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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ICB 536 Laboratorio de Biocatálisis Enzimática

Informe técnico 1

Nombre del alumno: Lucas Donoso


Jesús valencia
Alvaro Matus

Nombre del profesor: Lorena Wilson


Zaida Cabrera
Cecilia Guerrero
Oscar Romero

30 de abril 2021
2

1. RESUMEN

Este informe tiene como objetivo presentar 3 experiencias desarrolladas que permitieron la
caracterización de enzimas como catalizadores enzimáticos, determinando su actividad e
identificando su mecanismo cinético, sumado a lo anterior la identificación de diversos parámetros
cinéticos y el efecto que pueden tener una gama de variables ambientales sobre estos, tales como
el pH y la temperatura, entre otros. Finalmente, para el desarrollo de las tres experiencias se
utilizó la enzima β-galactosidasa de Aspergillus oryzae para la determinación de diversos
parámetros.

En la primera experiencia se llevó a cabo la determinación de actividad enzimática soluble e


inmovilizada, la cual se desarrolló buscando el cumplimiento de dos grandes objetivos:
Cuantificación de la capacidad catalítica de un preparado enzimático soluble; Cuantificación de la
capacidad catalítica de un preparado enzimático inmovilizado. Para el cumplimiento de ambos
objetivos se trabajó a temperatura constante de 40°C, y una toma de 16 muestras, siendo la
primera de estas el blanco (no contiene la enzima); La diferencia radica en que para el
cumplimiento del segundo objetivo se utilizó una solución de nuestra muestra esta vez
inmovilizada. Finalmente fue mediante el método de glucostat que se calcularon las diferentes
actividades enzimáticas

En la segunda experiencia se llevó a cabo la determinación del efecto de las variables ambientales
(pH y Temperatura) sobre la actividad enzimática soluble e inmovilizada, la cual también se
desarrolló buscando responder a dos grandes objetivos: Desarrollar una experiencia que permita
determinar el efecto del pH sobre la velocidad inicial de reacción de un preparado enzimático
soluble e inmovilizado; Desarrollar una experiencia que permita determinar el efecto del pH sobre
la velocidad inicial de reacción de un preparado enzimático soluble en inmovilizado. Fue una gama
de muestras tomadas a distintos pH y temperaturas, las que permitieron el cálculo de la velocidad
inicial de reacción mediante el método de glucostat.

Finalmente, en la tercera experiencia se desarrolló buscando responder dos objetivos; Desarrollar


una experiencia práctica que permita determinar los parámetros cinéticos, Km y Vm, de una
enzima soluble; y Desarrollar una experiencia practica que permita determinar el parámetro
cinético de inhibición, Kl, de una enzima soluble. Para el cumplimiento de estos objetivos fue
necesario la implementación de métodos lineales y no lineales que permitieran el cálculo de
parámetros cinéticos
3

INDICE GENERAL

2. REVISIÓN BILIOGRÁFICA.................................................................................................................4
2.1 Generalidades..............................................................................................................................4
2.2 Actividad enzimática en enzimas solubles e inmovilizadas..........................................................4
3.3 Efectos del pH y temperatura sobre la actividad enzimática........................................................5
3.3 Determinación de parámetros cinéticos con y sin inhibición.......................................................5
3.4 B-galactosidasa.............................................................................................................................6
1. RESULTADOS Y DISCUCIONES.....................................................................................................7
2.1.Determinación de la actividad enzimática en enzima soluble e inmovilizada..............................7
2.2Determinación del efecto de las variables ambientales pH y Temperatura..................................8
2.3 Determinación de parámetros cinéticos con y sin inhibición de una enzima soluble...................9
2. CONCLUSIONES........................................................................................................................12
3. Referencias...............................................................................................................................13
4. ANEXOS....................................................................................................................................14
4

2. REVISIÓN BILIOGRÁFICA

2.1 Generalidades

Muchas reacciones químicas pueden ocurrir de forma espontánea, otras necesitan ser catalizadas.
Los catalizadores son moléculas que reducen la energía de activación, la cual actúa como barrera
en el proceso de conversión de una sustancia en otra. En la célula ocurren reacciones
denominadas reacciones bioquímicas y requieren ser catalizadas para sostener la vida. Tales
catalizadores sostenedores de la vida son las enzimas[CITATION Ill \l 13322 ]. Las enzimas son
proteínas, polímeros formados por aminoácidos covalentemente unidos entre sí y actúan como
catalizadores biológicos específicos, selectivos, naturales y biodegradables. En la estructura
tridimensional formada por las proteínas existen cavidades denominadas “Sitio activo”. Estas
cavidades poseen afinidad por moléculas específicas, que serán convertidas en nuevas moléculas
debido a la afinidad que presentan con las interacciones covalentes y no covalentes entre la
proteína y el sustrato. Así como cualquier catalizador, al finalizar la transformación del sustrato en
producto, la enzima puede regresar a su estado original e iniciar nuevos ciclos de catálisis
[ CITATION Ram14 \l 13322 ].

2.2 Actividad enzimática en enzimas solubles e inmovilizadas

La actividad enzimática representa el máximo potencial catalítico de una enzima bajo un conjunto
de condiciones determinadas [ CITATION Ill \l 13322 ]. La actividad catalítica que poseen las
enzimas puede ser determinada al medir la velocidad inicial de una reacción, que corresponde a la
curva de progreso de aparición de producto o desaparición de sustrato, en el tiempo cero.
Inicialmente, las reacciones transcurren de forma lineal, pudiéndose tomar la pendiente la
pendiente de esta recta como la velocidad inicial de reacción. A medida que avanza el tiempo, el
progreso de la reacción se aparta de la linealidad y la velocidad de reacción disminuye debido a la
disminución del sustrato. Existen otros factores que influyen que pueden afectar la actividad
enzimática, como el pH, la temperatura que provoca la denaturación de la estructura terciaria de
las proteínas, aumento de la concentración de producto, inactivación e inhibición de la enzima,
entre otros [ CITATION Ten08 \l 13322 ]
5

Las enzimas inmovilizadas son aquellas que están confinadas en un espacio definido, el cual
retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada de forma continua. Las estrategias de
inmovilización de enzimas pueden mejorar propiedades como estabilidad, actividad, selectividad y
especificidad.

2.3 Efectos del pH y temperatura sobre la actividad enzimática

La actividad de una enzima es afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reacción. La relación que
existe entre pH y la actividad enzimática dependerá del comportamiento ácido-base de la enzima y
del sustrato. Esto ocurre debido a que los sitios activos pueden contener diferentes grupos
funcionales ácidos o básicos que determinarán (según su grado de disociación) la conformación de
la proteína, la capacidad de unión que tendrá el sustrato al cetro activo de la enzima (K m) y la
capacidad de transformación del sustrato (k cat). En el caso más general, la curva determinada al
graficar pH-actividad enzimática corresponde a una forma de campana, siendo el extremo máximo
de la función el pH óptimo de la enzima [ CITATION Ten08 \l 13322 ].

La velocidad con que ocurren las reacciones enzimáticas puede variar en función de la
temperatura, de manera que incrementan en un rango de temperatura óptimo. Durante la fase de
incremento de velocidad, la relación entre esta y la temperatura viene dada por la ecuación de
Arrhenius. A valores altos de temperatura la actividad enzimática disminuye dado que, como en
cualquier proteína, sufre procesos de desnaturalización térmica [ CITATION Ten08 \l 13322 ].

2.4 Determinación de parámetros cinéticos con y sin inhibición.

Las moléculas que reducen la actividad enzimática ralentizándola o inhibiéndola reciben el nombre
de inhibidores. Estos pueden ser fármacos, antibióticos, conservadores de alimentos, venenos. La
inhibición enzimática puede ser reversible cuando el efecto inhibitorio de un compuesto puede
contrarrestarse aumentando la concentración de sustrato o retirando el compuesto inhibidor
mientras la enzima permanece intacta. La inhibición irreversible ocurre cuando la unión al
inhibidor altera de manera permanente la enzima, por lo común, a través de una reacción
covalente que la modifica permanentemente [CITATION McK13 \l 13322 ]

Los valores de Km y Vmax de una enzima se determinan midiendo las velocidades iniciales de
reacción a varias concentraciones de sustrato. Estos valores aproximados se pueden obtener
6

cuando se construye un gráfico mediante el diagrama de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk. Si


una enzima obedece a la cinética de Michaelis-Menten, se ajusta la velocidad de reacción 1/V o en
función de la concetración de sustrato 1/S o, tal que la pendiente será Km/Vmax. De la misma forma,
la intersección del gráfico con el eje de las ordenadas será 1/V max.

2.5 B-galactosidasa

Las β-galactosidasa son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces galactosídicos beta-1,4 pero
también pueden catalizar la síntesis de oligosacáridos. Tales enzimas se encuentran presente en la
naturaleza en una multitud de animales, plantas y microorganismos. Las β-galactosidasa pueden
llevar a escindir el disacárido de lactosa para formar glucosa y galactosa[ CITATION Ana19 \l
13322 ].

Figura 1 Hidrólisis de lactosa usando β-galactosidasa.

La β-galactosidasa presenta una estructura mucho más compacta y rígida, lo cual le otorga una
mayor resistencia a la desnaturalización térmica, debido a esto la temperatura óptima de está
enzima ronda alrededor de los 80°, mientras que la máxima actividad enzimática se obtiene
cuando el pH tiene un valor de 7. Estas características de temperatura y pH óptimo indican que
esta enzima es idónea para poder ser utilizada en la industria láctea gracias a su termoestabilidad
y su pH neutro que puede ser utilizado en procesos lácteos sin alterar la calidad del producto y
manteniendo un funcionamiento normal, sin que haya pérdida de actividad [ CITATION Ana19 \l
13322 ].

Los objetivos que darán lugar al trabajo experimental serán determinar la actividad catalítica de la
b-galactosidasa en distintas situaciones. La primera experiencia será determinar la actividad de la
7

enzima cuando se estudia en su forma soluble e inmovilizada. La segunda experiencia consiste en


el análisis de la actividad enzimática cuando se modifica el ambiente del medio de reacción, a
través de parámetros como la temperatura y el pH. Finalmente, se determinan los parámetros
cinéticos cuando la enzima presenta inhibición y cuando no lo hace.

3. RESULTADOS Y DISCUCIONES

A continuación, se presentan los distintos resultados obtenidos de las experiencias hechas de


laboratorio. En estas prácticas se utilizó un preparado enzimático comercial soluble de la enzima β-
galactosidasa de Aspergillu sOryzae. Se adjunta tablas, gráficos y figuras que permitirán
comprender mejor los resultados y las discusiones críticas. ola

3.1 Determinación de la actividad enzimática en enzima soluble e inmovilizada

Esta experiencia práctica permite conocer la actividad catalítica de un preparado enzimático


soluble y un preparado enzimático inmovilizado. Los preparados de enzimas comerciales pueden
incluir cantidades variables de materia contaminante proteica y no proteica, excipientes y
conservantes, por lo cual, es necesario determinar la actividad enzimática de la enzima en su
máximo estado de pureza.

Esta experiencia se realizará en dos partes y cada parte contará con dos subexperiencias. Para
ambas actividades se trabajará con la enzima β-galactosidasa de Aspergillus oryzae, una solución
de hidróxido de sodio para inactivar la enzima y un preparado de solución de lactosa. A diferencia
de la primera experiencia, en la segunda parte se trabajará con un preparado enzimático
inmovilizado con glioxil-agarosa. Por cada parte de esta experiencia se contó con un total de 32
muestras (incluyendo el blanco) contabilizando 16 muestras por cada subexperiencia, que
posteriormente fueron utilizadas para el cálculo de la actividad enzimática

La segunda parte de la experiencia se realizó de la misma forma en que se desarrolló la primera


parte, con la diferencia que esta vez se utilizó una enzima inmovilizada, y al igual que en la primera
parte se contó con un total de 32 muestras, que corresponden a 16 muestras por cada
8

subexperiencia; que posteriormente fueron utilizadas para el cálculo de la actividad enzimática.


(Ver Anexo A).

El método utilizado para la obtención de la actividad enzimática fue el método de glucostat, que
consiste básicamente en una mezcla de 1mL de reactivo glucostat con 0,1 mL de las diferentes
muestras obtenidas; mediante la obtención de la absorbancia de cada muestra se puede obtener
una gráfica que permitirá determinar el rango en que la velocidad inicial es máxima (Figura 3.1.1;
Figura 3.1.2; Figura 3.1.3; Figura 3.1.4)

1
0.9 f(x)
f(x) == 0.12
0.11 xx ++ 0.01
0.03
0.8 R²
R² == 0.99
0.99
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ex1A Tiempo [min] Linear (Ex1A)
Ex1B Linear (Ex1B)
Figura 3.1.1 Gráfico de actividad enzimática enzima soluble.
9

0.5
0.45 f(x)
f(x) == 0.05
0.06 xx +− 0.03
0

R² == 0.97
1
0.4
Concentración [g/L]umol/[min*ml]

0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ex2a Linear (Ex2a)
Tiempo [min]
Ex2b Linear (Ex2b)
Figura 3.1.2 Gráfico de actividad enzimática enzima soluble.

0.180
0.160 f(x)
f(x)==0.02
0.02xx−−00

R²==10.99
0.140
Concentración [g/L]umol/[min*ml]

0.120
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
0 2 4Ex1A 6 8
Linear (Ex1A) 10 12
Ex1B Tiempo Linear (Ex1B)
Figura 3.1.3 Gráfico de actividad enzimática enzima inmovilizada.
10

0.100
0.090
f(x) = 0.01 x + 0
0.080 f(x)
R² ==10.01 x + 0
Concentración [g/L]umol/[min*ml]
0.070 R² = 0.98

0.060
0.050
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo

Ex2A Linear (Ex2A)


Ex2B Linear (Ex2B)
Figura 3.1.4 Gráfico de actividad enzimática enzima inmovilizada.

Finalmente, con la obtención de cada ecuación (Ver Tabla …..) se procede al cálculo de la actividad
enzimática que está dado por la ec 1 y ec 2 (Ver Anexo …).
11

3.2 Determinación del efecto de las variables ambientales pH y Temperatura.

En esta experiencia práctica se desarrollarán dos objetivos. El primer objetivo será determinar el
efecto que tiene el pH sobre la velocidad de reacción inicial. El segundo objetivo permitirá
determinar el efecto de la temperatura sobre la velocidad inicial de reacción. Para ambas
actividades, se utilizarán preparados enzimáticos solubles e inmovilizados. La temperatura inicial
con que se evaluará la actividad enzimática será de 20 °C e irá subiendo consecutivamente en 10
°C hasta llegar a una temperatura final de 80 °C. Para determinar la actividad enzimática, es
necesario que la reacción ocurra en baños termoestables de ebullición durante dos minutos y se
determinan condiciones de operación, las cuales serán especificadas en el anexo.

Una vez obtenidas las concentraciones en función del tiempo a diferentes temperaturas, se
grafica la figura X.
12

0.9
0.8 20 °C
30 °C
0.7
40 °C
0.6

Concentracion [g/L]
50 °C
0.5 60 °C
0.4 70 °C

0.3 80 °C

0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo[ min]

Figura X Concentración de glucosa en el tiempo usando diferentes temperaturas de reacción.

Una vez obtenido el gráfico, se observa que existe un comportamiento lineal de las velocidades de
reacción, por lo tanto, a través de la ecuación de la recta es posible determinar la velocidad la
pendiente de esa recta. La pendiente es la velocidad máxima de reacción en los tiempos iniciales y
tiene unidades de g/L/min Es necesario hacer un cambio de unidades de las velocidades iniciales
de reacción a diferente temperaturas, de tal forma que se expresará la velocidad de reacción
utilizando la ecuación X.
13

3.3 Determinación de parámetros cinéticos con y sin inhibición de una enzima soluble.

Esta experiencia práctica permite conocer los parámetros cinéticos de un preparado enzimático
soluble. Para cuantificar los parámetros cinéticos de un preparado enzimático soluble es necesario
llevar a cabo experiencias por triplicado, en la tabla del anexo se muestra el promedio de las
pendientes iniciales obtenidas de la gráfica producto versus tiempo, para cada
concentración de lactosa y galactosa analizada. La reacción se lleva a cabo en contactando
0,1 mL de la solución del preparado enzimático comercial de β-galactosidasas sin dilución
con 1,9 mL de la solución de lactosa y galactosa a las distintas concentraciones analizadas.
La enzima es inactivada en un baño a ebullición por 2 minutos.
En esta experiencia se cuantificaron los parámetros cinéticos de una enzima soluble mediante el
método de linealización de Lineweaver-Burk por inversa de los datos( vease anexo). De la tabla de
los inverso tabla anexo se graficaron los datos obteniéndose los diferentes perfiles de lactosa por
cada concentración de inhibidor (figura...)
14

figura: grafica de perfiles de lactosa para cada concentración de inhibidor.


Teniendo la ecuación para cada perfil, se procede a calcular los parámetros Vap y Kap por medio
de la pendiente y el intercepto (véase anexo). (tabla....).

[galactosa] 0 0.3 0.9 1.5 2.1


Pendiente 645.91 775.13 1033.9 1266.6 1524.8
Intercepto 5.1718 5.1704 5.156 5.1525 5.1532
Vm 0.193356278 0.193408634 0.193948798 0.194080543 0.19405418

Km 124.8907537 149.9168343 200.5236618 245.8224163 295.8938136


Tabla: parámetros cinéticos Vm y Km.
Se analizaron los parámetros Vm y Km respectivamente, Vm manteniendo sin modificación
mientras que Km va aumentando. Con lo anterior muestra tener una inhibición competitiva.

Sabiendo la inhibición
15

Gráfica: Grafica de parámetro de inhibición KI.

Kap [I]
149.9168343 0.3
200.5236618 0.9
245.8224163 1.5
295.8938136 2.1
pendiente 80.538
Intercepto 126.39
Km 126.39
Ki 1.56936213
Tabla: parámetro de inhibición (KI).
16
17

4. CONCLUSIONES

 Se concluyo mediante los cálculos realizados en el práctico, que Vap no se ve modificado,


mientras que Vap va aumentando en el tiempo, por lo tanto, se encuentra sometida a una
inhibición competitiva.
18

3. Referencias

Anaid, N. (2019). Purificacióny caracterización bioquímicade una β-galactosidasa térmofila. La


Coruña.

Illanes, J. (2008). Enzyme Biocatalysis. Valparaíso: Springer.

McKee, T., & McKee, J. R. (2013). Bioquímica: Las bases moleculares de la vida. McGraw Hill.
Obtenido de http://biblio3.url.edu.gt/Publi/Libros/2013/Bioquimica/09-O.pdf

Ramírez, J., & Araya, M. (2014). ENZIMAS: ¿QUÉ SON Y CÓMO FUNCIONAN? Revista Digital
Universitaria, 2.

Tena, M., & Jorrín, J. (2008). Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería.
Guía de laboratorio, Universidad de Córdoba, Departamento de bioquímica y biología
molecular, Córdoba. Obtenido de https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINETICA.pdf
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4. ANEXOS

Tabla 1. Concentración de glucosa a través del tiempo. Método medido por espectrofotometría.

Tiempo Concentración [g/L]


[min] Experiencia 1 Experiencia 2
0 0 0 0 0
1 0,135 0,12 0,078 0,042
2 0,223 0,215 0,135 0,1204
3 0,375 0,389 0,24 0,182
4 0,478 0,512 0,26 0,2324
5 0,65 0,598 0,31 0,266
6 0,71 0,721 0,375 0,336
7 0,756 0,784 0,405 0,392
8 0,868 0,924 0,434 0,462
10 1,176 0,952 0,588 0,476
12 1,204 1,232 0,644 0,6244
15 1,512 1,484 0,742 0,7392
20 1,736 1,624 0,924 0,9016
25 1,904 1,89 1,306 1,0304
30 2,016 2,0496 1,064 1,05
35 2,1 2,184 1,12 1,2768
20

Pendiente (g/L*min)
Lactosa
0 g/L 0,3 g/L 0,9 g/L 1,5 g/L 2,1 g/L
(g/L)
galactosa galactosa galactosa galactosa galactosa
225 0.1243926 0.1161 0.1024416 0.0926334 0.0837261
200 0.1190772 0.1105713 0.09675 0.0869661 0.0781821
175 0.1128753 0.1041921 0.0902997 0.0806247 0.0720477
150 0.1055457 0.09675 0.0829287 0.0734814 0.0652248
125 0.09675 0.0879543 0.0744228 0.0653715 0.0575892
100 0.0860004 0.0774 0.0645003 0.0560871 0.048987
75 0.0725625 0.0645003 0.0527724 0.0453519 0.0392229
50 0.0552861 0.048375 0.0387 0.0327969 0.0280431
37.5 0.0446535 0.0387 0.0305523 0.025686 0.0218232
25 0.0322497 0.0276426 0.0215001 0.0179163 0.0151173
12.5 0.0175905 0.0148842 0.0113823 0.0093933 0.007866
6.25 0.0092142 0.00774 0.0058635 0.0048132 0.0040149
3.75 0.0056358 0.0047196 0.0035613 0.0029169 0.0024291
1.25 0.0019161 0.0015993 0.0012015 0.0009819 0.0008163
Tabla: Promedio de las pendientes iniciales obtenidas de la gráfica producto versus tiempo, para cada concentración de lactosa y
galactosa.

1/Pendiente (g/L*min)
1/Lactosa
3.33333333 1.11111111 0.4761904
(g/L)
0 3 1 0.666666667 76
0.00444444 8.03906341 8.6132644 9.76165932 10.79524232 11.943706
0.005 8.39791328 9.04393816 10.3359173 11.49873341 12.790651

0.00571428 8.85933415 9.59765663 11.0742339 12.40314693 13.879693


0.00666666 9.47456883 10.3359173 12.0585515 13.60888606 15.331591
0.008 10.3359173 11.3695407 13.4367425 15.29718608 17.364366
0.01 11.6278528 12.919896 15.5038038 17.82941175 20.413579
0.01333333 13.7812230 15.503803 18.9492992 22.04979284 25.495310
0.02 18.0877291 20.6718346 25.8397932 30.49068662 35.659395
21

0.02666666 22.3946611 25.8397932 32.7307600 38.93171377 45.822794


0.04 31.0080403 6.1760471 46.5114115 55.81509575 66.149378
0.08 56.8488672 67.1853374 87.8557057 106.458859 127.12941
0.16 108.528141 129.198966 170.546601 207.7619879 249.07220
0.26666666 177.437098 211.882362 280.796338 342.8297165 411.67510
0.8 521.893429 625.273557 832.292967 1018.433649 1225.039
Tabla: linealización de dato por Lineweaver-Burk.

Método de linealización de Lineweaver-Burk

Figura: Ecuación de Michaelis-Menten.

Figura: Ecuación linealizada

Figura: parámetros Vm y Km.


22

V S
V1 S1
V2 S2
V3 S3
V4 S4
Tabla: concentración de sustrato Vs velocidad.

1/V 1/S
1/V1 1/S1
1/V2 1/S2
1/V3 1/S3
1/V4 1/S4
Tabla: inverso de los datos, métodos lineweaver-burk.

Inhibición competitiva

Figura: linealización Inhibición competitiva.


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Figura: Parámetro KI.


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