INTRODUCCIÓN

Objetivo de la purificación de enzimas:

El bioquímico James Batcheller Sumner en el año 1926, purificó y aisló la primera

enzima, la ureasa. Ésta se llevó a cabo mediante la cristalización a partir de extractos de
habas.

La purificación es el proceso que cuenta con varias etapas, cuyo objetivo es lograr la
concentración diferencial de la proteína de interés, también podemos decir que purificar
una proteína es un paso básico para poder conocer la función que tiene la misma.

Purificación de proteínas:

Las proteínas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En etapas

independientes, aprovechan las propiedades químicas y físicas de dichas proteínas que
interesan para separar progresivamente de otras proteínas y/o de las demás sustancias.

Las características de las proteínas que se emplean en los diversos procedimientos

de separación son: solubilidad, carga iónica, tamaño molecular, propiedades de absorción y
capacidad de unión a otras moléculas biológicas (Voet & Voet, 1992).

Definición de enzimas:

La enzima es un tipo de proteína soluble que funciona como catalizador biológico.

Acelera la velocidad de una reacción química en la célula, ya que estos procesos
podrían durar años, días, u horas.

Esta se utiliza en la reacción, pero no se consume, la misma se utiliza una y otra

vez; participan en casi todas las reacciones de los seres vivos.

Existen dos localizaciones en donde se pueden encontrar a las enzimas. una de

ellas es la localización extracelular, son aquellas que actúan fuera de las células que las
producen. Por otro lado se encuentra la localización endocelular que actúan en las propias
células que producen a la enzima.

Descripción de la reacción enzimática en estudio:

Hablamos de reacción enzimática con respecto a la energía de su activación, cuando

decimos que la velocidad de la reacción aumenta, la barrera energética debe disminuir
gracias a la presencia del sitio catalítico, permitiendo más sustrato. Esto implica que
mayores moléculas de sustrato se transforman en producto en un mismo intervalo de
tiempo, finalmente aumentando así la velocidad de la reacción.

Si bien hablamos de un mínimo intervalo de tiempo para dar producto, la variación de

energía libre de la reacción enzimática y su sentido no varían, cambia solo la energía de
activación, la cual al disminuir favorece a un gran incremento de la velocidad de la reacción
 El sustrato es atraído hacia el sitio catalítico de la enzima, el cual es un pequeño lugar,
donde las moléculas están en contacto estrecho pudiendo interactuar entre sí, ocasionando
la disminución de la barrera energética, llegando al estado de transición más rápidamente,
al disminuir la energía de activación requerida.

- Para que este sustrato se transforme en producto debe sufrir cambios en su estructura
y función, lo que implica un gasto de energía, llamada energía de activación, la enzima
ayuda al sustrato a que esta barrera energética disminuya uniéndose al sitio catalítico,
pudiendo así llegar al estado de transición.

OBJETIVOS:

Durante la purificación de la enzima Proteinasa Aspártica se obtuvieron dos fracciones (A y

B).

-Determinar cuál de estas fracciones obtenidas mantiene la actividad biológica de la enzima.

MATERIALES:

➢ 4 tubos experimentales
➢ Sustrato de caseína
➢ Fracciones obtenidas por la purificación de Proteinasa aspártica
➢ Baño termostatizado
➢ Ácido
➢ Espectrofotómetro
MÉTODOS:

● Se obtienen mediante purificación de la enzima Proteinasa Aspártica dos

fracciones (A y B)
● Se coloca fracción A en dos tubos, y fracción B en dos tubos más.
● Se emplea también la misma concentración de sustrato de caseína en los 4
tubos al mismo tiempo.
● Se introduce el mismo buffer a los tubos para que no varíe el pH.
● Seguidamente los mismos se introducen en un baño termostatizado(baño
maria) 37ºC.
● A los 5 minutos se le agrega ácido al tubo 1 de la fracción A y tubo 1 de la
fracción B, lo cual provoca que se corte la reacción.
● Luego de otros 5 minutos, se vuelve a realizar el mismo procedimiento pero
en los dos tubos restantes de las fracciones ya nombradas A y B.
● Se mide la absorbancia de los 4 tubos mediante un espectrofotómetro a 280
nm.
● Se realiza la gráfica absorbancia en función del tiempo, sabiendo que la
absorbancia es directamente proporcional al producto.
RESULTADOS ESPERADOS:

Tras el desarrollo de la práctica, se espera:

-Identificar la fracción enzimática biológicamente activa mediante la absorbancia de las

muestras.

-Por medio de estas últimas construir una gráfica para analizar la actividad de las fracciones
A y B.

CONCLUSIÓN:

Luego de realizar una investigación del tema y efectuar una práctica de acuerdo a lo
investigado,se llegó a la conclusión de que cuanta más cantidad de enzimas hay en un
medio, mayor es la actividad catalítica; muchas enzimas no trabajan solas, sino que
necesitan de un grupo proteico que es una parte no proteica; la misma se encuentra en el
sitio activo de la enzima.

En base a nuestro objetivo y la práctica realizada podemos concluir que a medida que el
tiempo transcurre se crea más producto, el cual tiende a elevarse en la fracción que se
encuentra la enzima activa biológicamente; claramente podemos observar este
comportamiento en la fracción A de la gráfica que realizamos de absorbancia (P) en función
del tiempo (m).Si comparamos la fracción B y la fracción A llegamos a la conclusión de que
la enzima activa biológicamente se encuentra en la fracción A; ya que está aumenta la
velocidad de reacción a medida que el tiempo avanza, rompiendo la barrera energética
necesaria y disminuyendo la emergencia de activación; esto le permite a la fracción A
generar más producto que la fracción B en igual tiempo.

Fig. 1
Fig. 2

● Mediante la gráfica se determina que a medida que el tiempo avanza la aparición del
producto aumenta. En este caso el producto se midió mediante absorbancia
● La fracción A demuestra una elevada concentración de producto con respecto a la
fracción B lo que indica la actividad enzimática activa en los tubos A.
● La elevación de la fracción A se debe a la catálisis producida por la enzima, ya que
pasa la barrera energética, produciendo que se necesite menos energía de
activación, aumentando la velocidad de la reacción y generando más producto en el
mismo tiempo que la fracción B.

Autores o Créditos:

Introducción:Correa Jaime; Antonioli Celina; Bravo Marcela

Objetivos:Izaguirre Josefina; Baña Martina

Materiales:Sosa Sofía; Martinez Melina

Métodos:Sosa Sofia; Martinez Melina

Resultados esperados:Izaguirre Josefina

conclusión: González Alejandra; González Rodrigo; Sosa Sofia

Diseño: Mazziotti Carolina; Correa Jaime

Video:
González Mañas, J.M.(s.f.-a). Curso de Biomoléculas .Enzimas.
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz1.htm#t

González Mañas, J.M.(s.f.-a). Curso de Biomoléculas. Enzimas. [Imagen].

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y Fisicoquímica de una Proteinasa Aspártica Aislada de Frutos Maduros de
Salpichroa origanifolia. Información Tecnológica ,Vol. 21(2), 21–28.
https://eva.fvet.edu.uy/pluginfile.php/70453/mod_resource/content/1/Rocha%20et%2
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