 en los linfocitos, que muestra
una población negativa, de linfocitos no T (linfocitos B, células citolíticas naturales [NK]),
y una población positiva de linfocitos T. La integración de las áreas bajo cada curva proporciona
el número y porcentaje de las células presentes en cada subpoblación.

REACTIVOS FLUORESCENTES un amplio espectro de excitación (525-800 nm)

Los mAb reactivos estándar de uso clínico se suelen
conjugar directamente con un fluorocromo, un colo­
rante que absorbe y emite luz de diferentes longitudes
de onda basándose en la energía perdida durante el
retorno de los electrones excitados a su estado basal
asociado a la iluminación por una longitud de onda
de luz específica. Por lo tanto, la luz emitida tiene una
longitud de onda más larga (menor energía) que la
longitud de onda del haz de excitación. El número de
fluorocromos comercializados ha aumentado mucho
con el uso sistemático de conjugados de colorantes
e instrumentos con tres o más láseres8. Los fluoro­
cromos más usados en el inmunofenotipado clínico
son los tintes orgánicos isotiocianato de fluoresceína
(FITC), ficoeritrina (PE), proteína de peridina cloro­
fílica (PerCP) y aloficocianina (APC). Las conjuga­
ciones de PE y APC con las cianinas (Cy5, Cy5.5 y
Cy7) y colorantes Alexa Fluor producen colorantes
en tándem con espectros de emisión adicionales,
basados en la transferencia de energía de un fluoro­
cromo al segundo fluorocromo que sirve de fuente de
luz emitida. Esto permite la evaluación simultánea de
6-8 colores en la mayoría de los instrumentos clínicos
actuales con solo dos o tres láseres.
Un avance reciente en este campo fue el desa­
rrollo de una nueva clase de nanocristales semicon­
ductores fluorescentes inorgánicos, denominados
puntos cuánticos (QD, del inglés quantum dots) 9.
Estas partículas son perfectamente adecuadas para
la citometría de flujo policromática, ya que tienen
y un espectro de emisión agudo y discreto que varía
en función del tamaño de su núcleo9. Esto significa
que pueden excitarse QD de diferentes tamaños (y
consecuentemente de diferentes colores) por la mis­
ma fuente láser, permitiendo una multiplexación
más simple9. Además, los QD tienen un alto ren­
dimiento cuántico, altos coeficientes de extinción
molar y una extraordinaria resistencia a la fotode­
gradación y la degradación química. Estas cualidades
los hacen perfectamente adecuados para su uso en
los estudios biológicos, incluidos las imágenes en
vivo intracelulares, el análisis de la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y
las imágenes dinámicas de proteínas individuales
durante períodos más largos9.
Se dispone de otros colorantes para estudios
funcionales, entre los que se incluyen colorantes
sensibles al calcio (p. ej., fluo-3), colorantes sensibles
al glutatión (p. ej., monoclorobimano) y colorantes
sensibles al peróxido de hidrógeno (H2O2) (p. ej.,
colorantes que responden a la luz del sol), dihidro­
rrodamina 123[DHR123])10,11. La evaluación del
contenido de ADN puede realizarse con coloran­
tes que intercalan el ADN y el ARN bicatenarios,
incluidos el yoduro de propidio (IP) y el bromuro
de etidio12. Además, existen colorantes excitados por
los rayos ultravioleta que son muy específicos del
ADN, incluidos Hoechst 33258 y 4,6-diamidino-2-
fenilindole (DAPI); la acridina naranja se utiliza para
la tinción simultánea del ADN y del ARN12.

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 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo
ANÁLISIS DE LOS DATOS
Selección de poblaciones (gating)
Conceptos clave
Puerta
• Método para definir la población celular
de interés
• Suele realizarse usando la dispersión frontal
y lateral así como anticuerpos específicos del linaje
La evaluación adecuada de los tipos específicos de
células dentro de una mezcla requiere la identifica­
ción inicial de las células específicas del linaje, un
método que se conoce como «puerta». En términos
prácticos, el inmunofenotipado centrado en los lin­
focitos requiere minimizar las células no linfocíticas
incluidas en la evaluación, y esto se logra abriendo la
puerta de los linfocitos. La muestra estándar para los
estudios clínicos es la sangre completa anticoagula­
da; para dirigir el estudio a los linfocitos es necesario
eliminar la gran mayoría de las células que no lo son
de los datos recogidos, de modo que la expresión de
un porcentaje de una subpoblación celular específica
sea una medida precisa. Sin abrir la puerta, los datos
también pueden verse afectados de forma negativa
debido a la coexpresión de antígenos de superficie en
diferentes linajes celulares (p. ej., el CD4 se encuen­
tra en los linfocitos y en los monocitos en diferentes
densidades). Además, la unión inespecífica de reac­
tivos monoclonales a través de los receptores Fcγ,
y la concentración de inmunoglobulina humana
citofílica (Ig), varía según el tipo de célula, lo que
hace que la apertura de la puerta adecuada sea crucial
para generar datos válidos. Estas técnicas también se
utilizan para centrar la evaluación en otras células
hematopoyéticas, como los monocitos, los granulo­
citos, los eosinófilos, los eritrocitos y las plaquetas.
La puerta inicial para concentrarse en una pobla­
ción específica de leucocitos implica típicamente
usar dos parámetros no fluorescentes, la dispersión
frontal (FSC, del inglés forward scatter) y la dispersión
lateral (SSC, del inglés side scatter) (v. fig. 2.2A)3. La
FSC es un reflejo del área transversal celular (relación
directa con el tamaño de la célula), mientras que la
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SSC es una indicación de la granularidad celular. La
combinación de estos dos parámetros no fluores­
centes proporciona una fórmula leucocítica en tres
partes en la sangre completa con eritrocitos lisados
que distingue entre los linfocitos, los monocitos y los
granulocitos normales. Como se puede ver en la figu­
ra 2.2A, entre los leucocitos, los linfocitos tienen la
FSC y la SSC más bajas, los monocitos tienen la FSC
y la SSC más altas y los granulocitos tienen la SSC
más elevada. Este método distingue una población
de linfocitos relativamente pura en la mayor parte
de las circunstancias. Sin embargo, la presencia de
eritrocitos nucleados, plaquetas grandes, basófilos u
otros residuos de partículas puede inducir episodios
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17
contaminantes (células) en esta «selección de los lin­
focitos». Por otro lado, las células linfocíticas malig­
nas o activadas pueden no ajustarse a los patrones de
dispersión de luz estándar antes descritos.
Un método para confirmar la integridad de la
selección de los linfocitos basada en la dispersión
de la luz utiliza los reactivos monoclonales «de
selección» directamente conjugados, anti-CD45 y
anti-CD1413. Estos dos mAb identifican con más
precisión el diferencial en tres partes. Los linfoci­
tos son los que más CD45 ligan, pero no se unen
al anti-CD14; los granulocitos se unen menos al
anti-CD45 y muestran una expresión intermedia
de CD14, mientras que los monocitos expresan
gran cantidad de CD45 y de CD14 (v. fig. 2.2B).
Es importante destacar que las células que no son
leucocitos, incluidos los eritrocitos y las plaquetas,
no expresan estos marcadores. Sin embargo, los
leucocitos malignos que tienen características de
células precursoras tempranas presentan a menudo
una expresión alterada de CD45 o CD14, lo que
debe reconocerse cuando se estudian las neoplasias
malignas hematológicas. Los reactivos de selección
de poblaciones son un medio fiable de comprobar la
selección de linfocitos basada en la dispersión de la
luz, en lo que respecta a la frecuencia de células no
linfocíticas dentro de la ventana de análisis (gate),
así como en lo relativo al alcance de la exclusión de
los linfocitos de tal ventana. Las pautas sobre un
grado aceptable de contaminación en el proceso
de selección de linfocitos, y sobre el nivel acepta­
ble de su exclusión, se incluyen en las directrices
sobre inmunofenotipado de linfocitos del Clinical
and Laboratory Standards Institute estadounidense.14
A raíz de la extensión del uso de la citometría de
flujo policromática, algunos centros han pasado a
incluir anti-CD45 en todos los tubos para precisar la
ventana analítica y evitar la contaminación celular,
según se ha descrito anteriormente.
Visualización de los datos
Conceptos clave
Presentación de los datos
• La intensidad de la fluorescencia se representa
en una gráfica comparada con el número
de células.
• La citometría de flujo puede presentar datos
acumulados de más de un parámetro de cada
célula.
• La presentación de datos en múltiples colores
aumenta en ocasiones la resolución de las
subpoblaciones celulares.
El método más sencillo para demostrar los datos
de citometría de flujo es el histograma de un solo
parámetro (v. fig. 2.2), una presentación gráfica del
número de células en el eje y frente a la intensidad
18 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica

de fluorescencia (luz) de un solo fluorocromo en el Estos subgrupos diferenciados pueden identificar­

eje x. La integración de áreas de curva proporciona el
número de células, y a menudo hay dos distribucio­
nes distintas, una referida como células identificado­
ras negativas a las que no se ha unido específicamente
el reactivo monoclonal, y la segunda representa célu­
las a las que se ha unido el anticuerpo. La distribu­
ción negativa refleja en realidad la fluorescencia de
bajo nivel resultante de la autofluorescencia celular
junto a cualquier unión inespecífica de los reactivos
monoclonales, y la magnitud de ambos fenómenos
varía entre los diferentes tipos de células. La inter­
pretación de los datos se simplifica cuando hay dos
poblaciones celulares distintas (es decir, negativas
y positivas), mientras que la evaluación de dos dis­
tribuciones superpuestas es más difícil.
Los datos multiparamétricos pueden evaluarse
por medio de una serie de histogramas de un solo
parámetro, que consideran cada fluorocromo de
forma independiente. Sin embargo, es más infor­
mativo presentar dos parámetros simultáneamente
utilizando una pantalla correlacionada (fig. 2.4), y se
recomiendan pantallas de dos colores para la citome­
tría de flujo clínica15. Este enfoque permite la visuali­
zación simultánea de cuatro poblaciones diferentes:
A+/B−, A–/B+, A+/B+ y A−/B−. Más recientemente,
estas pantallas han sufrido un desarrollo avanzado
para incluir una mezcla de intensidad logarítmica
(para la expresión de intensidades más altas) y lineal
(para la expresión de intensidades más bajas) en
cada eje, con el fin de permitir una mejor interpre­
tación de los episodios con una fluorescencia muy
baja, cero o negativa. Este enfoque de visualización
combinada resuelve el problema anterior de un gran
número de episodios que se muestran compactados
contra los ejes, incluso con muestras debidamente
compensadas, y se utilizará en las ilustraciones a lo
largo de este capítulo16.
El uso simultáneo de n reactivos monoclonales
puede identificar un total de 2n subpoblaciones.
se de modo secuencial, distinguiendo primero las
células positivas y negativas respecto a un reactivo
y, a continuación, evaluando las subpoblaciones
definidas por los dos reactivos restantes, utilizando
un abordaje con dos colores. También es posible
usar programas informáticos más modernos que
representan múltiples poblaciones mediante gráficas
policromáticas, lo que simplifica el análisis de los
datos17. El enfoque policromático es una forma de
resolver aún más subpoblaciones y ha sido particu­
larmente útil en la evaluación de la diferenciación
celular, la activación y los correlatos funcionales, así
como en la aclaración de subpoblaciones celulares
superpuestas.
Discriminación entre positiva y negativa
La evaluación de los datos de inmunofenotipado clí­
nico requiere establecer criterios para establecer los
límites entre las células negativas o no teñidas (con
autofluorescencia más células con tinción inespecí­
fica) y las células positivas (teñidas de forma espe­
cífica). Un planteamiento utilizado con frecuencia
consiste en el uso de mAb de control conjugados de
la clase o subclase apropiada (p. ej., IgG1, IgG2a,
IgG2b o IgM) que no reaccionan específicamen­
te con antígenos de la superficie de los linfocitos
humanos (denominados con frecuencia «controles
de isotipo»). El marcador (discriminador) se ajusta
al número de canales de los histogramas de fluores­
cencia de forma que incluya el 98-99% de las células
negativas (fig. 2.5A).
Como se señaló anteriormente, negativo se refiere
al agregado de la autofluorescencia celular basal más
la unión de reactivos inespecíficos, y esto puede variar
según el tipo de célula. Por esta razón, es posible que
el uso de controles de isotipo no identifique correcta­
mente el umbral de discriminación positiva-negativa
para tipos específicos de células, particularmente
cuando se tiñen proteínas expresadas débilmente.

FIG. 2.4  Ejemplos de representaciones de puntos con seudocolor (izquierda), densidad (centro)
y contorno (derecha), basados en los mismos datos paramétricos de dos colores. Las tres técnicas
favorecen la evaluación simultánea de los dos parámetros que, en este caso, evalúan la expresión
de los marcadores A y B. Las gráficas identifican cuatro poblaciones de células: las que expresan
solo A o B, las que expresan tanto A como B (muy pocas) y las que no expresan ni A ni B.

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 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo 19
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FIG. 2.5  Estrategias de discriminación entre positiva y negativa. (A) Los anticuerpos inespecíficos
(isotipos) se emplearon para teñir la muestra representada a la izquierda y, a la derecha,
se representa el umbral de positividad determinado y aplicado a la muestra. (B) Fluorescencia
menos uno (FMO). El umbral de positividad se determinó tiñendo la muestra de la izquierda
con marcadores específicos frente a cada población (CD3, TCRαβ y CD8) y omitiendo el FAS.
La gráfica de la derecha contiene FAS. Se aprecia que el umbral de positividad es levemente
distinto en los linfocitos CD8+ y CD8−.

Además, para simular perfectamente el anticuerpo alternativo para la discriminación positiva-negativa,

específico utilizado, el control del isotipo necesitaría la fluorescencia menos uno (FMO)18.
tener la misma proporción de anticuerpos a fluoro­ La FMO consiste en la tinción de la muestra con
cromo y brillo, algo que no es fácil de lograr. Para todos los anticuerpos de interés, exceso con uno para
superar estas dificultades, se ha obtenido un método el que se establece el umbral de discriminación entre

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20 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
positivo y negativo. A modo de ejemplo, para definir
el umbral negativo de la proteína FAS (CD95) en
los linfocitos T CD8+ y CD8−, el tubo de control de
la FMO debe incluir los marcadores específicos del
subgrupo celular (CD3, TCRαβ y CD8) y omitir el
anti-FAS. Tras la selección adecuada de la población,
es posible definir adecuadamente el umbral, que
es diferente en las dos poblaciones ejemplificadas
(fig. 92.5B, imagen derecha). Una limitación obvia de
este método es su elevado coste, dado el alto número
de tubos de control necesarios para cada muestra.
Compensación
Los filtros no separan completamente las señales de
fluorescencia emitidas por los diferentes fluorocro­
mos. Esto puede llevar a una superposición de señal,
que se corrige mediante la sustracción electrónica
de la señal superpuesta, un proceso conocido como
compensación. El solapamiento es particularmente
significativo cuando se utilizan varios fluorocromos,
cada uno con diferentes propiedades espectrales18.
El proceso de compensación implica la sustracción
de la señal de «desbordamiento» detectada por el
fotodetector generada por muestras teñidas con un
solo fluorocromo. Actualmente, la mayoría de los
programas informáticos de análisis por citometría
de flujo permiten la compensación fuera de línea,
donde se utilizan tubos teñidos con un solo reactivo
para crear una matriz de compensación, que luego
se aplica a todos los tubos del experimento. Esto
permite el uso de técnicas de compensación muy
simplificadas, sin necesidad de ninguna compen­
sación del sistema físico durante la recopilación de
los datos.
Control de calidad
El control de calidad es un componente crucial de
la citometría de flujo clínico para asegurar resulta­
dos óptimos19. Esto incluye el control de la confi­
guración y el rendimiento de los instrumentos, la
optimización de la preparación de las muestras y
los reactivos y la estandarización de los controles
y la interpretación de los datos. La citometría de
flujo cuantitativa basada en una curva de fluores­
cencia estándar proporciona datos cuantitativos en
unidades denominadas equivalentes moleculares
de fluorocromo soluble (MESF, del inglés molecular
equivalents of soluble fluorochrome). Cuando se utilizan
curvas estándar correctamente construidas, se pue­
den generar y comparar datos cuantitativos referidos
a diferentes reactivos. Por último, la participación en
encuestas entre laboratorios de pruebas de compe­
tencia, como las muestras trianuales proporcionadas
por el College of American Pathologists (CAP), es una
medida adicional importante para controlar el ren­
dimiento de los laboratorios, y así lo exige la Clinical
Laboratory Improvement Amendment de 1988 sobre
la mejora de los laboratorios clínicos en Estados
Unidos (CLIA 88).
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Métodos
La lisis de sangre completa es la técnica más utilizada
para la preparación de las muestras y consiste en
mezclar un volumen fijo de sangre completa (o de
médula ósea) anticoagulada con uno o más mAb
conjugados directamente, seguido de la incubación
a una temperatura y un tiempo determinados20.
A continuación, los eritrocitos se lisan y la muestra se
lava y se introduce en el citómetro de flujo, por lo
general después de fijarla con paraformaldehído para
reducir el riesgo de infección. Las células no lisadas
que permanecen comprenden todos los leucocitos
de la sangre periférica, así como los eritrocitos, las
plaquetas y los restos no lisados. La heterogeneidad
de la muestra requiere una cuidadosa selección de
los linfocitos (v. la sección Selección de poblaciones
[gating]) para generar datos exactos de inmunofeno­
tipado. Entre las ventajas del método de análisis de
sangre completa están menos pasos preparatorios,
menos manipulación de la muestra y menor pro­
babilidad de pérdida diferencial de linfocitos que
puede ocurrir cuando se utilizan técnicas de gradien­
te de densidad para preparar las células mononu­
cleares para el análisis. También pueden evaluarse
otras fuentes de células (p. ej., médula ósea, líquido
del lavado alveolar bronquial, aspirados con aguja
fina) con la citometría de flujo21. Los estudios de
las muestras de pacientes deben determinarse con
los mismos métodos y reactivos que se utilizan en
la determinación de los intervalos de control para
garantizar la comparabilidad. El número de episo­
dios (células) analizados oscila típicamente entre
10.000 y 20.000 en los estudios clínicos habituales,
pero debe incrementarse cuando se evalúan subpo­
blaciones muy pequeñas de células para producir
datos estadísticamente relevantes necesarios en el
análisis de episodios poco frecuentes.
La aplicación de los intervalos de control debe
tener en cuenta el hecho de que se producen cam­
bios significativos en la distribución y el desarrollo
de los linfocitos durante la infancia, así como los
cambios en los linfocitos que se producen entre las
personas de edad muy avanzada22,23. Además, dado
que las inducen diferencias inmunofenotípicas sus­
tancias como los productos del tabaco, siempre que
sea posible, se debe obtener información sobre los
medicamentos que toma el paciente. Otros factores
también pueden repercutir en la distribución de los
linfocitos, como la raza, el sexo, la variación diurna
y las infecciones recientes o intercurrentes24.
La elección de los reactivos de inmunofenotipado
depende de las células que se estudien y de la pre­
gunta que se plantee. Sin embargo, independiente­
mente de la configuración específica, se recomienda
la inclusión de un tubo con reactivos de selección
(anti-CD45 y anti-CD14) para confirmar la inte­
gridad de la selección estándar de los linfocitos13.
Además, deben incluirse reactivos de control para
establecer la intensidad de fluorescencia de las
 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo
TABLA 2.1
Antígenos linfocíticos de la superficie
seleccionados para el inmunofenotipado
LINFOCITOS T
Todos los linfocitos T: CD3, CD2, CD7, CD5
Subgrupo de linfocitos T principales: CD4, CD8
Antígenos de superficie asociados a la función: CD28,
CD31, CD38, CD45RA, CD45RO, CD62L, CXCR7
Antígenos de activación: CD25, CD40L, CD69,
CD71, HLA-DR
LINFOCITOS B
Todos los linfocitos B: CD19, CD20, inmunoglobulina
de superficie
Subgrupo de linfocitos B principales: CD5, CD21
Antígenos de superficie asociados a la función:
CD27, CD40, CD80, CD86
Antígenos de activación: CD23, CD25
CÉLULAS NK
Todas las células citolíticas naturales (NK): CD16, CD56
Subgrupo de NK: CD2, CD8, CD57
células negativas (no teñidas). Entre los controles
internos importantes se incluye un marcador de
linfocitos T, B y de células citolíticas naturales (NK)
en cada muestra (tabla 2.1), basado en el principio
de que el todo es la suma de sus partes. Por lo tan­
to, el porcentaje total de linfocitos contenido en el
intervalo determinado por los reactivos de selección
debe ser aproximadamente igual a la suma de los
porcentajes de los linfocitos T, B y células NK. Debe
darse una explicación técnica o biológica cuando
esta relación no se mantenga. Entre las explicaciones
biológicas de una diferencia significativa estarían la
presencia de células inmaduras o malignas que no se
identificaron con los reactivos estándar de linfoci­
tos T, B y células NK. Además, si no se hubieran incluido
los reactivos de selección (CD45/CD14), no pueden
descartarse células contaminantes (p. ej., precursores
mielocíticos, eritrocitos nucleados, plaquetas gran­
des) con características de FSC y SSC similares a las
de los linfocitos. Los problemas técnicos potenciales
son la degradación del reactivo o del fluorocromo,
la falta de adición de un reactivo y muchos otros.
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.
El indicio de cualquier error técnico importante debe
dar lugar a repetir el estudio.
Los datos adicionales que se pueden utilizar
para los controles dependen de la configuración.
Por ejemplo, la disponibilidad de múltiples anti­
cuerpos que identifican una subpoblación de células
similares puede servir de control útil (p. ej., linfo­
citos T totales al comparar CD3 con CD5 o CD2;
linfocitos B totales al comparar CD19 y CD20).
Además, el uso de reactivos específicos en >1 tubo
permite comparar entre los valores repetidos como
medida de la consistencia. La aplicación de controles
internos debe realizarla el operador del flujo como
un medio sencillo de confirmar la validez de los
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21
datos. También pueden detectarse hallazgos bioló­
gicos inusuales en este tipo de evaluación (p. ej., la
presencia aumentada de una población de linfocitos T
doblemente negativos CD4−/CD8−)25.
El reto al realizar el inmunofenotipado es iden­
tificar con precisión las células con características
específicas en su superficie (antígenos). Como se
señaló antes, la capacidad de discriminar a las subpo­
blaciones celulares aumenta a menudo mediante el
uso dirigido de combinaciones de anticuerpos. Los
datos típicos generados consisten en el porcentaje de
células negativas frente a positivas cuando se utiliza
un reactivo y en múltiples subpoblaciones cuando se
utiliza más de un reactivo. Independientemente del
diseño experimental, es importante considerar no
solo el porcentaje de células dentro de cada subpo­
blación, sino también el número absoluto de ellas.
Esto suele obtenerse multiplicando el porcentaje rele­
vante del citómetro de flujo por el recuento absoluto
de linfocitos obtenido utilizando un recuento total
y diferencial de leucocitos. Por ejemplo, cuando se
analizan los recuentos de linfocitos T CD4, el por­
centaje de células CD4+ se multiplica por el recuento
absoluto de linfocitos periféricos para obtener el
recuento absoluto de CD4. Un posible problema de
este enfoque es el requisito de dos técnicas separadas
(es decir, plataformas duales) para generar el resul­
tado final. Esto introduce la posibilidad de un error
aditivo, basado en los errores inherentes a los dos
métodos diferentes. Esto ha impulsado la búsqueda
de enfoques que faciliten la realización de ambas
tareas con la citometría de flujo (es decir, una sola
plataforma). Una alternativa consiste en la inclusión
de un número fijo de microesferas fluorescentes (en
un volumen definido) en cada tubo como estándar
de referencia para generar números absolutos sin
necesidad de utilizar el recuento sanguíneo completo
y diferencial para generar un recuento de linfocitos.
Un enfoque alternativo es usar un recuento celular
basado en la impedancia en el citómetro de flujo para
generar un recuento absoluto de linfocitos (depen­
diente del volumen fijo de la muestra que se esté
realizando) y después generar tanto el porcentaje
como el número absoluto de células en cada pobla­
ción o subpoblación específica. Independientemente
del enfoque, es necesario informar tanto de los por­
centajes como de los números absolutos cuando se
realiza el inmunofenotipado de linfocitos periféricos.
El objetivo de evaluar las células malignas es a
menudo caracterizar el linaje y el nivel de diferencia­
ción de las células anómalas, más que cuantificar las
subpoblaciones. El patrón de reactividad combinado
con la intensidad de la fluorescencia es a menudo útil
para identificar patrones leucémicos, mientras que no
suele ser necesario el número absoluto de células. Sin
embargo, la detección y cuantificación citométrica de
células anómalas raras puede ser útil en la evaluación
de la enfermedad residual mínima después del trata­
miento de los trastornos linfoproliferativos.
22 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
APLICACIONES PRÁCTICAS
DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
Estudios de inmunofenotipado
Relevancia clínica
Estudios de inmunofenotipado
• Los estudios de inmunotipado se emplean
para identificar subgrupos y linajes celulares,
estadios de diferenciación celular, estados
de activación celular y clonalidad.
• Los resultados relativos a los linfocitos se verifican
con la suma de linfocitos T + linfocitos B +  celular en paralelo.
células citolíticas naturales (NK) = 100%.
• Los estudios de inmunofenotipado no son
equivalentes a los de la función de los linfocitos.
La mayoría de los estudios de inmunofenotipado
tienen como objetivo enumerar subpoblaciones
celulares específicas, evaluar la presencia o ausencia
de antígenos de superficie particulares, identificar
el nivel de diferenciación de células específicas,
determinar el linaje celular, evaluar correlaciones
funcionales basadas en la expresión de antígenos
específicos, examinar las pruebas de activación celu­
lar y establecer pruebas de la monoclonalidad.
La cuantificación de una determinada subpo­
blación celular puede establecerse con facilidad
mediante la citometría de flujo, junto a un recuento
de los leucocitos y un recuento diferencial. El recuen­
to absoluto de linfocitos sirve para determinar el
número de células de poblaciones o subpoblaciones
en función de los porcentajes de los correspondien­
tes tipos celulares detectados con el citómetro de
flujo. La evaluación del recuento absoluto de linfo­
citos T CD4 ha constituido la base del seguimiento
de los pacientes con una infección por el VIH26. La
cuantificación de las células madre hematopoyéticas
(HSC) CD34+ en la sangre periférica del donante o
en la médula ósea se utiliza en muchos protocolos
de reconstitución celular27. La caracterización de la
subpoblación también puede ser útil para evaluar
a pacientes con antecedentes clínicos y hallazgos
de laboratorio que indiquen una inmunodeficien­
cia28,29. Esto ha adquirido una mayor importancia
en el contexto del cribado de la inmunodeficien­
cia grave de linfocitos T en recién nacidos a través
del análisis del círculo de escisión del receptor del
linfocito T (TREC, del inglés T-cell receptor excision
circle), que, cuando es anómala, suele ir seguido
de un inmunofenotipado para evaluar la presencia
de linfocitos T vírgenes basada en la expresión de
CD45RA, CD127 o CD62L.
Al evaluar la presencia o ausencia de proteínas de
superficie asociadas a atributos funcionales específi­
cos, es importante tener en cuenta que este enfoque
no evalúa el estado funcional real de las células. Este
punto queda claramente ilustrado por el hallazgo de
números normales de linfocitos B en la mayoría de
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los pacientes con una inmunodeficiencia variable
común, a pesar de que estos pacientes no producen
normalmente Ig30. Sin embargo, los cambios en las
características de los linfocitos B, particularmente en
relación con los linfocitos B memoria, proporcionan
una posible visión de los diferentes fenotipos de este
trastorno y apoyo adicional para la heterogeneidad
de los pacientes que sufren la enfermedad31,32. Debi­
do a las limitaciones del inmunofenotipado, cuando
se evalúa el estado del sistema inmunitario, es una
práctica frecuente realizar pruebas de la función
La citometría de flujo se puede utilizar para detec­
tar la presencia o ausencia de un antígeno específico
en la superficie celular. Un ejemplo de este tipo de
aplicación es la evaluación de un paciente con ante­
cedentes de infecciones cutáneas recurrentes, un
retraso de la cicatrización de las heridas y una gra­
nulocitosis persistente, lo que induce a pensar en un
diagnóstico de deficiencia de adhesión del leucocito
del tipo 1 (LAD-1)28,33. Este trastorno es el resultado
de un defecto en el gen que codifica el CD18, lo que
impide o disminuye la expresión de tres moléculas
de adhesión heterodiméricas diferentes (integrinas β2),
cada una de las cuales contiene CD18. Este trastor­
no generalmente puede diagnosticarse estudiando
en los granulocitos (y los linfocitos) la expresión de
CD18 (así como las tres isoformas de CD11). Los
pacientes a menudo expresan una cantidad menor
de CD18 en lugar de no expresarlo y la confirmación
del diagnóstico puede lograrse demostrando la falta
de aumento de CD18 (y CD11a, CD11b, CD11c) tras
la activación de los granulocitos28,29.
El inmunofenotipado también puede ayudar a
abordar las cuestiones relacionadas con el nivel de
diferenciación celular. Los anticuerpos específicos
frente a las proteínas expresadas por las células tem­
pranas (precursoras) constituyen un posible enfo­
que, e incluirían la evaluación del marcador de los
timocitos CD1 o del marcador de los prelinfocitos B
CD10 (CALLA), por citar algunos. Sin embargo,
la mejor manera de definir el nivel de desarrollo de
una población o subpoblación celular en particular
es utilizando un grupo de reactivos que abarque la
evolución natural del linaje celular. Este abordaje
es el estándar para estudiar las leucemias y los lin­
fomas, que puede proporcionar una información
pronóstica útil34. Además de definir la presencia
o ausencia de antígenos específicos, la evaluación
de su grado de expresión también es valiosa, puesto
que puede alterarse en las células anómalas. Las cé­
lulas malignas también pueden expresar antígenos
asociados a diferentes linajes y tener características
alteradas de FSC y SSC, así como una expresión
menor o nula de CD45, lo que requiere ventanas
de selección modificadas.
Los problemas de la monoclonalidad se pueden
tratar utilizando la citometría de flujo cuando se
analizan los linfocitos B y, en algunas circunstancias,
 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo
cuando se estudian los linfocitos T. Normalmente,
los linfocitos B son una mezcla heterogénea de célu­
las que expresan cadenas ligeras k o λ. La capacidad
de evaluar la monoclonalidad de los linfocitos T
mediante la citometría de flujo es menos definitiva y
se centra en el uso de reactivos específicos frente a la
cadena β variable (Vβ) de los receptores antigénicos
de los linfocitos T, con objeto de detectar signos
de una representación aumentada significativa de
una familia de la cadena Vβ. Este abordaje habi­
tualmente consiste en disponer una serie de tubos,
cada uno con tres mAb distintos específicos frente
a la familia Vβ, uno conjugado con FITC, otro con
PE y un tercero con FITC y PE. Esta combinación
facilita la distinción de la frecuencia de cada una de
las tres familias Vβ diferentes en cada tubo (verde+,
naranja+, verde+/naranja+), y es un método de cito­
metría de flujo que complementa a la tipificación
espectroscópica mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR)36.
El estado de activación de los linfocitos puede
abordarse evaluando la presencia de antígenos de
superficie que solo se encuentran en las células
activadas o que aumentan después de la activación.
Entre ellos están los receptores para factores de cre­
cimiento específicos (p. ej., la cadena α del receptor
para la interleucina 2 [IL-2], CD25), receptores
de elementos esenciales requeridos para el creci­
miento celular (p. ej., receptor para la transferrina,
CD71), ligandos necesarios para la comunicación
celular tras la activación de las células (ligando de
CD40 [CD152] en los linfocitos T CD4 activados)
y antígenos de superficie que aumentan debido a
la activación (p. ej., moléculas de adhesión, HLA-
DR, CD69). Por otro lado, el estado timésico de
los linfocitos T y B puede valorarse en función de
la expresión diferencial de moléculas de superficie
asociadas al encuentro previo con un antígeno.
Esto permite distinguir entre linfocitos T vírgenes
que expresan CD45RA, CD31 (emigrantes tímicos
recientes), CD62L y CXCR7 y linfocitos T memoria
que expresan la isoforma alternativa CD45, CD45RO
(y CD62L o CXCR7 variados, dependiendo de si
las células son memoria centrales o efectoras) 37.
Además, los linfocitos B memoria pueden detec­
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tarse por la expresión de CD27 y pueden dividirse
en linfocitos memoria con y sin cambio de isotipo
en función de su patrón de expresión de inmuno­
globulinas de superficie30,38.
Los defectos asociados a la linfohistiocitosis
familiar (LHF) generalmente se relacionan con la
función anómala de las células NK. Muchos de los
defectos que causan la LHF pueden determinarse
con la citometría de flujo. Por ejemplo, la tinción
intracelular de la proteína de activación de la trans­
ducción de señales en los linfocitos (SLAM) y del
inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X
(XIAP) pueden emplearse para evaluar trastornos
linfoproliferativos ligados al cromosoma X (LPX) de
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23
los tipos 1 y 2, respectivamente. De modo similar,
la falta de expresión de perforina intracelular en
las células NK debe ser indicativa de una linfohis­
tiocitosis hemofagocítica (LHH) del tipo 2. Además,
la evaluación de la expresión superficial de CD107a,
que normalmente se produce en gránulos citoplás­
micos y mediante la incubación con células diana
específicas (p. ej., células K562) en la superficie de
las células NK, es útil para determinar un posible
defecto génico causante de la LHF37,38. Específica­
mente, la falta de aumento de CD107a es indicativa
de defectos en la sintaxina 11 o MUNC-13.4.
EVALUACIÓN INTRACELULAR
Activación celular
Relevancia clínica
Citometría de flujo intracelular
• Estudios dirigidos a la activación:
• Flujo de calcio.
• Fosforilación de proteínas intracelulares.
• Explosión oxidativa: neutrófilos.
• Estudios de citocinas intracelulares:
• Aclaración del estado de los linfocitos T
cooperadores 1 (Th1)/Th2/Th17
en una respuesta inmunitaria.
• Puede evaluarse en una respuesta
específica de antígeno in vitro.
• Puede combinarse con evaluación
de estudios de la superficie celular.
La unión de los ligandos a sus receptores y la trans­
ducción de señales transmembranarias causantes de
la activación celular pueden evaluarse con la citome­
tría de flujo. Los cambios en la concentración de
calcio iónico (Ca2+) intracelular se emplean para con­
trolar la activación celular tras la unión de los ligan­
dos a sus receptores. Estos cambios se asocian a una
activación de la fosfolipasa C y de la proteína cinasa C.
En general, para medir el Ca2+ se usan tres reacti­
vos: quin-2, indo-1 y fluo-3. Quin-2 tiene un bajo
coeficiente de excitación y no es útil para la citometría
de flujo; indo-1 requiere una excitación ultravioleta;
y fluo-3 puede excitarse con 488 nm pero no permite
el análisis ratiométrico. Sin embargo, debido a su
facilidad de uso, fluo-3 es actualmente la sonda más
utilizada para evaluar el Ca2+ intracitoplásmico por
citometría de flujo. Se debe prestar especial atención
a las condiciones de carga, la presencia o ausencia de
Ca2+ libre en el medio, la temperatura experimental,
las medidas basales y la calibración. Este enfoque
puede combinarse con la evaluación del marcador de
la superficie de la célula o del ciclo celular10.
También se pueden evaluar los cambios intrace­
lulares del pH relacionados con la activación celu­
lar. La sonda más útil para el pH es SNARF-110. Esta
sonda puede excitarse a 488 nm y permite el análisis
24 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
ratiométrico con detección de longitudes de onda
de 575 y 640 nm. El glutatión (glutamilcisteinilgli­
cina[GSH]), un antioxidante importante generado
durante la activación celular, puede medirse con la
citometría de flujo10. Para esta medida suele utilizarse
la sonda fluorescente monoclorobimano, aunque el
proceso se complica por la necesidad de determinar
la GSH mediante un método independiente, como la
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Otros enfoques para la evaluación de la acti­
vación celular son la evaluación de marcadores
intranucleares (Ki-67, PCNA), así como de proteí­
nas de la superficie que aumentan después de la
activación celular (p. ej., CD69, CD25, CD71)41. La
división celular real puede evaluarse mediante el uso
de colorantes de membranas lipofílicos (p. ej., PKH26,
CFSE, Cell Trace Violet), también conocidos como
colorantes de seguimiento celular, que pierden el 50%
de su fluorescencia con cada ronda de división ce­
lular42. Este enfoque se ha vuelto más frecuente en
la evaluación clínica de la función de los linfocitos
debido a la capacidad de evaluar subpoblaciones
específicas de linfocitos que responden a estímulos
mitógenos y antigénicos. Los colorantes de mem­
branas lipofílicas también pueden utilizarse para
marcar las células diana en análisis de citotoxicidad
basados en células43. Recientemente, se ha descrito
un método para evaluar la proliferación de los lin­
focitos después de la estimulación celular mediante
el uso del nucleósido modificado EdU. La detección
de la síntesis de ADN inducida por los diferentes
agentes activadores se mide utilizando un compues­
to de química clic catalizado por el cobre, lo que da
como resultado una unión covalente de EdU a una
azida fluorescente44. Este enfoque permite evaluar la
proliferación celular a nivel de población o subpo­
blación celular (p. ej., CD3, CD4, CD8) y se puede
utilizarse junto a la estimulación con mitógenos
y antígenos de recuerdo.
La evaluación funcional de la activación celular se
efectúa mediante detección dirigida por citometría
de flujo de la generación de proteínas intracelulares
fosforiladas asociadas a señales de activación espe­
cíficas. Un ejemplo es la detección del transductor
de la señal y activador de la transcripción 1 (STAT1)
fosforilado, tras la estimulación con interferón γ
(IFN-γ) de los monocitos, un método que se ha
mostrado tanto o más sensible que la inmunotrans­
ferencia45. Este tipo de pruebas requieren la fijación
y la permeabilización para permitir la penetración
del reactivo específico, y su uso se ha extendido a
numerosas proteínas intracelulares, que se fosforilan
tras exponerse a estímulos específicos en determina­
das células. En la actualidad, numerosas proteínas
transmisoras de señales intracelulares que sufren una
fosforilación tras una señal de activación específica
pueden evaluarse con la citometría de flujo, con reac­
tivos comerciales, algunos de los cuales se ofrecen
en forma de juego de reactivos.
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La evaluación del estallido oxidativo después de
la estimulación celular desempeña un papel central
en las pruebas de función de los neutrófilos, donde
se utiliza el colorante DHR123 sensible al peróxi­
do de hidrógeno. Este método implica la carga de
granulocitos con el colorante, la estimulación con
miristato acetato de forbol (PMA) y la evaluación
del aumento de la fluorescencia con la citometría de
flujo11,46. Esta prueba se ha mostrado sumamente
precisa en el diagnóstico de los pacientes con una
enfermedad granulomatosa crónica (EGC) y en los
portadores de una EGC ligada al cromosoma X46.
Una de las principales ventajas es su sensibilidad,
que permite detectar una célula normal en una
población de 1.000 células anómalas. Esto hace
que la evaluación del estallido oxidativo sea una
herramienta útil para vigilar la supervivencia de los
granulocitos alógenos después de su transfusión
en pacientes con una EGC, así como una forma de
seguir el quimerismo del donante en el contexto
del trasplante de células madre alógenas. También
sirve para identificar células corregidas después de
la genoterapia en la EGC y es útil para el pronóstico
de la enfermedad47,48.
Detección de citocinas intracelulares
La citometría de flujo ofrece una plataforma para
evaluar la producción de citocinas a nivel de una sola
célula mediante el uso de mAb conjugados direc­
tamente específicos frente a la citocina después de
la fijación y permeabilización de las células49. Este
método permite la detección simultánea de dos o
más citocinas intracelulares junto a marcadores de la
superficie celular u otros marcadores intracelulares.
Entre los aspectos importantes de la detección de
citocinas intracelulares están el uso de un inhibidor
del transporte de proteínas durante la activación,
el uso de los controles adecuados y la elección de
anticuerpos. Como la producción espontánea de
citocinas en los linfocitos humanos circulantes es
escasa o nula, la detección intracelular de citocinas
requiere su activación in vitro. La experiencia inicial
se basó en la estimulación suprafisiológica con el
uso de PMA e ionomicina, pero los sistemas de
activación específicos de antígenos también se han
mostrado factibles. Cabe destacar que, independien­
temente del método de activación, la duración de la
activación es una variable importante, ya que cada
célula alcanza la máxima producción de citocinas en
diferentes momentos. Además, diferentes citocinas
tienen diferentes períodos óptimos de activación.
Se recomienda que se establezca un perfil cinético
adecuado del sistema biológico o de la alteración
clínica que se está estudiando49.
Para aumentar la cantidad de citocinas intrace­
lulares, es frecuente usar inhibidores del transporte
de las proteínas intracelulares (p. ej., monensina o
brefeldina), lo que da lugar a la acumulación de
proteínas en el interior de la célula. La unión ines­
 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo 25

pecífica de anticuerpos constituye un problema, Análisis del ciclo celular

en la medida en que la permeabilización permite
el acceso no solo a la citocina que es objeto de
interés, sino también a otras proteínas presentes en
mucho mayor cantidad dentro de la célula que en
su superficie. Por otra parte, la fijación incrementa
en mayor medida la unión inespecífica, y el uso
de muestras de control negativo, que contienen
exceso de anticuerpos anticitocínicos no marcados
o «fríos», y las muestras equiparadas por subclase
o con control de FMO proporcionan un control
óptimo. Cuando el anticuerpo anticitocínico con­
jugado se añade a una muestra control negativa,
solo se une a otras proteínas de manera inespecífica,
aportando una medida que permite discriminar la
unión específica de la inespecífica. El uso de anti­
cuerpos contra las citocinas conjugados directa­
mente no solo simplifica el proceso de tinción, sino
que también consigue la mejor distinción entre la
unión específica y la inespecífica. Debido a que la
sustancia fijadora puede cambiar el estado natural
de ciertos epítopos, también es importante utilizar
anticuerpos que reconozcan antígenos después de
la fijación cuando se combinan la caracterización
de la superficie celular con la evaluación de las
citocinas intracelulares.
Una de las principales aplicaciones de la detec­
ción de citocinas intracelulares por citometría de
flujo ha sido el estudio y perfeccionamiento del para­
digma linfocitos T cooperadores (Th)1/Th2/Thh17.
Recientemente ha quedado claro que puede usarse
la secreción regulada de citocinas para estudiar la
respuesta de cada linfocito T tanto a estímulos poli­
clonales como a antígenos específicos. La medida de
la expresión de citocinas por los linfocitos T espe­
cíficos frente al antígeno en respuesta a antígenos
específicos ofrece una alternativa útil al enfoque
basado en multímeros (expuesto a continuación)
para cuantificar la frecuencia de los linfocitos T
específicos frente al antígeno50.
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Relevancia clínica
Análisis del ciclo celular
• Útil para la detección selectiva del porcentaje
de la fase S y la aneuploidía.
• Puede combinarse con estudios de la superficie
celular.
• Puede combinarse con marcadores
de la apoptosis.
Además del inmunofenotipado de superficie y la
caracterización citoplásmica, la citometría de flujo
también se utiliza para el análisis del ciclo celular. PI
es el fluorocromo más utilizado debido a su capaci­
dad de unión lineal óptima al ADN en varios tipos
diferentes de células. Por lo tanto, un histograma de
un solo parámetro del contenido de ADN utilizando
PI permite determinar fácilmente los compartimen­
tos del ciclo celular, expresados como porcentajes de
células en G0-G1, S y G2-M (fig. 2.6A). Además de
estos parámetros tradicionales, puede determinarse
la presencia o ausencia de aneuploidía mediante
la inspección del pico G0-G1 o el uso de un índice
de ADN (relación entre el contenido anómalo de
ADN y un patrón de ADN diploide). También se
puede detectar la elevación en las fases S y/o G2-M.
La visualización óptima de estos datos utiliza
una combinación de CSS y contenido de ADN. Las
células observadas en el histograma en el área por
debajo del nivel de G0-G1 pueden estar experimen­
tando una apoptosis51. Cuando se trata de tinción de
ADN, debe utilizarse una fuente celular consistente
de ADN (p. ej., eritrocitos de pollo) como referencia
interna para evaluar el contenido de ADN y la dis­
tribución del ciclo celular.
Cabe puntualizar que se han desarrollado varios
algoritmos informáticos destinados a determinar
la proporción relativa de cada compartimento del

FIG. 2.6  (A) Valoración del contenido de ADN como reflejo del ciclo celular, que muestra células
en las fases G1, S y G2-M. (B) Valoración de células vivas frente a células muertas, en función
de las características de dispersión frontal (FSC) y lateral (SSC). (C) Valoración de la apoptosis
celular, utilizando yoduro de propidio (PI) y Dioc6 (3), con identificación de células que han iniciado
recientemente la apoptosis (temprana) y de células muertas (apoptosis tardía) y vivas.

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26 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
ciclo celular, por lo que la selección del programa
informático apropiado no es un aspecto intrascen­
dente. Los principales fabricantes de instrumental
comercializan programas de análisis del ciclo celular,
y se dispone asimismo de programas de terceros. En
general, el programa más idóneo es el que permite
elaborar modelos de dos o más poblaciones aneu­
ploides, sustrayendo los residuos (en particular, si se
usa material de archivo incluido en parafina y fijado
con formol [FFPE]) y con una precisa estimación de la
células en fase S51,52. La combinación de un marcador
de superficie y del ciclo celular ha sido muy útil para
diferenciar las poblaciones de células normales de
las poblaciones de células tumorales. Un ejemplo es
el uso de reactivos anti-k-, anti-λ-, o reactivos frente
a linfocitos B para separar el clon de linfocitos B
aneuploides de los restantes linfocitos B normales y
reactivos en una mezcla de células linfocíticas. Otro
utiliza la citoqueratina como marcador para distinguir
entre las células tumorales y las células inflamatorias.
Otro acontecimiento destacado en el análisis del
ciclo celular ha sido el desarrollo de una técnica que
utiliza la incorporación de bromodesoxiuridina53.
Este análogo de la timidina se emplea directamente
para determinar el porcentaje de células en fase S. Por
otro lado, cuando se aplica en estudios cinéticos, per­
mite determinar los tiempos individuales de cada uno
de los componentes del ciclo celular y determinar la
fracción de crecimiento. Por último, recientes avances
han determinado la disponibilidad de dos reactivos
de anticiclina que permiten evaluar los puntos de
transición del ciclo celular en las células malignas54.
DETECCIÓN DE LA APOPTOSIS
La citometría de flujo se ha convertido en el método
de elección para la detección y cuantificación de la
apoptosis celular55, en parte debido a su capacidad
para evaluar con rapidez un gran número de células
y muestras. Muchas de las características distintivas
de una célula apoptósica pueden evaluarse usando la
citometría de flujo basada en la dispersión de la luz,
los cambios en la membrana plasmática, el potencial
transmembranario mitocondrial, el contenido de
ADN y la integridad del ADN.
Las propiedades de dispersión de la luz de una
célula que sufre muerte celular programada son los
atributos más simples que se pueden evaluar median­
te la citometría de flujo. Las células moribundas típi­
camente se encogen, produciendo una pérdida de
FSC, y, a pesar de un aumento transitorio inicial de la
CSS, finalmente muestran una disminución de la CSS
(v. fig. 2.6B). El uso de la dispersión de la luz puede
combinarse con la tinción de la superficie celular,
para contribuir a la identificación de las células que
están muriendo. No obstante, los cambios en la dis­
persión por sí solos no son específicos de la apoptosis
y han de acompañarse de otra característica adicional
asociada a la muerte celular. Las células vivas tienen
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fosfolípidos distribuidos de forma asimétrica en las
membranas plasmáticas interna y externa, con fos­
fatidilcolina y esfingomielina en la superficie externa
y fosfatidilserina (PS) en el lado interno. Al comienzo
de la apoptosis las células pierden asimetría, expo­
niendo la PS al exterior. La anexina V es una proteína
que se une preferentemente a los fosfolípidos de
carga negativa, como la PS, y la anexina V conjugada
directamente es un reactivo útil para la detección
específica de células apoptósicas55.
Otra característica de las membranas plasmáti­
cas asociadas a las células vivas es que rechazan los
colorantes catiónicos cargados, como PI y 7-amino-
actinomicina-D (7-AAD). En consecuencia, solo las
células en una etapa tardía de apoptosis, con las
membranas celulares rotas, absorberán estos colo­
rantes. Así, el uso combinado de colorantes catió­
nicos (p. ej., PI) con la anexa V permite discriminar
entre las células vivas (que no expresan anexa V ni
PI), las células apoptósicas tempranas (que expresan
anexa V pero no PI) y las células apoptósicas tardías
(que expresan anexa V y PI).
La valoración del potencial transmembranario
mitocondrial (∆ψm) es otro método de identifi­
cación de las células apoptósicas. Las células ven
reducido su ∆ψm en una fase muy temprana del
proceso apoptósico, antes de la rotura de la membra­
na plasmática, perdiendo su capacidad de acumular
colorantes dependientes del potencial, tales como
rodamina 123, JC-1 o 3yoduro de 3’ ’-dihexiloxa­
carbocianina (Dioc63). Estos colorantes también se
usan con PI para detectar células en diferentes fases
de la apoptosis (v. fig. 2.6C).
La medida del contenido de ADN también puede
emplearse para distinguir las células vivas de las célu­
las muertas, como se ha descrito antes (v. la sección
Análisis del ciclo celular). Este tipo de análisis tiene
que hacerse usando una escala lineal, no una escala
logarítmica, para discriminar las células moribundas
de los residuos. El desdoblamiento del ADN también
expone los extremos -OH asociados a las roturas del
ADN, y estos pueden detectarse mediante la unión
de desoxinucleótidos conjugados a fluorocromos,
en una reacción catalizada por TdT exógeno, una
técnica llamada TUNEL.
MULTÍMEROS PÉPTIDO-MHC
Conceptos clave
Tetrámeros péptido-MHC
• Útiles para valorar el número de linfocitos T
específicos frente al antígeno.
• Pueden dirigirse a los linfocitos T CD4+ y CD8+.
• Requieren información sobre el péptido
antigénico y la restricción por el antígeno
leucocítico humano (HLA) (complejo principal
de histocompatibilidad [MHC]).
 Capítulo 2  Principios de citometría de flujo
A diferencia de los linfocitos B, la visualización
directa de linfocitos T específicos frente al antígeno
ex vivo no ha tenido éxito hasta hace poco. En 1996,
Altman et al. introdujeron un nuevo método basado
en la citometría de flujo que permite visualizar y
cuantificar directamente los linfocitos T específicas
frente a antígenos56. Los multímeros péptido-MHC
solubles se generan de manera que capten múltiples
receptores de linfocitos T (TCR) al mismo tiempo,
lo que implica que la avidez de los ligandos multi­
méricos por estos TCR específicos frente a péptidos
se incrementa sustancialmente. El método conlleva
la creación de una secuencia de reconocimiento de
biotinilación en el extremo −COOH del dominio
extracelular de una cadena de la molécula del MHC,
que, tras combinarse con un péptido antigénico
específico, es enlazado por acción de la avidina o
la estreptavidina. Dado que tanto la avidina como
la estreptavidina tienen cuatro sitios de unión a la
biotina, el resultado es un complejo tetramérico pép­
tido-MHC que sirve de ligando para los linfocitos T
específicos, tanto para el péptido como para el MHC.
La detección mediante citometría de flujo se consi­
gue marcando la estreptavidina con un fluorocromo.
El principal inconveniente de este planteamiento
es la necesidad de conocer el péptido derivado del
antígeno y sus restricciones del HLA, así como el tipo
de HLA de cada sujeto estudiado. Desde el primer
informe, se ha realizado un número cada vez mayor
de estudios basados en tetrámeros. La mayoría se ha
centrado en la respuesta inmunitaria mediada por el
MHC de la clase I, tanto en los ratones como en los
seres humanos, a una variedad de microorganismos
infecciosos, como el citomegalovirus (CMV), el VIH,
el virus de Epstein-Barr (VEB) y otros. Desde la des­
cripción inicial con reconocimiento restringido de
la clase I, también se ha informado de la detección
de linfocitos T CD4 específicos frente a antígenos
con tetrámeros de moléculas del MHC solubles de
la clase II y péptidos unidos de forma covalente57.
Se han publicado estudios que, además de demos­
trar la viabilidad de este abordaje, han aportado
nuevas interpretaciones de la respuesta inmunitaria
mediada por el MHC de la clase I. Por ejemplo, ha
quedado claro que el alcance de la respuesta celular
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mediada por la clase I del MHC es mucho mayor
de lo que antes se pensaba. Por otra parte, la nota­
ble proliferación de los linfocitos T CD8 durante
una infección aguda no es consecuencia de una
activación, sino que obedece a una expansión de
los linfocitos T CD8 específicos frente al antígeno.
Las pruebas con tetrámeros de péptido-MHC han
arrojado resultados prometedores en el estudio de
la cinética de las respuestas inmunitarias primarias
y secundarias y han incrementado el conocimiento
de nociones tales como inmunodominancia o el
agotamiento clonal.
Un aspecto obviamente atractivo de esta técnica
es que la tinción de tetrámeros puede combinarse
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con varios marcadores de la superficie celular y feno­
típicos y funcionales intracelulares. Ya hay indicios
de que el fenotipo de los linfocitos T específicos
frente al antígeno varía entre los individuos y entre
las diferentes fases de la respuesta inmunitaria. Ade­
más, los linfocitos T que se unen a los tetrámeros
pueden clasificarse para su ulterior análisis, como
análisis de citotoxicidad o de expansión in vitro. La
técnica basada en los tetrámeros no solo se ha mos­
trado útil en el estudio de la respuesta inmunitaria a
los microorganismos infecciosos, sino que también
se ha aplicado al estudio de la tolerancia oral, las
enfermedades autoinmunitarias y la inmunología
tumoral. Es probable que esta técnica muy sensible
y específica y otros enfoques que definen la respuesta
específica al antígeno encuentren muchas más apli­
caciones y conduzcan a nuevos descubrimientos y a
una reevaluación de ciertos conceptos existentes58.
CONCLUSIONES
Perspectivas futuras
• La combinación de la citometría de flujo
y la espectrometría de masas aumenta el
número de marcadores celulares analizados
simultáneamente (≥35 en la actualidad), lo que
incluye objetivos extracelulares e intracelulares,
con el fin de aportar una evaluación detallada
y amplia de los marcadores funcionales.
• La citometría de flujo en la que se utilizan
análisis de luz espectral, en vez de tradicional,
permite evaluar de manera precisa más
«colores» sin necesidad de complejos
esquemas de compensación con el fin
de manejar las emisiones de luz solapada de
los fluorocromos tradicionales. De este modo
se facilita la realización en el laboratorio clínico
de estudios policromáticos más extensos.
La citometría de flujo se ha hecho fácilmente dis­
ponible en los laboratorios clínicos, y la aplicación
de esta técnica ha avanzado junto a mejoras signifi­
cativas en la instrumentación y la disponibilidad de
una serie de reactivos monoclonales. Una citometría
de flujo correctamente realizada puede proporcionar
una identificación rápida y precisa de las subpo­
blaciones de linfocitos. Las principales indicaciones
clínicas del inmunofenotipado siguen siendo la
cuantificación de los recuentos de linfocitos T CD4
en la infección por el VIH, la asignación del linaje en
leucemias y linfomas, la evaluación de otros tipos de
células hematológicas y la evaluación de la expresión
de CD34 para identificar células madre para el tras­
plante. Otros usos comprenden la caracterización
de trastornos por inmunodeficiencias, la evaluación de
enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema
inmunitario y la evaluación de los pacientes después
de un trasplante de órganos. Por lo general, el inmu­
28 Técnicas básicas de laboratorio en inmunología clínica
nofenotipado no es una técnica diagnóstica, sino
que interviene en la evaluación y comprensión de
trastornos complejos y en la evaluación longitudinal
del tratamiento inmunomodulador.
Es fundamental reconocer que el inmunofenoti­
pado es un medio para identificar las células, pero
no está orientado a la función celular. La expansión
de las técnicas de citometría de flujo para evaluar
las características intracelulares, evaluar los cambios
intracelulares asociados a la activación, caracterizar
la apoptosis e identificar los linfocitos T específicos
frente al antígeno ha llevado esta técnica al campo
de la función celular. Estos nuevos enfoques amplían
la utilidad de la citometría de flujo como un método
valioso para caracterizar varios aspectos de la función
inmunitaria.
Este trabajo fue apoyado en parte por el Intra-
mural Research Program de los National Institutes of
Health Clinical Center.
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