Colorimetray Espectrofotometra p

Determinacindelaconcentracin deunsoluto
TcnicasInstrumentalesdeAnlisisenBioqumica q J.M.GarcaSegura g yotros. EditorialSntesis,1996.Captulo2:Espectroscopa deabsorcinultravioletavisible
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Radiacinelectromagntica
Radiacinelectromagntica:propagacinatravsdelespaciodeunaperturbacin electromagnticaproducidaenalgnpuntodelmismo H.Hertz,1884:Laluzesuntipoderadiacinelectromagnticaquepuedeserdetectadapor elojohumano(luzvisible) Espectroscopa:tcnicadeanlisismolecularbasadaenelestudiodelasinteraccionesquese producenentrelasradiacioneselectromagnticasylasmolculas Puedeserconsideradadesdeunpuntodevistacorpuscularyondulatorio(espectroscopa) P t d Parmetros dela l onda d : Longituddeonda ():distanciaqueexisteentredospuntosenlosqueelvalordelcampo elctrico(E)eselmismo(mdulo,direccinysentido) Unidadesdelongitud(nm),sirveparaestablecerunaclasificacindelasradiaciones electromagnticas Enotrasespectroscopas tambinseutilizanotrosparmetroscomoelnmerodeondas (oscilaciones/unidaddelongitud)ylafrecuencia(oscilaciones/unidaddetiempo) Intensidad (I):energaqueatraviesalaunidadderea,perpendicularaladireccinde propagacin porunidaddetiempo propagacin,
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Ondaselectromagnticas:
Representacindedosondas electromagnticas,AyB,conel mismosentidodepropagacine iguallongituddeonda,pero diferentesencuantoalmximo valordemdulodelvectorde campoelctrico(Eo yEo)y,por tanto,dedistintaintensidad

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Espectroderadiacioneselectromagnticas
Laslongitudesdeondaquedefinencadaregincorrespondenavaloresorientativos,pues setratadeunavariacincontinua

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 Dispersin
Interaccin I i d del laradiacin di i UVVisibleconlamateria
Cuandolaradiacin electromagnticaatraviesala materiasepuedenproducirtres tiposdefenmenos:dispersin, absorcin yemisin. Dispersin:retrasodela radiacin,disminucindela velocidaddep propagacin p g atravs deesemedioyreduccindela intensidad. Unadelasmanifestaciones macroscpicasdeesteefectoes larefraccin queseconcretaen elndicederefraccin,definido comoelcocienteentrela velocidaddelaradiacinenel vacoyenelmedioconsiderado

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 Absorcin
Interaccin I i d del laradiacin di i UVVisibleconlamateria
Cuandolaradiacin electromagnticaatraviesala materiasepuedenproducirtres tiposdefenmenos:dispersin, absorcin yemisin. Absorcin:Sialasmolculas presentesenelmedioseleshace interaccionarconradiacin electromagnticadeuna frecuenciatalquesuenerga coincidaconladiferenciaexistente entre t d dosniveles i l electrnicos, l t i tendrlugarunatransicin electrnica.Serequiereradiacin g de<1.000nm electromagntica quecoincideconlaregindel espectrocorrespondientealUV Visible.Siocurreesto,nose produce d di dispersin i sino i absorcin b i
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 Emisin
Interaccin I i d del laradiacin di i UVVisibleconlamateria
Cuandolaradiacin electromagnticaatraviesala materiasepuedenproducirtres tiposdefenmenos:dispersin, absorcin yemisin. Emisin:Elretornodelos electronesexcitadosalestado fundamentalsep puedep producir emitiendoluz.Estasemisionesse denominanradiativas ypuedenser Fluorescentes(F)oFosforescentes (P)

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EcuacindeLambertBeer.
Coeficientedeextincin
Siunhazdeluzatraviesaunmaterialquecontienecromforosserabsorbidaylaintensidad delaluzemergenteser: I = I0 I a dondeIa eslaintensidaddeluzabsorbidaduranteeltrayecto. trayecto Laecuacinquegobiernaeste comportamientoesconocidacomoLeydeLambert: dI(x)/I(x) = -kdx DondeI(x)eslaintensidaddeluzenelmedioestudiadocuandolaradiacinharecorridouna distanciax.IntegrandolaecuacinentreIeI0 yentre0y1,seconvierteen: LnI - LnI0 = -kl o I = I0e-kl DondeIeI0 sonlasintensidadesdeluzemergenteeincidente,keselcoeficientede absorcinquedependedelasmolculasdeesemedioyleselespesordedichomedio Cuandoseestudialaabsorcindemolculasbiolgicassetrabajacondisolucionesacuosas. acuosas Si sequierecuantificarunsoluto,habrqueusarundisolventequenoabsorbaalamisma longituddeonda,porloquelaabsorcindeladisolucinserfuncindirectadela concentracindesoluto:LeydeBeer: I = I0e-2,303Cl
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EcuacindeLambertBeer.
Coeficientedeextincin
dondeCeslaconcentracindesolutoy uncoeficientedeextincinmolarala considerada. esunamedidadelacapacidadquetienecadacromforo deabsorber radiacin.SusunidadessonM1 cm1.Envezdeespesordelmedio(l)sehabladepasoptico (l),ladistanciaencmquerecorrelaradiacinalatravesarladisolucin. Enlaprcticanosemidelaintensidaddelaluzabsorbidasinootrasmagnitudesrelacionadas: laTransmitancia,T,ylaAbsorbancia,A,ambasadimensionales: T = I/I0100 ; A = log I0/I ApartirdelasecuacionesanterioressededucelaLeydeLambertBeer: A = Cl Absorbancia esdirectamenteproporcionalalaconcentracindesoluto Coeficientedeextincinmolar:absorbancia deunadisolucin1Mdeunsolutoparaunpaso ptico p de1cm Densidadptica:absorbancia deunamuestracuandoelpasopticoesde1cm

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Variacin V i i de d la l Transmitancia,Tydela Absorbancia,A,enfuncin delaconcentracin

Lavariacindelatransmitanciatiene uncomportamientoexponencial LavariacindelaAbsorbanciase tratadeunaproporcionalidaddirecta

Carcteraditivodela Absorbancia
Laabsorbancia deunadisolucines l sumade la d las l absorbancias b b i de d sus componentes Permitedescontardirectamentela contribucindeldisolventecuando serealizalamedidaexperimentalde laabsorbancia deunproductoen disolucin

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RELACINENTRETRANSMITANCIAYABSORBANCIA
Io 100
T

I1 10 10%
1

I2 1 1%
2

I3 0,1 0,1%
3

I4 0,01 0,01%
4

T 100 A 0

50 0,3

25 0,6

10 1 0 1 2

RangoaceptabledemedidasdeA
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Espectrofotmetros

Luzpolicromtica (varias) Halgenas:250700nm Deuterio:paraUV

Cmofunciona?http://www.uhu.es/quimiorg/db.html
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Espectrofotmetros
DU800UV/VisibleSpectrophotometer (BeckmanCoulter)

Spectronic 20(Bausch &Lomb)

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Espectrofotmetros
Dedoblehaz

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Monocromadores

Amontonamientodelaslongitudesdeonda mayores

Descomposicinmshomognea

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Cubetasdeespectrofotmetro
1cm 0,1cm

UV:cristaldecuarzo Visible cristaloplstico Visible:

3ml 1,5ml 0,8ml circular

Flujocontinuo
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Aplicaciones
Espectrofotometradeprotenas Espectrofotometradecidosnucleicos Colorimetra
Clculodelaconcentracinapartirdelamedidadeabsorbancia Especficoysensible,perosenecesitaunarectadecalibrado MtododeLowry paracuantificarlaconcentracindeprotenadeuna disolucin

Enzimoinmunoensayo (ELISA)
Reaccincolorimtricaparadetectarinmunocomplejos (antgenoanticuerpo) Msbarato,seguroysensiblequeelradioinmunoensayo (RIA)

Turbidometras
Medidadelnmerodeclulasdeuncultivo

Ensayosenzimticos
Medidadelavelocidaddelareaccincatalizadaporunaenzima
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Espectrofotometradeprotenas
Aminocidos aromticos

Enlacepeptdico

Grupos prostticos

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Espectrofotometradecidosnucleicos
Espectrosdeabsorcindecidosnucleicos yprotenas p enelUVp prximo(230 ( 330 nm)

EspectrosdeabsorcindeDNAenforma dedoblehlice(trazocontinuo)y completamentehidrolizado(discontinuo): Efectohipocrmico Elpolmeroabsorbemenosquelos monmerosconstituyentes

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Espectrofotometradecidosnucleicos
CurvadedesnaturalizacindelDNA RepresentacindelaA260 nm deuna disolucindeuncidonucleico enfuncin delatemperatura Aldesaparecerelefectohipocrmico, comoconsecuenciadela desnaturalizacin,aumentalaabsorbancia aesa RelacinentrelaTmdeunDNAysu contenidoenG+C CuantomayoreselporcentajedeG+C mayoreslatemperaturadefusin (separacindelasdoshebras)deesa molculadeDNA

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Ensayosenzimticos
Variacindelaabsorbancia deuna reaccinenzimticaenfuncindeltiempo De1a4cantidadesdecrecientesde enzima Lavelocidadinicialdelareaccinsecalcula apartir ti d del laspendientes di t d del lasrectas t Lavelocidaddelareaccines directamenteproporcionalalacantidadde enzima(laconcentracindesustratoes saturante) EspectrosdeabsorcindeNADHyNAD+ y cinticadeunareaccindexido reduccin SH2 +NAD+ S+NADH+H+ Reaccionesacopladas: 1) DAlanina +cetoglutarato piruvato +Dglutamato 2) Piruvato Pi +NADH+H H+ lactato l +NAD+
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