Enzimología y Actividad Enzimática

Facultad de Ciencias Básicas

LABORATORIO ENZIMOLOGÍA

QUIZ DE SALIDA SOBRE TÉCNICA DE ESPECTROFOTOMETRÍA (GUÍA CLASE

PASADA)

ES NECESARIO QUE CUENTE CON CALCULADORA PARA LA CLASE

1. Enzimología I: Efecto del pH y temperatura sobre la actividad enzimática.

APRENDIZAJES ESPERADOS

 Manejo de las condiciones para determinar la actividad de una enzima.

 Verificar el efecto de la presencia de inhibidores en la catálisis enzimática.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metabólicos a
velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su regulación. Debido a su
naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y
pH, factores que pueden alterar su estructura nativa, provocando su desnaturación. En general
una reacción química aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el
caso de las reacciones catalizadas por enzimas humanas, este efecto se observa hasta los 40 °C,
ya que a temperaturas mayores la enzima se desnatura. Existen otros casos, por ejemplo, las
bacterias termófilas, en las cuales las enzimas pueden funcionar en rangos de temperatura que
llegan hasta los 100 °C.

Debemos considerar que las enzimas presentan numerosos grupos ionizables en su estructura,
dados por los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden
cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la
enzima, afectando su actividad catalítica.
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ACTIVIDAD VIRTUAL

Determinación del pH y temperatura óptima para la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-

glucosidasa.

FUNDAMENTO DEL ENSAYO

La enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168) hidroliza el enlace glucosídico de un

sustrato que añadimos, la hesperidina, un glicósido natural formado por la unión
de rutinosa con hesperetina. La rutinosa que se libera es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-
glucosa y tiene carácter reductor (en el C1 de la glucosa) (Figura 1).

Figura 1: Reacción de hidrólisis de la hespertina por la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa.

Se aplica entonces un ensayo para detectar azúcares reductores (en este caso, la rutinosa),
consistente en su reacción con el dinitrosalicilato (DNS). El DNS, de color amarillo en medio
básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo: (el aldehído del azúcar
reductor se oxida a ácido). Luego, se procede a medir el color rojo del producto a 540 nm.
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Figura 2: Reacción para detectar azúcares reductores.

PROCEDIMIENTO

Para detrminar el pH y temperatura óptima para la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa,

Ud. deberá ingresar al siguiente link:

http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm

En este simulador o laboratorio virtual podrá explorar cómo la actividad de una enzima varía
dependiendo de las condiciones del medio en el que se encuentra. La enzima a estudiar es la 6-O-
α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis, que se encuentra
contenida en la muestra del ensayo.

El objetivo es encontrar las condiciones óptimas de pH y temperatura para esta enzima, según

las siguientes indicaciones:
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a) Desplaze los controles para elegir un pH y una temperatura a la vez para cada ensayo. En
este caso, Ud. deberá introducir los valores de pH contenidos en la Tabla 1,
manteniendo la temperatura constante.
b) Una vez determinado el pH óptimo de la enzima, Ud. deberá mantener el pH constante y
variar la temperatura para encontrar la Temperatura óptima de esta enzima.

Temperatura pH
(°C)

80 3

80 4

80 5 Tabla 1: Temperatura y pH para evaluar la

80 6 absorbancia (directamente proporcional a la
actividad) de la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-
80 7 glucosidasa.
80 8

80 9

80 10

c) Pulse, en orden, los botones para añadir los componentes de la reacción a la cubeta del
ensayo (ell botón “añadir sustrato” vaciará antes la cubeta. El botón “añadir muestra”
iniciará la incubación).
d) Una vez se haya desarrollado el color, pulse en el espectrofotómetro el botón para medir
la absorbancia y anote su valor.
e) Anote cada valor de absorbancia en su hoja de resultados.
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RESULTADOS

RESULTADOS

Tabla 1: (agregue su descripción)

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Temperatura (°C) pH Absorbancia

80 3

80 4

80 5

80 6

80 7

80 8

80 9

80 10
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RESULTADOS

Tabla 2: (agregue su descripción)

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pH Temperatura Absorbancia
(°C)

 Con los datos obtenidos, Ud. deberá elaborar los gráficos que muestren la variación de la
absorbancia (que refleja la actividad enzimática) dependiendo de la temperatura y otro,
que muestre la variación de la absorbancia (que refleja la actividad enzimática)
dependiendo del pH. Obtener a partir de ellas, una estimación de la temperatura
óptima y el pH óptimo para esta enzima.
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RESULTADOS

Gráfico 1: (agregue su descripción)

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RESULTADOS

Gráfico 2: (agregue su descripción)

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1.
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2. Enzimología II: Inhibición de la actividad enzimática

APRENDIZAJES ESPERADOS

 Verificar el efecto de la presencia de inhibidores en la catálisis enzimática.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor de pH
denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones
o amortiguadores de pH. Cambios drásticos en la [H+] tienen la capacidad de desplegar la
estructura tridimensional nativa de una proteína provocando su desnaturalización.

Las enzimas son proteínas que actúan en forma concertada, aceleran cientos de reacciones que
llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservación o transformación de energía o la
biosíntesis de macromoléculas. Un ejemplo simple de reacción que pueden catalizar las enzimas
está representado por la siguiente figura

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que

ES representa el complejo transitorio enzima-sustrato. Las enzimas pueden ser clasificadas según
la reacción que estas catalizan, definiéndose las ÓxidoReductasas, Transferasas, Hidrolasas,
Isomerasas, Liasas y Ligasas.

A partir de un ensayo enzimático in vitro, variando las [S], se puede determinar los parámetros
cinéticos de kM y Vmax. Dado que las enzimas regulan el metabolismo, muchas veces ellas son
blanco de la acción de diversos fármacos que pueden actuar como inhibidores reversibles,
alterando los parámetros cinéticos, y por tanto, la actividad enzimática. Este tipo de inhibidores
se clasifica principalmente en Competitivos, Acompetitivos y No competitivos (Mixtos).
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ACTIVIDAD

En la presente sección se estudiará el efecto de un inhibidor en la actividad de la enzima

Fosfatasa alcalina (FA) utilizando los datos contenidos en la Tabla Nº 2.

FA es una metaloenzima no específica que actúa sobre los ésteres fosfóricos liberando fósforo
inorgánico a pH alcalino, en presencia de iones zinc y magnesio. Sus niveles séricos se
incrementan en las enfermedades hepáticas, óseas o en infecciones gástricas. La fosfatasa alcalina
se encuentra en el hígado, riñón, hueso e intestino y es un indicador muy sensible de colestasis
(secreción de bilis deficiente) y daño hepático en los animales.

La reacción que cataliza se observa en el esquema:

O O
H H
I FA I
R O H O H O R
- - P= O + - H  - - P= O + - OH

éster fosfórico agua derivado fosfatado alcohol

Esquema 1. Reacción química de una fosfatasa.

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ANÁLISIS DE DATOS

Para el estudio de inhibición de fosfatasa alcalina Ud. deberá utilizar los datos de la Tabla Nº 2

Tabla 2: Datos de velocidad enzimática para fosfatasa alcalina en presencia y ausencia de

inhibidor.

[S] mM Velocidad (mmoles/min)

Sin Inhibidor Inhibidor A

0,20 16,67 5,56

0,25 20,00 6,67

0,50 33,33 11,11

1,00 50,00 16,67

2,00 66,67 22,22

4,00 80,00 26,67

5,00 83,33 27,77

 A partir de los datos graficar:

a) Velocidad inicial vs Concentración de Sustrato (Vo vs [S]) para fosfatasa alcalina en

ausencia de inhibidor.

RESULTADOS

Gráfico 1: (agregue su descripción)

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b) Velocidad inicial vs Concentración de Sustrato (Vo vs [S]) para la fosfatasa alcalina en

presencia de inhibidor.

RESULTADOS

Gráfico 2: (agregue su descripción)

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c) Graficar la representación Lineweaver-Burk (1/Vo vs 1/[S]) para fosfatasa alcalina en ausencia

de inhbidor.

RESULTADOS

Gráfico 3: (agregue su descripción)

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d) Graficar la representación de Lineweaver-Burk (1/Vo vs 1/[S]) en presencia de inhibidor.

RESULTADOS

Gráfico 4: (agregue su descripción)

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 A partir de los gráficos obtenidos, determine la naturaleza del inhibidor A (competitivo,

no competitivo, acompetitivo o mixto). Calcule Km y Vmax de la enzima en ausencia y
presencia de inhibidor. Utilice las gráficas de Lineweaver-Burk (1/Vo vs 1/[S]) realizadas
antes.

RESULTADOS

Tabla 1: (agregue su descripción)

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2.
Km Vmax

Sin inhibidor

Con inhibidor

CUESTIONARIO

1. Investigue la diferencia entre las enzimas que siguen cinéticas de Michaelis-Menten y las que
no lo hacen.

2. Describa las inhibiciones y las modulaciones que pueden afectar la actividad de una enzima.