Laboratorio de Enzimología (BT2006)

Primera Evaluación Parcial

Nombre de los alumnos: Pamela Rodarte Villalobos, Mariana Becerril,Valeria

Ramos
Matrículas: A01334954, ,A01331697 Calificación:_________________
Fecha: 16 de septiembre del 2018

“Apegándome al Código de Ética de los Estudiantes del Tecnológico de

Monterrey, me comprometo a que mi actuación en este examen esté regida
por la honestidad académica”

______________________
Firmas

1.- Escriba la reacción de la catalasa y mencione su ubicación intracelular e

importancia biológica (Valor 5 puntos)

La catalasa realiza la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno en

agua y oxígeno:

La reacción catalizada por esta enzima, ocurre en dos etapas, en las cuales
interviene el hierro del grupo hemo de la hemoglobina y al manganeso como
cofactor:

La enzima se presenta en forma de homotetrámero y se localiza en los

peroxisomas.

La enzima catalasa tiene una alta importancia biológica debido a que el peróxido
tiene una alta toxicidad y debe ser transformado inmediatamente para evitar daños
en el organismo. Además, la catalasa cumple con una función protectora contra
determinados organismos, especialmente los anaerobios ya que las bacterias
mueren al estar en contacto con el oxígeno desprendido de la reacción, el cual
funge como bactericida. Correcto, solo recuerden colocar la referencia. Catalasa
también forma parte del sistema antioxidante de eucariotes, entre ellos el humano.
2.- La catalasa y la glutatión peroxidasa catalizan la conversión de peróxido
de hidrógeno en agua, es decir son dos enzimas con el mismo sustrato. De
acuerdo al procedimiento de la práctica 1 usted debió extraer la enzima
(catalasa) de diversas fuentes y medir la actividad enzimática tomado como
indicador la disminución de la absorbancia. ¿Puede asegurar que se esta
midiendo la actividad de catalasa? ¿Sería posible que la disminución de la
absorbancia observada durante el transcurso de la reacción incluyera la
actividad de glutatión peroxidasa? ¿Qué experimento podría discernir entre
la actividad de estas enzimas? (Valor 10 puntos)

La catalasa y la glutation peroxidasa son isoformas y ambas enzimas se

encuentran presentes en la muestra obtenida; por ejemplo en el hígado. Debido a
que la absorbancia medida es la del peróxido y ésta va disminuyendo conforme
reacciona no hay manera de asegurar que la reacción se lleva a cabo únicamente
por la catalasa. Al realizar investigación se sabe que la catalasa actúa en
concentraciones altas de peróxido, mientras que la GPx lo hace en
concentraciones bajas; sin embargo, este no es un criterio suficiente para estar
completamente seguros de que la actividad catalítica se debe a una sola enzima.
Si el factor económico no fuese un impedimento se podría ocupar una técnica con
radioisótopos para permitir la identificación de la enzima glutation peroxidasa. Commented [1]: Not sure, aparte es un método muy
costoso. Debe haber una manera más sencilla
No son isoformas ya que tiene diferente composición de aminoácidos, son
enzimas redundantes. Si puden utilizar isótopos, también pueden realizar una
purficiación de peroxisomas, Catalasa en peroxisoma, GPX en citoplasma y sacar
por diferencia la actividad de catalasa. Pueden inhibir una de las dos, GPX actúa
sobre otros peróxidos, no solo el de hidrógeno.

3.-Enumere y explique los controles que se deben utilizar para la

determinación de catalasa de acuerdo al protocolo de la práctica 1 (Valor 10
puntos)

Para la determinación de catalasa es necesario utilizar diferentes muestras blanco

o control:
El primer control es la medición de PBS a 240 nm, el cúal se calibra como el
blanco en el equipo.
El segundo control es la medición de peróxido al 1%, como ya se mencionó antes,
este control nos permite evaluar las condiciones del peroxido, y asi evaluar si es
confiable su uso durante el experimento.
El tercer control es el “basal”, el cuál solo contienela muestra a medir en el PBS,
esto nos permite saber las condiciones de la muestra, si la enzima está teniendo
actividad, es decir, que esté interactuando con otro sustrato diferente al peróxido y
así saber sí habrá interferencias o saber de la presencia de algún contaminante en
la muestra. Correcto
4.- Enumere y explique 2 puntos críticos durante el proceso de extracción de
la enzima de la práctica 1 (Valor 10 puntos) Commented [2]: ok no puse mucho mas hehe,pero dejen
1. Para la extracción de la enzima se debe mantener una temperatura baja preguntno
para disminuir el riesgo de actividad proteolítica y degradación enzimática.
Se debe mantener las muestras en hielo, y la centrifugación se debe llevar
a una temperatura de 4 °C Correcto
2. Para las muestras provenientes de tejidos vegetales y animales, es
importante registar el peso exacto de la muesta, esto para poder cuantificar
la cantidad de enzima que hay por peso regsitrado Correcto, también
pueden considerar cuantificar proteína para no sobreestimar o subestimar
la cantidad de materia ya que si solo pesan tejido las variaciones en el
contenido de agua pueden alterar los resultados.

5.- Existen diferentes métodos de extracción de enzimas a partir de su

fuente original, ¿Qué método se utilizó en la práctica 1? ¿Es el método
idóneo para todas las fuentes naturales consideradas en la práctica 1? Si
contara con los recursos técnicos y económicos ¿Qué método utilizaría para
cada fuente? Considere como fuentes: hígado, rábano, eritrocito, bacteria.
(Valor 5 puntos)

La extracción enzimática se puede realizar de diversas fuentes como lo son:

mamíferos, sistemas de expresión en procariotes y eucariotes inferiores, proteínas
de fusión, células de insectos o plantas. En la práctica 1, realizamos extracción
enzimática de dos fuentes principales:

● Mamíferos: Debido a que carecen de un pared celular, se homogenizan

con facilidad. Cuenta con abundante cantidad de tejido disponible.
● Plantas y bacterias: Requieren métodos de extracción más agresivos
debido a que contienen una pared celular.
Para la extracción de las enzimas presentes en el hígado, el cual es una fuente de
enzima de mamífero, se utilizó un método mecánico al realizar un rompimiento por
aplicación de presión mecánica por medio de un mortero.
Para la extracción enzimática utilizando como fuente los eritrocitos se realizó una
homogenización seguida de una lisis con agua bidestilada.
Al usar como fuente un cultivo bacteriano se utilizó un método de homogenización
y presión al aspirar la muestra diez veces con una jeringa de insulina.
Para realizar la extracción del rábano se utilizó el método de mortero, el cual es
más agresivo, debido a que las paredes celuares deben ser rotas para la
extracción de enzimas presentes.

De contar con los recursos técnicos y económicos suficientes se habría optado por
un método mecánico con prensa franceso para el extracto de enzimas bacterianas
debido a que éste tiene la ventaja de que hace estallar a las células de manera
uniforme, logrando una mayor efectividad en la ruptura. (Cuervo, Raúl)
Para la ruptura de células en sangre se habría utilizado un choque osmótico
debido a que ocasiona un nivel de estrés suave sobre el producto y no daña a las
enzimas.
Para la extracción de enzimas de rábano y bacterias se habría optado por una
digestión enzimática capaz de realizar el rompimineto de la pared celular sin tanta
contaminación como con el uso de un mortero. Correcto, indiquen referencias

6.- Durante la extracción de catalasa se utilizó PBS, explique la razón. (Valor

5 puntos)

PBS está amortiguando el medio para que el pH permanezca constante y

garantice una fuerza iónica fisiológica. Esto se realiza gracias a la interacció entre
los grupos fosfato. Correcto, además porque PBS es el amortiguador natural en el
citoplama

7.- Explique el motivo de que el primer paso en la determinación de la

actividad de catalasa fue medir la absorbancia del peróxido de hidrógeno sin
muestra biológica (Valor 5 puntos)

Inicialmente se debía medir la absorbancia del peróxido de hidrógeno para

corroborar que éste no se encontrara degradado o que no reaccionara con alguna
contaminación presente en el material que pudiera afectar nuestros resultados.
Esto quiere decir que la absorbancia del peróxido se debería encontrar en una
absorbancia constante de aproximadamente .5. Si ésta era más baja quiere decir
que se encontraba degradado y si ésta no era constante significa que estaba
reaccionando con algo y se tendría que analizar las posibles causas de
contaminación. También, como ocurrió, para verificar que la lámpara UV del
espectro funcione adecuadamente o que la concentración del peróxido es la
adecuada

8.- ¿Cuál es la relevancia de cuantificar proteínas cuando se trabaja con

enzimas? (Valor 5 puntos)

Mediante la cuantificación de proteinas es posible reportar la velocidad a la que

cierta cantidad de enzima forma el producto o usa el sustrato por unidad de
tiempo. Revisen el concepto de actividad especifica
Existen diferentes métodos para poder realizar esta cuantificación y todo depende
del material biológico de donde se extraerá la muestra, el objetivo del ensayo,
tamaño de muestra, sensibilidad y especificidad, costos y disponibilidad de
sustratos o cofactores.

- Método Lowry
- Bratford
- BCA
- Biuret
9.-Como parte del protocolo de la práctica 2 se prepara una solución a
diferentes concentraciones de albúmina sérica bovina. ¿Cuál es el objetivo
de este paso? (Valor 5 puntos)

Este paso se realiza debido a que servirá para realizar la curva patrón y así
cuantificar la cantidad de proteína obtenida. La albúmina es una proteína de
referencia, barata, comercialmente disponible, y que se puede utilizar para la
construcción de la curva patrón.

10.- ¿Cuál es la función de la acetona fría durante la fase de precipitación de

proteínas a partir de extracto crudo de la práctica 2? (Valor 5 puntos)
La precipitación con uso de solventes orgánicos, como la acetona se utilizan para
“purificar y concentrar´” la proteía extraída . Los solventes orgánicos disminuyen la
constante dieléctrica de la solución, y por ello su poder de solvatación.
Consideren que están trabajando con células; un tip: hay membranas celulares en
donde la cantidad de fosfolípidos es mayor que la de proteínas y la acetona es un
compuesto no polar.

11.- La temperatura y el pH son factores que afectan la actividad enzimática,

¿Tendrían el mismo efecto en una enzima libre que en una enzima
inmovilizada? Justifique su respuesta (Valor 10 puntos)
No tendrían el mismo efecto. En las enzimas libres, al haber un aumento de
temperatura, generalmente se incrementa la velocidad de reacción; sin embargo, a
partir de cierta temperatura las enzimas se comienzan a desanaturalizar. Las
enzimas libres también son muy sensibles a los cambios de pH , ya que pequeñas
variaciones pueden ocasionar la desnaturalización de la proteína.
Por el otro lado, las enzimas inmovilizadas son capaces de resistir mayores
cambios de temperatura y pH; por ejemplo las enzimas inmovilizadas con
reticulado usan reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares
entre las moléculas de la enzima. Las enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles son capaces de resistir condiciones extremas de temperatura y pH.
Un co-reticulado permite evitar las pérdidas de actividad enzimática debidas a
efectos difunsionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una
proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina. (Guerrero, 2018)
Correcto

12.-Observe los siguientes datos y responda las preguntas

a) En las condiciones extremas de temperatura (hielo y 60ºC) se observa
que independientemente del tiempo la absorbancia es prácticamente
nula. Considerando que a la longitud de onda del ensayo se mide la
formación del complejo almidón-yodo y que la amilasa rompe los
enlaces del polisacárido para liberar glucosa, la cual no forma el
complejo coloreado. ¿Es posible concluir que a estas temperaturas
todo el almidón ha sido degradado? Mencione dos explicaciones para
estas lecturas y diseñe un ensayo que las avale. (Valor 10 puntos)

No, debido a las temperaturas extremas la enzima no podría tener la

suficiente actividad como para haber degradado todo el almidón y ocasionar
una absorbancia tan baja en tan poco tiempo. Este valor se debe
principalmente a la interferencia que ocasiona la matriz de perla. Debido a
que la cápsula reacciona a la temperatura y ésta es sumamente extremosa
en hielo y a 60°C, la perla no se romperá tan rápidamente y por lo tanto no
se podrá captar en la absorbancia el color azul del almidón sin reaccionar.
Para avalar esta teoría se podría capturar la absorbancia de las perlas sin
enzima, la cual se debería encontrar a una máxima absorbancia y
constante durante todo el periodo y la absorbancia de una enzima sin
matriz de perla bajo estas mismas condiciones. Correcto

b) Observe los resultados obtenidos en ensayos a 40 y 50ºC. Explíquelos,

fundamente su respuesta y diseñe un experimento que demuestre cuál
es la temperatura y el tiempo en donde se observa la mayor actividad
enzimática. (Valor 10 puntos)
 Se observa una mayor actividad enzimática a 40°C debido a que a los 50°C
se observa un aumento en la absorbancia, lo cual quiere decir que la
formación de complejo es mayor que la degradación de almidón, al haber
una menor degradación significa que la actividad enzimática es menor. Por
el otro lado, a los 40°C se observa una disminución en la absorción de
almidón, esto quiere decir que conforme pasa el tiempo la enzima
transforma el almidón en glucosa, ocasionando una disminución en el
sustrato. Esta disminución se puede observar también, debido a que bajo
estas condiciones la matriz de perla tiene reacción a la temperatura y
permite una óptima medición en el espectro. Revisen esta respuesta, la
pueden mejorar. Consideren la formación del complejo como una reacción
química que se lleva a cabo, además de la reacción enzimática. Les falta el
diseño del experimento, piensen en perfiles de temperatura y una forma de
medir tanto la formación del complejo coloreado como de la actividad
enzimática como experimentos independientes.

c) ¿Esperaría obtener los mismos resultados si los ensayos se realizan

con enzima libre? Justifique su respuesta. (Valor 5 puntos)

No, debido a que la enzima libre es mucho mayor sensible a los cambios de
temperatura; por lo tanto se esperaría una menor actividad en temperaturas
que no fueran las óptimas e incluso una desantualización o inactividad en
temperaturas extremosas como en la condición de hielo o 60°C. ¿Cómo lo
probarían? Consideren el concepto de perfiles de temperaura

d) ¿Esperaría obtener los mismos resultados si los ensayos se realizaran

con enzima inmovilizada en otra matriz? Justifique su respuesta.
(Valor 5 puntos)
No, dependiendo de la naturaleza de la matriz es como se cuantificará la actividad
enzimática .En este caso la cuantificación de la actividad enzimática se da por
medio de la interacción enzima-matriz en la cual la enzima pasa por la matriz,
liberándose y entrar en contacto con el sustrato disuelto en el medio. En este
caso los riesgos por inmovilización en perlas de alginato son; no controlamos el
sitio activo de la enzima, no cuantificamos cuánta proteína queda fuera y dentro de
la matriz y no sabemos cuantas enzimas son efectivas Correcto, pero coloquen la
referencia

Fuentes consultadas:

file:///C:/Users/pamel/Downloads/Dialnet-
ExtraccionYPurificacionDeLaEnzimaMonoxidoDeCarbono-2933644%20(1).pdf