Articulo de Trabajo Fss

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
TEMA:
PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A
PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN
ESTADO SÓLIDO.
AUTORES:
ROMY DEYANIRA CHÓEZ CASIERRA
SEBASTIÁN RODRIGO PILCO TOMALÁ
DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN
ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSC
GUAYAQUIL, JUNIO 2020

TRABAJO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE:
INGENIERO QUÍMICO
TEMA:
PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A
PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN
ESTADO SÓLIDO.
AUTORES:
ROMY DEYANIRA CHÓEZ CASIERRA
SEBASTIÁN RODRIGO PILCO TOMALÁ
DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN
ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSC
GUAYAQUIL, JUNIO 2020

UNIDAD DE TITULACIÓN
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN

PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS
TÍTULO Y SUBTÍTULO: NIGER A PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO.
CHÓEZ CASIERRA ROMY DEYANIRA

AUTOR(ES)
PILCO TOMALÁ SEBASTIÁN RODRIGO
REVISOR(ES)/TUTOR(ES) ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
UNIDAD/FACULTAD: FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
MAESTRÍA/ESPECIALIDAD:
GRADO OBTENIDO: TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO
FECHA DE PUBLICACIÓN: 16/junio/2020 No. DE PÁGINAS: 87
ÁREAS TEMÁTICAS: BIOTECNOLOGÍA
PALABRAS CLAVES/
Poligalacturonasa, fermentación en estado sólido, Aspergillus Niger.
KEYWORDS:
RESUMEN/ABSTRACT: La generación de residuos agroindustriales en la actualidad va en aumento, siendo una
problemática de interés mundial, debido a que estos desechos no reciben el tratamiento adecuado lo cual conlleva a
el aumento de la contaminación ambiental. La biotecnología, ciencia que busca procesos alternos para poder
aprovechar estos materiales, transformarlos y darle un valor agregado. En la presente investigación se utilizó
cascarilla de cacao CCN-51 como sustrato para la producción de poligalacturonasa PG, empleando aspergillus
niger; se realizaron diversos ensayos para determinar la temperatura, pH y tiempo óptimo para la producción de la
enzima, determinando la actividad enzimática aplicando el método del 3,5 – dinitrosalicílico (DNS), a su vez la
concentración de proteína por el método de Bradford. Se demostró que las condiciones óptimas donde se produce
mayor cantidad de actividad enzimática fueron a una temperatura de 30ᵒC, pH 3 y tiempo de 30 minutos, obteniendo
4,20 UE/ml, a su vez se realizó una comparativa utilizando cáscara de naranja como sustrato, donde se demostró que
la cascarilla de cacao es buen sustrato para aplicarlo en este método para la producción de la enzima
poligalacturonasa.
X
ADJUNTO PDF: SI NO
CONTACTO CON Teléfono: E-mail:

0978970229 romy.choezc@ug.edu.ec
AUTOR/ES:
0988427392 sebastian.pilcot@ug.edu.ec
Nombre: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL – FACULTAD DE
CONTACTO CON LA INGENIERÍA QUÍMICA
INSTITUCIÓN: Teléfono: 04-229-2949
E-mail: http://www.fiq.ug.edu.ec/
III
CARREA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Guayaquil, junio de 2020
Ing.
Luis Alberto Bonilla Abarca MSc.
DIRECTOR DE LA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Ciudad. -
De mis consideraciones:
Envío a Ud. el Informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación:

PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A PARTIR DE
CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO del (los)
estudiante (s) CHÓEZ CASIERRA ROMY DEYANIRA con C.I. 093070297-2, PILCO TOMALÁ
SEBASTIÁN RODRIGO con C.I. 240028610-6 indicando que ha (n) cumplido con todos los
parámetros establecidos en la normativa vigente:
• El trabajo es el resultado de una investigación.

• El estudiante demuestra conocimiento profesional integral.
• El trabajo presenta una propuesta en el área de conocimiento.
• El nivel de argumentación es coherente con el campo de conocimiento.
Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del trabajo de

titulación con la respectiva calificación.
Dando por concluida esta tutoría de trabajo de titulación, CERTIFICO, para los fines pertinentes,
que el (los) estudiante (s) está (n) apto (s) para continuar con el proceso de revisión final.
Atentamente,
ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.

TUTORA DE TRABAJO DE TITULACIÓN
C.I. 092116021-4
IV
CARREA DE INGENIERÍA QUÍMICA
CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD
Habiendo sido nombrado ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc., tutor del trabajo de titulación
certifico que el presente trabajo de titulación ha sido elaborado por CHÓEZ CASIERRA ROMY
DEYANIRA con C.I. 093070297-2, PILCO TOMALÁ SEBASTIÁN RODRIGO con C.I.
240028610-6, con mi respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título de
INGENIERO QUÍMICO.
Se informa que el trabajo de titulación: PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR

ASPERGILLUS NIGER A PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO, ha sido orientado durante todo el periodo de ejecución en
el programa antiplagio URKUND quedando el 2 % de coincidencia.
ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.

TUTORA DE TRABAJO DE TITULACIÓN
C.I. 092116021-4
V
Guayaquil, junio de 2020
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR
Habiendo sido nombrado CECILIA KATHERINE UZCA SORNOZA, tutor del trabajo de
titulación PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER
A PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN
ESTADO SÓLIDO certifico que el presente trabajo de titulación, elaborado por CHÓEZ
CASIERRA ROMY DEYANIRA con C.I. 093070297-2 y PILCO TOMALÁ SEBASTIÁN
RODRIGO con C.I. 240028610-6, con mi respectiva supervisión como requerimiento parcial
para la obtención del título de INGENIERO QUÍMICO, en la Carrera de Ingeniería Química,
Facultad de Ingeniería Química, ha sido REVISADO Y APROBADO en todas sus partes,
encontrándose apto para su sustentación.
VI
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL USO NO

COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS
Nosotros, Chóez Casierra Romy Deyanira con C.I. 093070297-2 y Pilco Tomalá Sebastián
Rodrigo con C.I. 240028610-6, certificamos que los contenidos desarrollados en este trabajo
de titulación, cuyo título es PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR
ASPERGILLUS NIGER A PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO, son de nuestra absoluta propiedad y
responsabilidad Y SEGÚN EL Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA
SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN*, autorizo el uso
de una licencia gratuita intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la presente
obra con fines no académicos, en favor de la Universidad de Guayaquil, para que haga uso del
mismo, como fuera pertinente
Chóez Casierra Romy Deyanira Pilco Tomalá Sebastián Rodrigo

C.I. 0930702972 C.I. 240028610-6
*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E

INNOVACIÓN (Registro Oficial n. 899 - Dic./2016) Artículo 114.- De los titulares de derechos de obras creadas en
las instituciones de educación superior y centros educativos.- En el caso de las obras creadas en centros educativos,
universidades, escuelas politécnicas, institutos superiores técnicos, tecnológicos, pedagógicos, de artes y los
conservatorios superiores, e institutos públicos de investigación como resultado de su actividad académica o de
investigación tales como trabajos de titulación, proyectos de investigación o innovación, artículos académicos, u
otros análogos, sin perjuicio de que pueda existir relación de dependencia, la titularidad de los derechos
patrimoniales corresponderá a los autores. Sin embargo, el establecimiento tendrá una licencia gratuita, intransferible
y no exclusiva para el uso no comercial de la obra con fines académicos.
VII
DEDICATORIA
Sin Dios nada soy, dedico este trabajo a Él por ser mi guía.
A mis padres este trabajo, NETIS CASIERRA y STALIN CHÓEZ, quienes han sido mi mayor
inspiración y ejemplo.
A mis hermanos por siempre estar conmigo.
Romy Deyanira Chóez Casierra
VIII
DEDICATORIA
Dedicado especialmente a mis padres SANTIAGO PILCO RODRIGUEZ y VILMA TOMALÁ
PANCHANA, por ser el pilar fundamental y fuente de inspiración para lograr tan anhelado
triunfo, a mi familia y amigos quienes estuvieron conmigo apoyándome en el transcurso de mi
carrera universitaria.
Sebastián Rodrigo Pilco Tomalá
IX
AGRADECIMIENTO
Agradezco en primer lugar a Dios, por darme fortaleza y salud cada día.
Gracias a mis padres por su amor incondicional, gracias por el esfuerzo que hacen para que yo
pueda lograr mis metas, gracias por todo.
Agradezco a la Ing. Cecilia Uzca Sornoza, una excelente docente y persona, que con paciencia
nos direccionó y apoyó en la realización de este trabajo de titulación.
Agradezco al Ing. Wilfrido Terán, quien de gran manera nos apoyó y aconsejó en el desarrollo
experimental de este trabajo.
Romy Deyanira Chóez Casierra
X
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por todas las bendiciones brindadas a lo largo del tiempo.
A mis padres por todo el apoyo y amor incondicional, por el sacrificio y esfuerzo que hicieron
para poder culminar con éxito la carrera.
A mis hermanos y demás familiares por estar pendientes de mí, apoyándome para seguir adelante
con mis estudios.
A mis amigos por todos los buenos momentos vividos, apoyándonos mutuamente para poder
superar diversas dificultades que se nos presentaba.
A la Ing. Cecilia Uzca por su tiempo, paciencia y transmitirnos sus conocimientos a lo largo de
este periodo, siendo una de las personas más importantes para que la investigación finalice
exitosamente.
A los docentes, Ing. Wilfrido Terán, Ing. Radium Avilés por brindarnos su apoyo, dando las
facilidades para poder desarrollar el trabajo de titulación en los laboratorios.
Sebastián Rodrigo Pilco Tomalá
XI
ÍNDICE
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA ..................................... III

CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD ............................................................. V
CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR ..................................................................... VI
LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL USO NO
COMERCIAL DE LA OBRA CON FINES NO ACADÉMICOS ................................... VII
DEDICATORIA .................................................................................................................. VIII
AGRADECIMIENTO ............................................................................................................ X
ÍNDICE .................................................................................................................................. XII
ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... XVI
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................ XVII
ÍNDICE DE ANEXOS ......................................................................................................XVIII
RESUMEN ........................................................................................................................... XIX
ABSTRACT ...........................................................................................................................XX
INTRODUCCIÓN.................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ............................................................................................................................ 3
EL PROBLEMA ...................................................................................................................... 3
1.1. Planteamiento del problema. ......................................................................................... 3
1.2. Formulación y sistematización del problema .............................................................. 4
1.2.1. Formulación del problema de investigación ............................................................. 4
1.2.2. Sistematización del problema de investigación ........................................................ 4
1.3. Justificación de la investigación. ................................................................................... 4
1.3.1. Justificación teórica .................................................................................................. 4
1.3.2. Justificación metodológica........................................................................................ 5
1.3.3. Justificación práctica ................................................................................................. 6
1.4. Objetivos de la investigación. ........................................................................................ 6
1.4.1. Objetivo general ........................................................................................................ 6
1.4.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 6
1.5. Delimitación de la investigación .................................................................................... 7
1.5.1. Delimitación temporal .............................................................................................. 7
1.5.2. Delimitación espacial ................................................................................................ 7
XII
1.5.3. Delimitación del contenido ....................................................................................... 7
1.6. Hipótesis de la investigación .......................................................................................... 8
1.6.1. Variables independientes .......................................................................................... 8
1.6.2. Variables dependientes ............................................................................................. 8
1.6.3. Operacionalización de las variables. ......................................................................... 8
CAPÍTULO II......................................................................................................................... 10
MARCO REFERENCIAL .................................................................................................... 10
2.1. Marco teórico ................................................................................................................ 10
2.1.1. Sustancias pécticas .................................................................................................. 10
2.1.2. Clasificación de las pectinasas ................................................................................ 11
2.1.2.1. Poligalacturonasa ............................................................................................. 11
2.1.2.2. Microorganismos empleados para la producción de poligalacturonasa .......... 12
2.1.2.3. Aplicación industrial de las enzimas pectinasas .............................................. 13
2.1.3. Residuos agroindustriales ....................................................................................... 13
2.1.4. Cacao CCN – 51 ..................................................................................................... 14
2.1.4.1. Características que contiene el cacao CCN–51 ............................................... 15
2.1.5. Cascarilla del cacao................................................................................................. 16
2.1.5.1. Porcentaje de pectina en la cascarilla de cacao ............................................... 16
2.1.6. Aspergillus .............................................................................................................. 18
2.1.6.1. Aspergillus Níger ............................................................................................. 20
2.1.6.2. Aplicaciones del Aspergillus niger en la industria .......................................... 20
2.1.7. Enzimas ................................................................................................................... 21
2.1.7.1. Aplicaciones de las enzimas en la industria .................................................... 22
2.2. Marco conceptual ......................................................................................................... 22
2.2.1. Cacao CCN-51 ........................................................................................................ 22
2.2.2. Aspergillus niger ..................................................................................................... 23
2.2.3. Enzima .................................................................................................................... 23
2.2.4. Poligalacturonasa .................................................................................................... 23
2.2.5. Fermentación en estado sólido ................................................................................ 23
2.2.6. Método Bradford para cuantificación de proteínas ................................................. 24
2.2.7. Método del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS) ........................................................ 24
XIII
2.3. Marco contextual .......................................................................................................... 25
CAPÍTULO III ....................................................................................................................... 26
MARCO METODOLÓGICO............................................................................................... 26
3.1. Nivel de investigación ...................................................................................................... 26
3.2. Diseño de investigación ................................................................................................... 26
3.3. Metodología de la investigación ..................................................................................... 26
3.4. Diseño experimental ........................................................................................................ 27
3.5. Materiales y equipos ....................................................................................................... 28
3.6. Metodología experimental .............................................................................................. 29
3.6.1. Microorganismo y preparación del inóculo ................................................................ 29
3.6.2. Preparación del sustrato .............................................................................................. 29
3.6.3. Preparación de medios de fermentación ..................................................................... 30
3.6.4. Fermentación .............................................................................................................. 31
3.6.5. Extracción de la enzima.............................................................................................. 31
3.6.6. Actividad enzimática de la poligalacturonasa ............................................................ 32
3.6.7. Cuantificación de proteínas ........................................................................................ 36
3.6.8. Optimización de actividad enzimática........................................................................ 39
3.6.8.1. Tiempo de incubación óptimo ............................................................................. 39
3.6.8.2. Temperatura de incubación óptima...................................................................... 39
3.6.9. Determinación de la estabilidad operacional .............................................................. 39
3.6.10. Determinación de biomasa en peso seco .................................................................. 40
CAPÍTULO IV ....................................................................................................................... 41
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS ................................................... 41
4.1 Resultados....................................................................................................................... 41
4.1.1 Preparación de sustratos........................................................................................... 41
4.1.2 Fermentación del sustrato en estado sólido empleando Aspergillus niger. ............. 42
4.1.3 Determinación de actividad enzimática ................................................................... 43
4.1.4 Cuantificación de proteínas determinada en la producción de la enzima PG .......... 45
4.1.4. Optimización de actividad enzimática .................................................................... 46
4.1.5 Estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa ......................................... 47
4.1.6 Rendimiento de biomasa. ......................................................................................... 48
XIV
CAPÍTULO V ......................................................................................................................... 50
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 50
5.1. Conclusiones.................................................................................................................. 50
5.2. Recomendaciones .......................................................................................................... 52
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 53
ANEXOS ................................................................................................................................. 62
XV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura química de la pectina ................................................................................... 11
Figura 2 Espectro IR de pectina extraída a partir de cascarilla de cacao a temperatura y tiempo
óptimo ........................................................................................................................................... 18
Figura 3 Espectro IR de pectina comercial obtenida de muestra de Manzana ............................ 18
Figura 4 Composición de Aspergillus ........................................................................................ 19
Figura 5 Fotografía microscópica del Aspergillus niger ............................................................. 20
Figura 6 Curva estándar de ácido galacturónico .......................................................................... 34
Figura 7 Curva estándar de albúmina de suero bovino BSA para cuantificación de proteínas. .. 37
Figura 8 Cascarilla de cacao tratada. ........................................................................................... 42
Figura 9 Cáscara de naranja tratada. ............................................................................................ 42
Figura 10 Crecimiento de hongos en los biorreactores en la fase de fermentación..................... 43
Figura 11 Actividad enzimática de PG de cascarilla de cacao y cáscara de naranja ................... 44
Figura 12 Concentración de proteínas en la producción de PG de cascarilla de cacao y cáscara
de naranja. ..................................................................................................................................... 46
Figura 13 Actividad enzimática bajo las diferentes condiciones de reacción. ............................ 47
Figura 14 Estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa. ............................................ 48
Figura 15 Rendimiento de biomasa. ............................................................................................ 49
XVI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Operacionalización de las variables ................................................................................ 8
Tabla 2 Tipos de organismos usados en la producción de poligalacturonasa ............................ 12
Tabla 3 Características del cacao CNN-5 ................................................................................... 15
Tabla 4 Composición de la cascarilla de cacao .......................................................................... 16
Tabla 5 Cantidad de pectina en la cascarilla de cacao ............................................................... 17
Tabla 6 Porcentaje de aplicación de enzimas en la industria ..................................................... 22
Tabla 7 Parámetros para la producción de poligalacturonasa ................................................... 27
Tabla 8 Parámetros de estabilidad operacional .......................................................................... 28
Tabla 9 Equipos, materiales y reactivos utilizados en el proceso de experimentación. .............. 28
Tabla 10 Variables de fermentación ............................................................................................ 31
Tabla 11 Cantidades empleadas para curva de calibración de ácido galacturónico ................. 33
Tabla 12 Cantidades utilizadas para ensayo de actividad enzimática. ....................................... 35
Tabla 13 Curva de calibración de BSA para determinación de proteínas. ................................. 37
Tabla 14 Cantidades empleadas de extracto crudo enzimático, agua y reactivo de Bradford ... 38
Tabla 15 Valores empleados en la optimización de actividad enzimática. ................................. 39
Tabla 16 Pesos de las materias primas........................................................................................ 41
XVII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1.1 Preparación del sustrato ......................................................................................... 62
Anexo 1.2 Preparación del inóculo .......................................................................................... 63
Anexo 1.3 Preparación del medio de fermentación Czapek .................................................... 64
Anexo 1.4 Fermentación .......................................................................................................... 65
Anexo 1.5 Extracción de la enzima ......................................................................................... 66
Anexo 1.6 Actividad enzimática .............................................................................................. 66
Anexo 1.7 Cuantificación de proteínas .................................................................................... 67
XVIII
“PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A PARTIR DE

CASCARILLA DE CACAO CCN-51 MEDIANTE FERMENTACIÓN EN ESTADO
SÓLIDO”
Autores: Chóez Casierra Romy Deyanira; Pilco Tomalá Sebastián Rodrigo

Tutor (a): Ing. Cecilia Uzca Sornoza. MSc.
RESUMEN
La generación de residuos agroindustriales en la actualidad va en aumento, siendo una

problemática de interés mundial, debido a que estos desechos no reciben el tratamiento adecuado
lo cual conlleva al aumento de la contaminación ambiental. La biotecnología, ciencia que busca
procesos alternos para poder aprovechar estos materiales, transformarlos y darle un valor
agregado. En la presente investigación se utilizó cascarilla de cacao CCN-51 como sustrato para
la producción de poligalacturonasa PG, empleando Aspergillus niger; se realizaron diversos
ensayos para determinar la temperatura, pH y tiempo óptimo para la producción de la enzima,
determinando la actividad enzimática aplicando el método del 3,5 – dinitrosalicílico (DNS), a su
vez la concentración de proteína por el método de Bradford. Se demostró que las condiciones
óptimas donde se produce mayor cantidad de actividad enzimática fueron a una temperatura de
30ᵒC, pH 3 y tiempo de 30 minutos, obteniendo 4,20 UE/ml, a su vez se realizó una comparativa
utilizando cáscara de naranja como sustrato, donde se demostró que la cascarilla de cacao es
buen sustrato para aplicarlo en este método para la producción de la enzima poligalacturonasa.
Palabras Claves: Poligalacturonasa, fermentación en estado sólido, Aspergillus Niger.
XIX
"PRODUCTION OF POLYGALACTURONASE BY ASPERGILLUS NIGER FROM COCOA

HUSK CCN-51 BY FERMENTATION IN SOLID STATE"
Authors: Chóez Casierra Romy Deyanira; Pilco Tomalá Sebastián Rodrigo

Advisor: Ing. Cecilia Uzca Sornoza. MSc.
ABSTRACT
The generation of agroindustrial waste is currently increasing, being a problem of global interest,
because these wastes do not receive adequate treatment, which leads to the increase in
environmental pollution. Biotechnology, a science that seeks alternative processes to use these
materials, transform them and give them added value. In the present investigation, CCN-51
cocoa husk is found as a substrate for the production of polygalacturonase, using Aspergillus
Niger; various tests were measured to determine the temperature, pH and optimal time for
enzyme production, to determine the enzymatic activity by applying the 3, 5-dinitrosalicylic
(DNS) method, in turn the protein concentration by the Bradford method. It is shown that the
optimal conditions where the greatest amount of enzymatic activity occurs were at a temperature
of 30ᵒC, pH 3 and 30 minutes, obtaining 4.20 EU / ml, once a comparison was made using
orange peel as a substrate, where it was shown that cocoa husk is a good substrate to apply in this
method for the production of the enzyme polygalacturonase.
Keywords: polygalacturonase, fermentation in solid state, Aspergillus Niger
XX
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que modifican el sustrato y lo convierte en producto, mediante
reacciones bioquímicas aceleradas. Dentro de este grupo de proteínas se encuentran las
pectinasas, cuya función es la de degradar los componentes pécticos que se encuentran ubicados
en las paredes celulares de las plantas espermatófitas. En el grupo de las enzimas pectinasas, se
encuentran las enzimas poligalacturonasas, estas tienen acción en el homogalacturonano que
hidroliza las uniones glicosídicas. Actualmente son utilizadas en las industrias, más que todo en
la industria alimentaria, para la fabricación de productos como obtención de jarabes, clarificación
de jugos entre otros; al igual que permiten mejorar las características del producto elaborado, a
su vez tienen gran uso en la industria textil y médica.
Ecuador es un país principalmente agroindustrial, el cual al manejar gran cantidad de
plantaciones que son aprovechadas por las industrias deja consigo gran proporción de desechos.
Estos últimos pueden ser altamente aprovechados, al ser la materia prima para nuevos productos,
empleando el tratamiento adecuado y a su vez pueden impulsar a que los productos principales
tengan un mayor valor agregado. El cacao CCN-51 es una especie de cacao que se encuentra
netamente en la costa de Ecuador, es reconocido por ser altamente tolerante a enfermedades y
por ser el más popular a nivel nacional por su rendimiento, al tener un corto tiempo de
producción. Por lo tanto, existen grandes cantidades de desechos agroindustriales, generados por
este fruto, siendo la cascarilla del cacao su principal excedente por lo que puede ser aprovechado
de gran manera para la generación de productos. La biotecnología es una alternativa de gran
utilidad para darle uso y transformar este residuo agroindustrial, al emplear organismos vivos,
que aprovechen las propiedades químicas y bioquímicas de este sustrato con las técnicas de
fermentación en estado sólido que permitan generar enzimas.
1
La fermentación en estado sólido (FES) es un proceso que da paso al crecimiento de
microorganismos en un medio sólido, lo cual es óptimo para la producción de enzimas,
combustibles, alimentos, entre otros.
El presente trabajo tiene como objetivo la producción en fermentación en estado sólido de
la enzima poligalacturonasa partiendo de la cascarilla de cacao CCN-51, como sustrato principal
y del hongo Aspergillus niger.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1.Planteamiento del problema.
Como describe en Chafla et al. (2016), la producción de cacao genera gran cantidad de
desechos agroindustriales siendo 211.500 toneladas en el año 2014, compuestos en un 75% por
la cáscara de la mazorca y 25% de la cascarilla que recubre el grano de cacao.
Actualmente existe un crecimiento en la producción de este fruto y por lo tanto también de la
generación de su desecho. El mal manejo de estos desechos conlleva a problemas de impacto
ambiental. En diversos países se han desarrollado variedad de trabajos investigativos de
producción de enzimas pécticas partiendo de desechos agroindustriales, sin embargo, Ecuador ha
sido la excepción a pesar de ser un país principalmente agrícola, del cual se podría obtener un sin
número de fuentes de energía para la producción de las enzimas antes mencionadas. Las
industrias que hacen uso de este producto por falta de material investigativo han optado por su
importación en lugar de implementar la producción de enzimas.
Debido a que el cacao CCN-51 es cosechado netamente en Ecuador, en este trabajo
investigativo se pretende aprovechar uno de sus residuos agrícolas, específicamente la cascarilla
de cacao para la producción de poligalacturonasa (PG) mediante la fermentación en estado
sólido. Este proceso podría ser implementado en industrias siendo una alternativa sustentable
para el futuro.
3
1.2.Formulación y sistematización del problema
1.2.1. Formulación del problema de investigación
La cascarilla de cacao CCN-51 puede convertirse en materia prima para la obtención de la
enzima poligalacturonasa por medio de la fermentación en estado sólido y del Aspergillus niger,
representando una posible solución para el subaprovechamiento de este excedente agroindustrial.
Consecuentemente, este residuo tendría un menor impacto en el medio ambiente y representaría
también la generación de un nuevo producto para nuestro país.
1.2.2. Sistematización del problema de investigación
¿Por fermentación en sustrato sólido se generará poligalacturonasa con actividad enzimática
y concentración de proteínas comparables con estudios de otras fuentes?
¿Cuáles serán las condiciones más idóneas para la producción de la enzima
poligalacturonasa con mejor actividad enzimática?
¿La producción de poligalacturonasa de cascarilla de cacao es similar a la obtenida de
cáscara de naranja?
¿La poligalacturonasa a generarse será estable a condiciones operacionales industriales?
1.3.Justificación de la investigación.
1.3.1. Justificación teórica
Como una alternativa para la disminución de los residuos agroindustriales se han
desarrollado diversos estudios para darle un valor agregado. Hasta la fecha se han reportado
trabajos como, la producción de biohidrógeno a partir de varias fuentes de residuos
agroindustriales, de los cuales se pude mencionar: paja de arroz sometida a fermentación
4
anaerobia a escala laboratorio en Taiwán (Chang et al., 2011), la obtención de hongos
comestibles a partir de residuos sólidos (López et al., 2006), o investigaciones donde se encontró
que las cortezas de naranja sirven para la fabricación de productos alimentarios debido a que
posee características que permiten la mezcla de diferentes componentes para las formulaciones y
se logró disminuir el sabor amargo con la incorporación de soluciones de sacarosa (Restrepo et
al., 2011).
Actualmente se han desarrollado a nivel mundial muchos estudios de producción del amplio
grupo de las enzimas pectinasas, siendo la poligalacturonasa (PG) una de las enzimas
perteneciente a este grupo. Según estudios anteriores, se tiene conocimiento que se ha realizado
la producción de esta enzima haciendo uso de residuos de cultivos como la cáscara de naranja,
salvado de soja o trigo los cuales son el sustrato más óptimo para el proceso de fermentación en
estado sólido hasta la fecha.
En el presente trabajo de titulación se hace uso de la cascarilla de cacao, un residuo que al
contener alto índice de pectina podría ser ampliamente aprovechado para la generación de la
poligalacturonasa por el método de fermentación en estado sólido.
1.3.2. Justificación metodológica
Según Villalpando (2010), la fermentación en estado sólido es un proceso en el que los
microorganismos logran reproducirse en un medio de materiales sólidos humedecidos. Hasta el
momento se han elaborado mejores tecnologías con el fin de llegar al completo aprovechamiento
de desechos producidos en la agricultura haciendo uso de procesos de costo mínimo y mayor
rendimiento para la producción de enzimas. Comparando varios aspectos entre la fermentación
en estado sólido y fermentación en estado líquido, la primera posee mayor ventaja, al producir
proteínas con mayor actividad enzimática y con menor costo de producción, al utilizar equipos
5
de tecnología económicos, por lo que resulta ser un proceso rentable para industrias que hacen
uso de enzimas pectinasas en su producción.
1.3.3. Justificación práctica
Se pretende obtener la enzima poligalacturonasa, la cual es utilizada en diversas industrias,
como por ejemplo, alimenticia, textil y otras. Al no existir producción local de dicha enzima, se
la obtiene mediante importación, lo cual genera retraso y tiene un mayor costo para el proceso
que se lleva a cabo, siendo esto perjudicial para las industrias que desean una mayor producción
a un menor coste. El presente proceso utiliza como fuente de pectina y materia prima a la
cascarilla de cacao CCN-51, la cual será obtenida de una industria chocolatera, siendo este un
residuo agroindustrial. La fermentación en estado sólido a realizarse será a nivel de laboratorio,
que permitirá definir las condiciones adecuadas para que Aspergillus niger produzca la enzima
de interés. Estas condiciones pueden en un futuro aplicarlas a nivel industrial para generar un
proceso de producción de poligalacturonasa de bajo costo y a su vez que reduzca los desechos
que actualmente son acumulados en el medio ambiente.
1.4.Objetivos de la investigación.
1.4.1. Objetivo general
Producir poligalacturonasa por Aspergillus niger a partir de cascarilla de cacao CCN-51
mediante fermentación en estado sólido.
1.4.2. Objetivos específicos
 Realizar el tratamiento de materias primas.
 Efectuar la fermentación del sustrato en estado sólido empleando Aspergillus niger.
 Determinar actividad enzimática y cuantificar las proteínas totales de la enzima obtenida.
6
 Seleccionar las condiciones más adecuadas para la producción de poligalacturonasa en base
a la actividad enzimática.
 Establecer una comparativa de producción de poligalacturonasa entre la cascarilla de cacao
y la cáscara de naranja.
 Definir la estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa generada.
1.5.Delimitación de la investigación
1.5.1. Delimitación temporal
El periodo investigativo y experimental fue de aproximadamente 4 meses.
1.5.2. Delimitación espacial
El presente proyecto de titulación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología,
Microbiología y en el Instituto de Investigaciones Tecnológicas de la Facultad de Ingeniería
Química de la Universidad de Guayaquil, ubicado en la Ciudadela Universitaria “Salvador
Allende”-Av. Delta y Av. Kennedy-Castilla Postal 471; en el cual se pudo ocupar los diferentes
materiales y equipos para poder realizar con éxito los diversos análisis de cuantificación de
proteínas, actividad enzimática y estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa obtenida
de la cascarilla de cacao CCN-51 y cáscara de naranja mediante la fermentación en estado sólido.
1.5.3. Delimitación del contenido
El presente proyecto se centra en el ámbito biotecnológico, en el cual se aprovechan
diversos desechos agroindustriales, considerados como materia prima para la producción de
enzimas, las mismas que son requeridas para diferentes procesos industriales.
7
1.6.Hipótesis de la investigación
La cascarilla de cacao CCN-51 es una materia prima, para la producción de la enzima
poligalacturonasa bajo condiciones de fermentación en estado sólido.
1.6.1. Variables independientes
 Condiciones de fermentación en estado sólido.
- Temperatura de fermentación.
- pH de fermentación.
 Condiciones de estabilidad operacional
- Tiempo de reacción.
- Temperatura de reacción.
1.6.2. Variables dependientes
 Cuantificación de proteínas.
 Actividad enzimática.
8
1.6.3. Operacionalización de las variables.
Tabla 1 Operacionalización de las variables
Tipo de
Variable Sub-variables Definición Unidad Instrumentos
variable
Caracterización de Cuantificación de Total de proteínas presentes en
µg/ml Espectrofotómetro
proteínas proteínas una solución.
Dependiente Cantidad de enzima que cataliza
Caracterización de Actividad
un micromol de sustrato en un UE/ml Espectrofotómetro
actividad enzimática enzimática
minuto
Ciclo específico para desarrollar
Tiempo Días (d) Incubadora
una actividad
Magnitud física encargada de Grados

Condiciones de Temperatura medir los niveles de calor Celsius Incubadora
fermentación presentes en un objeto (°C)
Parámetro empleado para medir la
pH acidez o basicidad de una - Potenciómetro
Independiente sustancia acuosa
Ciclo específico para desarrollar
Tiempo Horas (h) Incubadora
una actividad
Magnitud física encargada de Grados
Condiciones de Temperatura medir los niveles de calor Celsius Incubadora
estabilidad operacional presentes en un objeto (°C)
Parámetro empleado para medir la
pH acidez o basicidad de una - Potenciómetro
sustancia acuosa
UE/ml = Unidades enzimáticas por mililitro Elaborado por autores
8
CAPÍTULO II
MARCO REFERENCIAL
2.1.Marco teórico
2.1.1. Sustancias pécticas
Se definen a las sustancias pécticas como polisacáridos, presenta mayor proporción de ácido
galacturónico, mientras que a menor cantidad esta la ramnosa, arabinosa y galactosa. Presentes
en polisacáridos estructurales, membranas celulares y primordialmente en el 90% de la pared
celular de los tejidos vegetales existentes, de allí se encuentran la celulosa, hemicelulosa y
pectina (Rodríguez & Serrat, 2008). Las pectinas son de origen vegetal, heterogéneos, solubles
en ácidos y agua. Están presentes en frutas y vegetales, específicamente en las regiones
intercelulares de la pared celular primaria de los mismos. El contenido de pectina en frutas y
vegetales depende del producto, por ello no es igual y varía en cada caso, es decir, los tejidos de
ciertas especies no son aptas para ser empleadas como materia prima para la producción a nivel
industrial debido a que no es rentable en el caso de que exista niveles bajos de pectina en una
fruta o vegetal (Catalán, 1964).
Constituido estructuralmente por el ácido D-galacturónico y los grupos carboxilos
esterificados con metanol, la unión se presenta mediante enlaces glicosídicos α-1,4 (Mamani,
2012).
10
Figura 1 Estructura química de la pectina (Mamani, 2012)
Tiene gran demanda en la industria de alimentos, siendo clave en la producción de jugos
debido al efecto reductor de la viscosidad, lo cual ayuda a procesos posteriores como por
ejemplo la clarificación, filtración, etc. (Gummadi, 2003).
2.1.2. Clasificación de las pectinasas
Dependiendo de la forma en que interviene sobre un polisacárido, se clasifican en:
pectinesterasas, las cuales pueden ser de origen vegetal o microbiano; poligalacturonasa, pueden
ser endo y exo, de origen vegetal o microbiano; pectin y pectatoliasas, están sintetizadas por
microorganismos (Reyes, 2013).
2.1.2.1.Poligalacturonasa
Esta enzima hidrolasa se diferencia de las demás debido a su acción despolimerizante, la
cual interviene en el ácido poligalacturónico y en las pectinas que poseen mínimo grado de
metoxilación. Existen dos tipos: la endopoligalacturonasa (endo-PG) y la exopoligalacturonasa
(exo-PG), se diferencian según su modo de acción. Las endopoligalacturonasas (endo-PG)
originan la ruptura de los enlaces glucosídicos internos (α-1,4) del ácido poligalacturónico de
manera aleatorio, esto provoca el desprendimiento de monómeros de ácido galacturónico u
oligomeros de 2 o 3 unidades del ácido, por otro lado, las exopoligalacturonasas (ex-PG)
11
interviene en el extremo no reductor del ácido poligalacturónico mediante la hidrolisis de los
enlaces (α-1,4) de los enlaces glicosídicos, lo cual da como resultado ácido galacturónico (García
et al, 2002).
2.1.2.2.Microorganismos empleados para la producción de poligalacturonasa
Con respecto a la producción de esta enzima, se puede producir empleando organismo como
hongos, bacterias, levaduras para las endo-PG, mientras que las exo-PG solo se pueden producir
empleando hongos y bacterias. Generalmente a nivel industrial se emplean hongos para la
producción de pectinasas, siendo el Aspergillus el más empleado para dicho proceso. En la
Tabla 2 se enlistan los tipos de organismo (hongos saprófitos) que se pueden emplear para la
producción de la enzima poligalacturonasa detallando el tipo de PG producido, en la cual se
puede apreciar la diferencia que presenta el Aspergillus niger debido a que se producen varias
formas de poligalacturonasas que se presentan con diferentes pesos moleculares, oscilan entre 30
y 60 KDa (Rodríguez & Serrat, 2008).
Tabla 2 Tipos de organismos usados en la producción de poligalacturonasa (Rodríguez &

Serrat, 2008)
Organismo PG Características
Aspergillus
Endo-PG PGI(61KDa), PGII(42KDa),PGIII(42KDa),
carbonarius
PGAL(35KDa),PGALL(38KDa),PGAA(370aa),
Aspergillus
Endo-PG/Exo-PG PGAB(362aa), PGAC(383 aa), PGAD(495aa),
niger
PGE(378 aa)
Aspergillus
Endo-PG PG (37.5 KDa)
oryzae
Aspergillus
Exo-PG/Endo-PG PGAX (78 KDa), PGAII (362 aa)
tubigensis
Aspergillus
Endo-PG 36 KDa
ustus
Kluyveromyces
Endo-PG EPGI (34 KDa)
marxianus
Neurospora
Endo-PG 37 KDa
crassa
12
Exo-
Penicillium
PG(I,II,III)/Endo- -
frequentans
PG(I,II,III)
Saccharomyces
Endo-PG PGLI (361 aa, 37 KDa)
cerevisiae
*kDa: Kilodalton;
*Endo-PG: Endopoligalacturonasa
*Exo-PG: Exopoligalacturonasa
2.1.2.3.Aplicación industrial de las enzimas pectinasas
Producidas hace más de 60 años principalmente para su aplicación en la industria de las
bebidas y alimentos, por lo general se emplean microorganismo de origen fúngico, siendo el más
destacado entre la amplia diversidad de hongos el Aspergillus niger, para su producción. El
proceso que conlleva al producto requiere de una serie de condiciones, para lo cual se emplea la
metodología de fermentación en estado sólido o sumergida, para así obtener enzimas pécticas.
Específicamente tiene su aplicación en la clarificación de los jugos, teniendo un papel importante
cuando se obtiene el jugo de la fruta después del prensado ya que el líquido presenta un aspecto
turbio debido a que existen fragmentos de pared celular y complejos constituidos por proteínas
positivamente cargadas la cual se encuentra rodeadas de una capa de pectina con carga negativa.
Por otro lado, también está el proceso de la maceración, el cual tiene como finalidad degradar la
laminilla media del tejido vegetal para generar células libres relativamente intactas (Villalpando,
2010).
2.1.3. Residuos agroindustriales
Actualmente se consideran residuos agroindustriales a aquellos desechos que tienen un valor
agregado, lo cual conlleva a ser una fuente alternativa para poder generar diversos productos,
tales como biogás, biocombustibles, hongos, etc., siendo a su vez amigable con el medio
ambiente, debido a que utilizarlos como materia prima reduce el índice de contaminación. El
13
proceso de fermentación en estado sólido (SSF) cumple un papel importante en este punto
debido a que los desechos agroindustriales son materia prima ideal que sirven como sustrato para
la producción de enzimas, vitaminas, antioxidantes, etc.; se utilizan microorganismos en este
proceso. La principal problemática de estos desechos es que no todas las industrias destinan este
material a la producción de productos alternos, eliminándolos mediante la quema, vertido o
relleno no planificado. Teniendo como consecuencias el aumento de contaminación, provocando
cambios climáticos, debido a que estos desechos no son tratados correctamente, lo cual induce al
aumento de gases de efecto invernadero (Sadh, Duhan, & Duhan, 2018).
Los residuos agroindustriales se pueden clasificar en residuos agrícolas, (abarcan lo
relacionado con actividades agrícolas y forestales) y residuos industriales. Los residuos agrícolas
son aquellos que se generan después de realizar la cosecha del cultivo, los cuales se pueden
considerar desechos las hojas, tallos, astillas, paja, cáscaras, etc. Por otro los residuos industriales
son aquellos que provienen principalmente de las industrias de alimentos y de jugos, actualmente
la demanda de la generación de estos residuos ha aumentado debido al notable crecimiento de la
población (Yusuf, 2017).
2.1.4. Cacao CCN – 51
Homero Castro, agrónomo, especialista e investigador en cacao logra en 1965 luego de una
serie de estudios, realizar una clonación del cacao, al cual lo denominó CCN–51, que significa
Colección Castro Naranjal. Su estudio tuvo relevancia en dicha época debido a la problemática
que existía en ese entonces; en aquella época una enfermedad conocida como “escoba de bruja”
estaba perjudicando las plantaciones, principalmente al cacao, lo cual conllevaba a el deterioro
total de los cultivos (Cedeño, 2011).
14
El principal propósito de la clonación del cacao CCN–51 fue crear un cacao resistente a
diversas enfermedades propias de las plantaciones, se obtuvo lo planteado, sin embargo esta
especie nos brinda diversas ventajas en comparación con otros tipos de cacao debido a que nos
proporciona un índice alto de productividad, siendo un ejemplar de mucha importancia para
Ecuador, país donde es nativo, en el cual actualmente se comercializa y exporta su fruto,
teniendo un papel importante en la economía y desarrollo del país. Estudios revelan que en
Ecuador existen cerca de 50.000 Hectáreas destinadas a la siembra del cacao CCN–51
(Anecacao, 2018).
2.1.4.1.Características que contiene el cacao CCN–51
En comparación con otros tipos de cacao, el CCN–51 tiene una gran ventaja según sus
características al ser más resistente a enfermedades, mayor productividad y tiene tiempo de
cosecha más corto (Díaz, 2012). De forma general se detallan las características del CCN–51 en
la Tabla 3.
Productividad Alta (2 – 2,5 Toneladas/Hectáreas)

Tolerante a enfermedades Principalmente a la “escoba de bruja”
Tamaño de árbol Pequeño, siendo de fácil manejo
Tamaño de semilla Grandes (1.4 – 1.5gr)
Tamaño de mazorca Grandes (8 mazorcas equivalete a 1 lb de cacao seco)
Tiempo de producción 2 años
Contenido de manteca Relativamente elevado (54%)
Sabor y aroma Intenso
Tabla 3 Características del cacao CNN-51 (Díaz, 2012).
15
2.1.5. Cascarilla del cacao
La cascarilla de cacao es considerada como un residuo agroindustrial, es el resultado del
producto final del proceso de fermentado, secado y tostado del grano del cacao (Murillo, 2009).
Posee un aporte nutricional, rico principalmente en vitaminas A y C, fibra, pectina,
teobromina, minerales (calcio, magnesio), ácido linoleico, proteínas, carbohidratos y lípidos, sin
embargo no posee una cantidad considerable de energía debido a que solo aporta menos de 2500
kcal/kg. Al contar con teobromina, lo hace un producto beneficioso para la salud del ser humano
debido a que esta sustancia cumple con funciones relacionadas con la cafeína; entre las que más
resaltan están: sirven como estimulante, posee propiedades diuréticas. La teobromina es la
sustancia que se encarga de dar el sabor característico del fruto del cacao, sabor amargo.
Además, los minerales que posee y principalmente el ácido linoleico ayudan a reducir
enfermedades cardiovasculares y del sistema respiratorio respectivamente. La cascarilla obtenida
después del proceso final del cacao presenta características como: color marrón oscuro, olor a
chocolate, crujiente, seco y fibroso (Tapia, 2015). La composición (% de materia seca) de la
cascarilla se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4 Composición de la cascarilla de cacao (Alexander et al., 2008)
Composición Valores (%)

Humedad 5,4 – 15,3
Proteína cruda 6,3 – 10,4
Fibra cruda 23,4 – 36, 2
Componentes del extracto etéreo 0,5 – 2,5
Extracto libre de nitrógeno 31,8 – 61,4
Cenizas 6,0 – 10,8
2.1.5.1.Porcentaje de pectina en la cascarilla de cacao
Dentro de los resultados obtenidos de producción de pectina a partir de cascarilla de cacao
descrito en (Suarez & Orozco, 2014), se demostró que esta es una fuente magnifica para la
16
producción de pectina; mediante una serie de análisis se pudo observar el comportamiento del
producto obtenido en la experimentación.
Para la previa obtención del método adecuado de extracción se aplicaron distintos parámetros,
siendo los más óptimos a 70 °C durante un tiempo de 95 minutos, siendo la prueba que más se
acercó a características físicas de la pectina comercial. Los valores se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5 Cantidad de pectina en la cascarilla de cacao (Suarez & Orozco, 2014)
(meq (mg Contenido Contenido de

Interacción
Rendimiento carboxilos Pectina/ de Grado de Ácido
temperatura
(%) libre/ g meq metoxilo gelificacion Galacturónico
-tiempo
pectina) NaOH) (%) (%)
70°C -75’ 10,97 0,49 2035,67 2,90 65,57 25,12
70°C – 95’ 8,83 0,43 2334,85 3,40 71,89 26,86
95°C – 75’ 7,71 0,22 4593,79 2,41 78,00 17,53
95°C – 95’ 12,21 0,41 2440,32 2,65 67,52 22,24
En la tabla anterior se encuentran los parámetros empleados para la obtención de pectina y
los resultados obtenidos de cada uno respectivamente. Concluyendo mediante los resultados de
la tabla y tomando como base al contenido de metoxilo y de ácido galacturónico que los valores
de 70°C y 95 minutos son los más óptimos para la extracción de pectina de una mejor calidad
que la resultante de los otros parámetros, teniendo como valor de rendimiento de 8.8 g/100 g de
cascarilla, la cual puede ser utilizada de gran manera en las industrias. (Suarez & Orozco, 2014)
En las Figuras 2 y 3 se muestra una comparación de la curva de análisis infrarrojos que se le
realizaron a la pectina extraída de cascarilla de cacao y de pectina comercial.
17
Figura 2 Espectro IR de pectina extraída a partir de cascarilla de cacao a temperatura y tiempo
óptimo (Suarez & Orozco, 2014)
Figura 3 Espectro IR de pectina comercial obtenida de muestra de Manzana (Vásquez et al,

2008)
2.1.6. Aspergillus
Descrito por A. Micheli en 1729, el cual nombro al hongo de esta manera debido a que, en
los primeros descubrimientos, este presentaba la cabeza conidial semejante a un “aspergillum”
(empleado por los sacerdotes para esparcir agua bendita). Es un hongo filamentoso presente en la
naturaleza. Según estudios existen aproximadamente 900 especies, las cuales fueron clasificadas
en 18 grupos; dependiendo de sus características, existen especies de Aspergillus que pueden ser
18
perjudiciales para la salud del ser humano, entre ellas tenemos: Aspergillus fumigatus (85%), A.
flavus (5-10%), A. niger (2-3%), A. terreus (2-3%), A. versicolor, A. nidulans, A. glaucus, A.
clavatus, A. cervinus, A. candidus, A. flavipes y A. ustus (Alcalá, Muñoz, Peláez, & Bouza, n.d.).
En la Figura 4 se muestra como está estructurado morfológicamente el género Aspergillus:
Figura 4 Composición de Aspergillus (Pildain, 2006)
Entre las características que se destacan para poder diferenciar las especies es el color,
debido a que no todos son iguales, presentan tonos verde, amarillo, pardo, blanco, gris y negro;
además se pueden identificar mediante microscopio las formas básicas, entre ellas están:
claviforme, columnar, radiada y globosa (Carrillo, n.d.).
19
2.1.6.1.Aspergillus Níger
Pertenece al género Aspergillus, considerado como un hongo relativamente seguro,
heterótrofo, utiliza principalmente desechos orgánicos como un medio para poder obtener
energía; característico entre las especies de Aspergillus por presentar en su morfología conidios
que a simple vista tienden a ser color negro o marrón, los cuales poseen una cabeza de forma
circular; presentan esporas de 5 µm. Para poder aislar Aspergillus niger, se necesita preparar un
medio de cultivo agar Czapek (United States Environmental Protection Agency, 1997).
Figura 5 Fotografía microscópica del Aspergillus niger (Vásquez, 2009)
2.1.6.2.Aplicaciones del Aspergillus niger en la industria
Relacionado directamente con la industria de alimentos y farmacéutica, debido a que se
utiliza este hongo para la producción de diversos productos en donde se pueden aprovechar
recursos agroindustriales como sustrato (Ocampo, Gonzalez-Brambila, & López-Isunza, 2013).
Al ser un hongo seguro se lo involucra de manera frecuente con la producción de enzimas,
tales como, amilasa, amiloglucosidas, celulasas, lactasas, invertasas, pectinasas y proteasas
ácidas; por lo general la obtención de las enzimas se las realiza mediante fermentación, las cuales
20
pueden ser en sustrato sólido o en procesos sumergidos (Nadumane, Venkatachalam, & Gajaraj,
2016).
Además, es importante en la producción de ácidos orgánicos, por ejemplo, el ácido cítrico y
el ácido glucónico; donde la obtención del ácido cítrico se ha vuelto tan habitual llegando a
obtener en los últimos años cerca de 350,000 toneladas mediante procesos sumergidos o en
fermentación de sustrato sólido (Vásquez, 2009).
2.1.7. Enzimas
La palabra enzima proviene de la terminología griega en- (dentro) y zyme (levadura),
indagada cerca de 1835 por Jon Jakob Berzelius, químico sueco, el cual especifico que poseía
una acción catalítica (Worthington Biochemical Corporation, n.d).
Wilhelm Kiihne, fisiólogo alemán, empleo esta palabra en 1878 mientras realizaba
experimentos para producir alcohol empleando levaduras a partir de azucares; con el pasar del
tiempo, diversos avances científicos lograron emplear un procedimiento adecuado para la
extracción, caracterización y comercialización de varias enzimas; sin embargo, en 1920 lograron
cristalizarlas, lo cual sirvió para descubrir el vínculo que posee la acción enzimática con
moléculas de proteína (Robinson, 2015).
Se consideran a las enzimas como catalizadores biológicos, las cuales cumplen la función
específica de acelerar procesos bioquímicos. Actualmente se extraen de las células y se las utiliza
en la elaboración de diversos procesos. Es importante indicar que, al ser catalizadores, solo se
utilizan concentraciones relativamente bajas evitando su consumo durante su reacción
(Robinson, 2015).
21
Se conocen alrededor de 2000 enzimas, tienen la ventaja de ser biodegradables, no toxicas,
presentan la particularidad de permanecer activas inclusive después de su respectivo aislamiento
(Bhatia, 2018).
2.1.7.1.Aplicaciones de las enzimas en la industria
Empleado a inicio del sigo XX solo en la industria de alimentos, teniendo como prioridad las
enzimas provenientes de animales y plantas, esto con relación a los inconvenientes que existían
de contaminación y toxicidad que presentaban las de origen microbiano (Robinson, 2015).
En la actualidad, debido a los avances científicos, las enzimas juegan un rol importante en
diversos sectores industriales; involucrada directamente con la industria del papel, cuero, textil,
agricultura y alimentos, esto implica una significativa disminución de costos debido a su elevado
rendimiento (Bhatia, 2018).
En la Tabla 6 se detalla el uso y porcentaje de aplicación que presentan las enzimas en la
industria:
Tabla 6 Porcentaje de aplicación de enzimas en la industria (Bhatia, 2018)
Industria Usos de enzimas Porcentajes de uso

Alimentaria Queso/mantequilla, modificado con enzimas 45%
Detergentes Proteasas, lipasas, amilasas 35%
Textil Amilasas y catalasas 10%
Cuero Proteasas 3%
2.2.Marco conceptual
2.2.1. Cacao CCN-51
El cacao CCN – 51 es un tipo de cacao que se produce comúnmente en Ecuador, posee una
gran ventaja en comparación con otros cultivos de cacao, debido a que su tiempo de producción
22
es de tan solo 24 meses, no necesita de procesos o aditivos para que se produzca con éxito su
fructificación. (Díaz, 2012).
2.2.2. Aspergillus niger
Se considera al Aspergillus niger como una de las especies más habituales del género
Aspergillus, es un hongo filamentoso que se utiliza comúnmente en procesos e innovaciones
relacionadas con la biotecnología. A lo largo del tiempo, generalmente este hongo se lo emplea
para producir enzimas extracelulares alimentarias y ácido cítrico. (Schuster et al., 2002).
2.2.3. Enzima
Se consideran biocatalizadores, tiene como función principal catalizar reacciones
bioquímicas en un ser vivo, se pueden forman mediante el uso de sustratos. (López & Robles,
2019).
2.2.4. Poligalacturonasa
La poligalacturonasa es una enzima que pertenece a la clasificación de las pectinasas, esto
depende de la forma en que intervienen sobre un polisacárido; esta enzima divide los enlaces α
(1-4) entre los ácidos galacturónicos próximos, los cuales tienen la función principal de actuar
dentro del esqueleto del homogalacturonano de la pectina (Tucker, 2004).
Principalmente aparece en diversos hongos, bacterias y levaduras, los cuales sirven como
huésped para su crecimiento. Siendo primordial su uso en la industria del zumo (Anand, 2016).
2.2.5. Fermentación en estado sólido
La fermentación en estado sólido (SSF) es el proceso de fermentación en el cual implica el
crecimiento de microorganismos sin la necesidad de que exista presencia de líquido libre en el
23
sustrato, no obstante, para que exista el crecimiento celular, el sustrato o medio de cultivo debe
de estar suficientemente húmedo (Lanka, 2015).
2.2.6. Método Bradford para cuantificación de proteínas
El método Bradford, descrito por el Dr. Marion Bradford, es un ensayo de laboratorio que
sirve para cuantificar las proteínas existentes en una muestra fermentada previamente. A
diferencia del método de Lowry, este proceso resulta ser más sencillo, rápido y exacto al
momento de tomar los datos. (Kruger, 2009).
El fundamento principal de este ensayo es la mezcla de una solución acida que está
compuesto por un colorante (Azul de Coomassie) y la proteína, el cual al momento de que se
produce esta mezcla, la muestra cambia de 465 nm a 595 nm, además nos podemos percatar
cuando el colorante se ha unido a la proteína por completo por su cambio físico, el cual la mezcla
debe tornarse color azul, esto se debe a las interacciones hidrofóbicas e iónicas, las cuales
estabilizan la forma aniónica del tinte (Carprette, 2015).
2.2.7. Método del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS)
Generalmente llamado como el método del DNS, es una técnica de laboratorio utilizada
específicamente para calcular la cantidad de azucares reductores presentes en una muestra
previamente fermentada, en la cual ocurre una reacción redox en la que intervienen el ácido 3,5-
dinitrosalicílico y los azucares reductores que se encuentran en la muestra a analizar, siendo el
espectrofotómetro el equipo principal en este proceso, debido a que nos ayuda a determinar las
absorbancias de la muestra analizada a 540nm (Garriga, 2017).
El ácido 3,5 – Dinitrosalicílico se presenta naturalmente con un color amarillo, sin embargo,
al momento de que reacciona con un azúcar reductor, este se transforma en 3 – amino – 5 –
24
nitrosalicílico, el cual provoca un cambio físico en dicho compuesto, debido a que se torna con
un color naranja o marrón oscuro (Universidad King Saud, n.d).
Cabe recalcar la importancia de que este método puede no ser eficiente si las muestras a
analizar tienden a ser muy coloreadas, debido a que, al momento de tomar la lectura en el
espectrofotómetro, puede darnos un valor erróneo. (Upiig, 2016).
2.3.Marco contextual
La enzima PG es utilizada en las industrias, principalmente en la clarificación de jugos,
como en la producción de aceites; la producción de esta enzima es un proceso que se podría
implementar dentro de la industria, siendo Ecuador un gran productor de cacao, no se ha
aprovechado este recurso como debería. El desarrollo del proyecto se llevará a cabo en el
laboratorio de Biotecnología en la Facultad de Ingeniería Química, ubicado en la Ciudadela
Universitaria “Salvador Allende”, Malecón del Salado entre Av. Del Periodista y Av. Kennedy
para la realización de análisis correspondientes.
Las materias primas a utilizar son:
Cascarilla de cacao CCN-51, la cual será proporcionada por una industria chocolatera
ubicada en la provincia del Guayas, la producción del cacao tiene origen en Naranjal, provincia
del Guayas.
Cáscara de naranja, será obtenida de un mercado comercial en el centro de Guayaquil,
provincia del Guayas.
25
CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1. Nivel de investigación
El presente trabajo es de tipo descriptivo, debido a que en él se describe una relación entre
las variables independientes y dependientes seleccionadas para el desarrollo de este proyecto.
3.2. Diseño de investigación
El tipo de investigación es experimental, en el proceso se efectuaron diferentes operaciones
en las variables independientes a distintas condiciones, con la finalidad de constatar cuales son
los resultados que conllevan su aplicación en las variables dependientes.
3.3. Metodología de la investigación
La parte experimental del trabajo de titulación se efectuó en los laboratorios de
Microbiología, Biotecnología y en el Instituto de Investigaciones Tecnológicas de la Facultad de
Ingeniería Química de la Universidad de Guayaquil. El proceso se fundamentó siguiendo las
directrices de la metodología idónea seleccionada que contribuyeron a la obtención de la enzima
poligalacturonasa empleando Aspergillus niger mediante la fermentación en estado sólido,
utilizando como sustrato la cascarilla de cacao CCN-51 y a su vez cáscara de naranja, para poder
realizar una comparativa entre ambos sustratos, con referencia a la producción de dicha enzima.
Para conseguir dichos resultados se efectuaron varios ensayos en los cuales se evaluaron las
variables de pH y temperatura para que se produzca la enzima poligalacturonasa, mientras que el
tiempo de fermentación se mantuvo estable en la experimentación.
26
Con respecto a la estabilidad operacional las variables que se evaluaron fueron la
temperatura y el tiempo de incubación del extracto crudo enzimático (ECE) y su efecto en la
actividad enzimática de la poligalacturonasa.
3.4. Diseño experimental
Para la parte experimental, se seleccionaron varios parámetros detallados en la Tabla 7, con
el fin de evaluar las condiciones óptimas en la producción de la enzima poligalacturonasa. Tanto
las variables de temperatura y pH de fermentación, al igual que los niveles de trabajo de cada
variable fueron seleccionados en base a estudios previos en los que se emplean otras fuentes de
residuos agroindustriales diferentes a la cascarilla de cacao. La fermentación se efectuará por
triplicado para la cascarilla de cacao y cáscara de naranja, teniendo un total de 96 muestras.
Tabla 7 Parámetros para la producción de poligalacturonasa
PARÁMETROS DE PRODUCCIÓN
pH TEMPERATURA
3 25°C
4 30°C
5 35°C
6 40°C
Elaborado por autores
Las muestras obtenidas de las fermentaciones se someterán a ensayos analíticos en los
cuales se podrá determinar la actividad enzimática y cuantificar las proteínas para ambos
sustratos, a su vez se realizará una comparativa entre ambos sustratos para verificar cuál de las
materias primas presenta mayor eficiencia en la producción de la enzima poligalacturonasa.
Finalizado los análisis, se someterá a la mejor muestra, en triplicado, al estudio de estabilidad
operacional; para ello se aplicarán los parámetros de evaluación de temperatura y tiempo,
mismos que se encuentran detallados en la Tabla 8.
27
Tabla 8 Parámetros de estabilidad operacional
Tiempo Temperatura
(min) (°C)
30 35
60 55
90 75
3.5. Materiales y equipos
En la Tabla 9 se detallan los equipos, materiales y reactivos que se utilizaron en el presente
trabajo de investigación.
Tabla 9 Equipos, materiales y reactivos utilizados en el proceso de experimentación.
Equipos
Homogeneizador STOMACHER Balanza analítica BOECO
Estufa LINDBERG BLUE M
400 CIRCULATOR GERMANY
Autoclave ALL-AMERICAN Bomba de vacío GAST Tamizadora MLW
Potenciómetro PHTESTR 1º Agitador magnético MLW Incubadora VWR
Centrífuga HETTICH Espectrofotómetro DR 5000
Microscopio LEICA DM300
UNIVERSAL II - HACH
Cámara Neubauer BOECO Cabina de flujo laminar
GERMANY BASSAIRE
Materiales
Matraz Erlenmeyer 300 ml Mortero Papel aluminio
Matraz Kitasato 300 ml Agitadores de vidrio Gasas
Vidrio reloj Embudos Algodón
Espátulas de metal Papel filtro N°1 Fundas herméticas
Tubos de ensayo 10 ml Pipetas 10 ml Cascarilla de cacao CCN-51
Cepa de Aspergillus niger
Cáscara de naranja Puntas desechables
ATCC® 6275™
Micropipeta de 100 – 1000 µl Micropipeta de 10 – 100 µl Tamiz 600 µm
28
Reactivos
Agua destilada Nitrato de sodio Fosfato di potásico
Sulfato de magnesio
Cloruro de potasio Sulfato ferroso
heptahidratado
Tartrato de sodio y potasio Ácido galacturónico 3,5-dinitrosalicilico (DNS)
tetrahidratado (SIGMA-ALDRICH) (SIGMA-ALDRICH)
Reactivo de Bradford (SIGMA- Ácido poligalacturónico
Citrato de sodio
ALDRICH) (SIGMA-ALDRICH)
Hidróxido de sodio Ácido cítrico Ácido clorhídrico
Suero de albúmina bovino
(BSA) (SIGMA-ALDRICH)
3.6. Metodología experimental
3.6.1. Microorganismo y preparación del inóculo
La cepa de Aspergillus niger ATCC® 6275™ empleada fue proporcionada por el laboratorio
de Microbiología de la Facultad de Ingeniería Química, ubicado en la Universidad de Guayaquil.
Esta cepa se mantuvo en agar de papa de dextrosa a 27°C por 5 días y se refrigeró hasta su
posterior uso en la preparación del inóculo.
Se utilizó la cabina de flujo laminar (Bassaire) en la cual se procedió a realizar un barrido
del hongo de la placa que contiene A. niger, se inoculó en 50 ml de agua destilada esterilizada y
se dejó reposar durante 10 minutos, de esta solución se tomaron 10 µl y se realizó el contaje
celular en la cámara Neubauer (Boeco Germany) y con ayuda del microscopio electrónico (Leica
DM300). Se preparó una solución de esporas de 107 cells/ml y se dispuso de 1 ml de esta
solución para la posterior inoculación en cada uno de los recipientes de fermentación.
3.6.2. Preparación del sustrato
La cascarilla de cacao CCN-51 fue proporcionada por una industria chocolatera nacional
ubicada en la provincia del Guayas, cantón Guayaquil.
29
La cascarilla se la adquirió tostada, se realizó la molienda manualmente y posterior a esto
fue tamizada a 600 µm con ayuda de una Tamizadora (MLW). El sustrato pulverizado se
almacenó en fundas herméticas a temperatura ambiente hasta su uso en la fermentación en estado
sólido.
En el caso de la cáscara de naranja (actualmente mayor fuente de producción de PG) se la
obtuvo en el mercado municipal Santa Teresita de la ciudad de Guayaquil, provincia del Guayas.
Para el tratamiento de esta materia prima, las cáscaras fueron lavadas para descartar cualquier
tipo de impureza; seguido de esto se procedió a cortarlas y a realizar el secado de las mismas
utilizando una estufa (Lindberg Blue M) a 60°C durante 2 días, una vez secas las cáscaras, se
realizó la molienda manualmente y posterior a esto se tamizó a 600 µm. El sustrato pulverizado
se almacenó en fundas herméticas a temperatura ambiente.
3.6.3. Preparación de medios de fermentación
Se inició con la preparación de un medio nutritivo Czapek’s (Abdullah et al., 2018), el cual
está compuesto de la siguiente manera: 2 g de NaNO3 (Nitrato de sodio), 1 g de K2HPO4
(Fosfato dipotásico), 0.5 g de MgSO4·7H2O (Sulfato de magnesio heptahidratado), 0.5 g de KCl
(Cloruro de potasio) y 0.02 g de FeSO4 (Sulfato ferroso), se preparó el medio en 1 Lt de agua
destilada. Para realizar la variación de pH se prepararon buffers citrato de sodio/ácido cítrico de
pH (3-6), esta mezcla se aforó a 100 ml con el medio nutritivo Czapek’s preparado
anteriormente; y se ajustó la solución al pH final deseado utilizando HCl (Ácido clorhídrico) o
NaOH (Hidróxido de sodio).
Los medios de fermentación en sustrato sólido se prepararon en matraces Erlenmeyer de 300
ml, en los que se colocaron 25 g de cascarilla de cacao o de cáscara de naranja tratada, para ello
se empleó la balanza analítica (Boeco Germany). A cada uno de los matraces se añadieron 25 ml
30
del medio nutritivo con sus respectivos pH y se llevó a esterilización durante 15 minutos a una
temperatura de 121°C en una autoclave (All-American). Una vez esterilizados los medios de
cultivos se realizó la inoculación empleando 1ml tal como se detalló en el literal 3.6.1.
3.6.4. Fermentación
Se efectuó la fermentación en estado sólido empleando las siguientes variables detalladas en
la Tabla 10:
Tabla 10 Variables de fermentación
Factor Niveles
Temperatura de fermentación (°C) 25 30 35 40
pH de fermentación 3 4 5 6
Tiempo de fermentación 14 días
Esporas 1x107
La fermentación se llevó a cabo en una incubadora (VWR) variando las temperaturas como
indica en la Tabla 10, manteniendo un tiempo constante de 14 días para cada matraz con los
diferentes pH y con una inoculación inicial de 107 cells/ml. Para la realización de este
procedimiento se consideró el método indicado en Ibrahim et al., (2013). El proceso de
fermentación se efectuó por triplicado para cada variable en análisis, generando un total de 96
muestras.
3.6.5. Extracción de la enzima
Concluida la fermentación, se extrajo la enzima añadiendo 100 ml de agua destilada a cada
uno de los matraces que contienen la muestra fermentada. Con ayuda de espátulas se retiró las
muestras de los matraces y se los almacenó en fundas herméticas para su posterior
homogenización en un homogeneizador Stomacher – 400 a 230 rpm durante 1 minuto a
31
temperatura ambiente. Empleando una prensa francesa se obtuvo el extracto, el cual se vertió en
tubos de ensayo de 10 ml y se centrifugó (modelo Hettich Universal II) a 5000 rpm por un
tiempo de 10 min a temperatura ambiente con la finalidad de separar el extracto de impurezas.
Concluida la centrifugación, el sobrenadante se filtró al vacío utilizando un papel filtro N°1 y se
extrajo el ECE en recipientes herméticos para su almacenado a 4 °C. (Pandey A., 1995). Por
otro lado, el sólido obtenido se analizó para determinar cantidad de biomasa en peso seco.
3.6.6. Actividad enzimática de la poligalacturonasa
Para determinar la actividad enzimática de la enzima poligalacturonasa se partió empleando
la metodología del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) modificado descrita en Bernfeld (1955),
para lo cual es necesario preparar la solución del reactivo de DNS, el mismo que está compuesto
de la siguiente manera: 0.5 g de DNS, 15 g de C4H4KNaO6·4H2O (Tartrato de sodio y potasio
tetrahidratado) y 0.8 g de NaOH (Hidróxido de sodio), se preparó en 100 ml de agua destilada.
Se emplea la curva estándar utilizando ácido galacturónico, lo cual es esencial para la
determinación de la concentración de azúcares reductores para la enzima poligalacturonasa; las
concentraciones empleadas en este método se tomaron del trabajo de Vermelho & Couri, (2013);
Se aplicó el proceso para la elaboración de la curva patrón de ácido galacturónico descrito en
Mendoza & Martínez, (2018).
 Se utiliza ácido galacturónico al 10 µmol/ml como solución madre: 48 mg de ácido
galacturónico en 25 ml de agua destilada.
 De esta solución, se preparan diferentes disoluciones en viales de 10 ml para obtener
concentraciones desde 1-0.2 mg/ml; para realizar las disoluciones, se utilizó un buffer de
acetato/ácido acético pH 4.5 para lograr dichas concentraciones.
32
 A cada uno de los viales que contienen las disoluciones se les agrega 1 ml del reactivo
DNS.
 Se someten las muestran en baño maría a temperatura de 100°C durante 5 minutos.
 Mediante baños de hielo y agua se detiene la reacción en las muestras, seguido de esto,
se adicionan 8 ml de agua destilada para cada vial.
 Se agitó levemente y se leyó en el espectrofotómetro UV-VSIBLE a longitud de onda de
540 nm.
El proceso con las cantidades utilizadas para la elaboración de la curva estándar de ácido
galacturónico se detalla en la Tabla 11. La gráfica de la curva estándar de ácido galacturónico
con su respectiva ecuación, se muestra en la Figura 6.
Tabla 11 Cantidades empleadas para curva de calibración de ácido galacturónico
Numero de tubos de ensayo 1 2 3 4 5 6

Volumen (µl)
extraído de la - 200 400 600 800 1000
Disolución madre
solución madre.
de ácido
galacturónico Buffer de
(10 µmol/ml) acetato/ácido
1000 800 600 400 200 -
acético pH 4.5
(µl)
Reactivo DNS (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Calentar en baño maría por 5 minutos a 100 °C.

Para detener la reacción se emplea baño de hielo
Cantidad de Agua destilada (ml) 8 8 8 8 8 8
Leer a 540 nm
33
Curva patron ácido galacturónico
1,6 y = 1,7905x - 0,3547
1,4 R² = 0,9922
1,2
Absorbancia
1
0,8
Absorbancia
0,6
Lineal (Absorbancia)
0,4
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentracion mg/ml
Figura 6 Curva estándar de ácido galacturónico

La aplicación del método 3,5 DNS tiene como función calcular la cantidad de azucares
reductores de una muestra, lo cual es indispensable al momento de poder determinar la actividad
enzimática de la poligalacturonasa, expresada en:
Actividad enzimática = UE/ml
Para cuantificar la actividad enzimática de cada una de las muestras, se tuvo que realizar
soluciones para blanco de reactivo (BR), blanco enzimático (BE) y mezcla de reacción (MR);
para la solución de este último se agregó 100 µl del ECE obtenido en 200 µl de ácido
poligalacturónico al 0,5% (p/v) preparado en un buffer acetato/ácido acético pH 4.5, posterior a
esto, se adicionó 200 µl de buffer acetato/ácido acético (0.2M) pH 4.5 y se llevó a incubación
durante 10 minutos a 37°C como se describe en Vermelho & Couri, (2013).
Finalizado el tiempo de incubación se agregó 500 µl de DNS y se calentó en agua hirviendo
las muestras por 5 minutos en baño maria. Para detener la reacción se sumergió las muestras en
baño de hielo por 1 min y se leyó en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 540nm
(Mendoza & Martínez, 2018).
34
En la Tabla 12, se describe las cantidades utilizadas para las soluciones de blancos y mezcla
de reacción.
Tabla 12 Cantidades utilizadas para ensayo de actividad enzimática.
BR BE MR
Extracto crudo enzimático
- 100 100
(ECE) (µl)
Agua destilada (µl) 500 - -
Ácido poligalacturónico
- 200 200
(0.2M) pH 4.5 (µl)
Buffer Acetato – Ácido Acético
- 200 200
(0.2M) pH 4.5 (µl)
Incubar 10 min. a 37 ° C
DNS (µl) 500 500
Calentar en baño de agua hervida a 100°C por
5 minutos. Para detener la reacción se emplea
baño de hielo
Leer a 540 nm
Los valores finales para poder cuantificar la absorbancia real de la mezcla de reacción se
obtendrán de la siguiente ecuación:
Absorbancia real MR = Abs MR – BE
Con los valores calculados se pudo determinar la actividad enzimática de cada una de las
muestras de producción por triplicado del ECE empleando la ecuación que se estableció en la
curva patrón de ácido galacturónico:
𝑦 = 1.7905𝑥 − 0.3547 𝑅 2 = 0.9922
Estos resultados fueron importantes para seleccionar la mejor condición de producción para
la enzima PG.
35
3.6.7. Cuantificación de proteínas
Al ECE producido se le cuantificó proteínas siguiendo las directrices descritas por el método
Bradford (Bradford, 1976), en el cual se hizo uso de las siguientes sustancias:
 Solución de albúmina de suero bovino (BSA) (4 mg/ml)
 Reactivo de Bradford
 Agua destilada
El proceso parte con la elaboración de una curva estándar utilizando BSA como patrón. Se
preparó una solución madre de 4 mg/ml y de ésta se realizaron diluciones para obtener
concentraciones de 2, 1, 0,5, 0,25 y 0,125 mg/ml. Las reacciones se llevaron a cabo tomando 500
µl de la solución de BSA (4 mg/ml), a la que se le agregó 500 µl de agua para obtener una
solución de BSA (2 mg/ml) y así sucesivamente hasta llegar a una solución de 0,125 mg/ml. Una
vez obtenidas las concentraciones requeridas se tomaron 50 µl de cada solución y se colocaron
en viales de 5 ml, posteriormente se agregó 1 ml del reactivo de Bradford, se agitó levemente y
se dejó incubando en oscuridad por 20 minutos a temperatura ambiente.
Concluido el tiempo de incubación, se pudo observar el cambio de coloración en las
muestras y se realizó la lectura de concentración de proteínas en el espectrofotómetro (DR 5000
– HACH) con una longitud de onda de 595 nm. Los datos obtenidos se ingresaron en Excel y se
graficó la curva patrón de BSA detallando los valores de absorbancia frente a los valores de
concentración (mg/ml).
El proceso con los valores utilizados para la elaboración de la curva estándar de BSA se
detalla en la Tabla 13. La gráfica de la curva estándar de albúmina de suero bovino BSA con su
respectiva ecuación, se muestra en la Figura 7.
36
Tabla 13 Curva de calibración de BSA para determinación de proteínas.
Numero de tubos de ensayo 1 2 3 4 5 6

Cantidad final de BSA (mg) 4 2 1 0,5 0,25 0,125
Volumen (µl) extraída de las
500 250 125 62.5 31.25
disoluciones de BSA.
Cantidad de Agua (µl) 500 500 750 875 937.5 968.75
De cada una de las soluciones se retira 50 µl y se le agrégalo
siguiente:
Reactivo Bradford (ml) 1 1 1 1 1 1
Concluido esto se deja en incubación a temperatura ambiente
por 20 minutos en oscuridad.
Leer a 595 nm
Curva Estándar BSA

0,45
0,4
y = 0,1052x + 0,0048
0,35
R² = 0,9823
Absorbancia
0,3
0,25
0,2 absorbancia
0,15 Lineal (absorbancia )
0,1
0,05
0
0 1 2 3 4 5
Concentracion (mg/mL)
Figura 7 Curva estándar de albúmina de suero bovino BSA para cuantificación de proteínas.
La obtención de la concentración de proteínas de las muestras del ECE se realizó de acuerdo
a las directrices de (Caprette, 2015). Para el proceso se utilizaron viales de 5 ml, en el cual se
requirió preparar un blanco de reacción que está compuesto de 50 µl de agua destilada y 1 ml de
37
reactivo de Bradford; por otro lado se preparó las soluciones de las muestras, se tomaron 50 µl
del extracto crudo enzimático y 1 ml de reactivo de Bradford, se agita levemente para ambos
casos; tanto para el blanco de reacción como las muestras se dejó incubar durante 20 minutos en
oscuridad a temperatura ambiente.
Concluido el tiempo de incubación, se puede observar el cambio de coloración en las
muestras, tiende a ser color azulejo en caso de que exista proteína; para la lectura de
concentración de proteína se utilizó el espectrofotómetro a 595 nm.
El proceso con los valores utilizados para obtener los datos de absorbancia de las muestras
con extracto crudo enzimático se detalla en la Tabla 14.
Tabla 14 Cantidades empleadas de extracto crudo enzimático, agua y reactivo de Bradford
Sustancia o reactivo Blanco de reacción Muestra

Cantidad de agua (µl) 50 -
Extracto crudo enzimático - 50
Reactivo de Bradford (µl) 1000 1000
Incubar en oscuridad durante 20 min a temperatura ambiente.
Leer a 595 nm
Obtenido los valores de absorbancia de las muestras con el ECE, para poder determinar la
concentración de proteínas, se utilizó la ecuación que se estableció en la curva estándar de
albúmina de suero bovino (BSA), teniendo:
𝑦 = 0.1052𝑥 + 0.0048 𝑅 2 = 0.9823
Dónde:
y = Concentración de proteínas (mg/ml)
x = Absorbancia (595 nm)
38
3.6.8. Optimización de actividad enzimática
Se determinaron las condiciones óptimas de actividad enzimática tomando como referencia
los parámetros descritos en el trabajo de Sathiyaraj et al., (2001); para la mezcla de reacción se
siguió la metodología detallada en el punto 3.6.6, en este caso se varían las condiciones de
temperatura y tiempo de incubación de la reacción, los cuales se muestran en la Tabla 15.
3.6.8.1. Tiempo de incubación óptimo
Para la estimación de tiempo óptimo se utilizó valores que oscilan entre 10 – 90 minutos.
3.6.8.2. Temperatura de incubación óptima
La reacción de la enzima se llevó a cabo a diferentes temperaturas que varían en forma
ascendente de 30 – 45 °C
Tabla 15 Valores empleados en la optimización de actividad enzimática.
Tiempo Temperatura
(min) (°C)
10 30
30 37
60 45
90
3.6.9. Determinación de la estabilidad operacional
De los resultados obtenidos en la actividad enzimática, se escogió la muestra que presenta
mejores resultados, esto para ambos sustratos, los cuales se sometieron a diferentes variables de
tiempo y temperatura previa a la reacción enzimática. La metodología para realizar estabilidad
operacional consistió en colocar 1 ml de la enzima PG obtenida de cascarilla de cacao y cáscara
de naranja en tubos de ensayo de 10 ml por separado, junto con 2 ml de buffer acetato-ácido
39
acético (0,2M) pH 4,5, sometiendo estos a las condiciones descritas en la Tabla 8. Para el resto
del proceso se siguió el mismo protocolo descrito en el literal 3.6.6. Con la modificación en la
temperatura óptima de reacción, determinada en el punto 3.6.8.2
Los resultados de estabilidad operacional fueron analizados para determinar las condiciones
extremas a las cuales la enzima producida aún mantiene su actividad.
3.6.10. Determinación de biomasa en peso seco
El sólido obtenido en la extracción de la enzima descrita en el literal 3.6.5, se secó a 80°C y se
pesó cada 40 min hasta alcanzar un peso constante aplicando la metodología descrita de Swift
(Swif, M. J., 1973). El método gravimétrico es el seleccionado para poder determinar la biomasa
con respecto al peso seco, la cual se mide en unidad de volumen.
Para obtener los valores se empleó la siguiente formula:
(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑣𝑖𝑑𝑟𝑖𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑜𝑗 + 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑖𝑑𝑟𝑖𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑜𝑗)

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Con los datos obtenidos de biomasa representados en peso seco (g/L), se determinó el
coeficiente de rendimiento de producto con relación a la biomasa (Y), la cual se calcula
utilizando la siguiente formula:
𝑈𝐸
𝑃 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 ( 𝐿 )
𝑌 = 𝑔
𝑋 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 ( 𝐿 )
40
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
4.1 Resultados
4.1.1 Preparación de sustratos
En el tratamiento de las materias primas, cascarilla de cacao y de cáscara naranja, luego de
analizar los pesos finales obtenidos después de las operaciones de secado, molienda y tamizado
se pudo obtener los rendimientos de cada sustrato utilizado, aplicando la siguiente fórmula:
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 (𝐾𝑔)

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥 100
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝐾𝑔)
Tabla 16 Pesos de las materias primas
Peso previo a el tratamiento Peso posterior a el

Sustrato
(Kg) tratamiento (Kg)
Cascarilla de cacao 3.37 2.4

Cáscara de naranja 3.89 2.5
Cascarilla de cacao
2.4 𝐾𝑔
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥 100 = 71,21%
3.37 𝐾𝑔
Cáscara de naranja
2.5 𝐾𝑔
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 𝑥 100 = 64.26 %
3.89 𝐾𝑔
El rendimiento que tuvieron las materias primas posterior a los tratamientos antes descritos
para cascarilla de cacao y cáscara de naranja fueron de 71,21% y 64,26% respectivamente; se
aprecia de la misma manera disminución en el peso de las materias primas antes mencionadas.
41
Figura 8 Cascarilla de cacao tratada.
Figura 9 Cáscara de naranja tratada.
4.1.2 Fermentación del sustrato en estado sólido empleando Aspergillus niger.
Aplicando la metodología descrita en el capítulo anterior se logró realizar la fermentación en
en estado sólido empleando Aspergillus niger. En la Figura 10 se puede observar el biorreactor
con el sustrato sólido y el hongo A. niger con su característica apariencia. Durante la
fermentación se observó a simple vista el crecimiento del hongo en la superficie del sustrato a
42
partir del día 7 de la fermentación. La coloración del hongo al séptimo día fue blanca, a partir de
allí adquirió un tono oscuro. Al término de la fermentación se observó que el hongo tenía aspecto
de una tela gamuzada de color gris. Esto indica que ambos sustratos propician el crecimiento del
hongo a temperatura y pH específicos.
Figura 10 Crecimiento de hongos en los biorreactores en la fase de fermentación.
4.1.3 Determinación de actividad enzimática
Se tabularon los datos y se aplicaron las fórmulas correspondientes para poder graficar y
determinar la actividad enzimática con las diferentes condiciones de producción. Se puede
observar de acuerdo a la Figura 11, que los mejores niveles de producción, basados en actividad
enzimática obtenidos para cascarilla de cacao y cáscara de naranja, fueron de 0.99 (UE/mL) y
1.24 (UE/mL) respectivamente. Los datos antes mencionados disminuyeron según el aumento de
temperaturas como se describe en el estudio screening and optimización of pectin lyase and
polygalacturonase activity from ginseng pathogen cylindrocarpon destructans realizado por
Sathiyaraj et al., (2011) en el cual, reporta que a partir de una temperatura de 37°C, la actividad
enzimática disminuye considerablemente. Comparando los resultados de la actividad enzimática
de cascarilla de cacao y cáscara de naranja se puede determinar que las mejores condiciones de
producción son de 30 °C a un pH 3 y 14 días, y de 40 °C a un pH 4 y 14 días, respectivamente.
43
Actividad enzimática de PG de cascarilla de cacao y cáscara
de naranja
1,6
Actividad enzimática UE/ml
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
3 4 5 6
pH
25 °C 30 °C 35°C 40°C 25°C 30 °C 35 C 40 °C
Figura 11 Actividad enzimática de PG de cascarilla de cacao y cáscara de naranja.

*Barras grises: cascarilla de cacao
*Barras café: cáscara de naranja
En un trabajo realizado en SSVPS’s Lk. Dr. P. R. Ghogrey Science College, en el
departamento de microbiología, realizado por Patil et al., (2011), se describen los parámetros
utilizados para la elaboración y purificación de poligalacturonasa usando como microorganismo
Paecilomyces variotii NFCCI 1769, según se menciona que los rangos más óptimos para la
producción de enzima PG fueron a temperatura de 30- 45 °C y pH de 4-5; comparando con los
resultados obtenidos en nuestro trabajo, los mejores datos de actividad enzimática de producción
de PG para ambos sustratos (0.87 UE/ml en cascarilla de cacao y 1.248 UE/ml en cáscara de
naranja), fueron obtenidos en los rangos descritos en Patil et al., (2011), sin embargo se puede
apreciar que usando como sustrato la cascarilla de cacao tiene una buena respuesta (0.988
UE/ml) a pH 3, como se describe en Thakur, (2010).
44
Un estudio realizado en la Universidad Himalachal Pradesh, en el departamento de
Biotecnología, describe la producción, purificación y caracterización de poligalacturonasa
mediante Mucor circinelloides ITCC 6025, (Thakur et al., 2010) en el que se obtuvo una
actividad enzimática de 9.2 (μmol mL−1min−1) utilizando éster metílico de pectina (1% p / v) y
una combinación de hidrolizado de caseína (0.1% p / v) y extracto de levadura (0.1 % p / v), los
parámetros de producción de 48 h a 30 ° C, respecto a la temperatura empleando ácido
poligalacturónico, en el presente trabajo de titulación se observa que para cascarilla de cacao la
condición más óptima es a 30 °C, mientras que para cáscara de naranja es 40 °C, a su vez se
observa que a pH 6, la producción de PG disminuye considerablemente.
4.1.4 Cuantificación de proteínas determinada en la producción de la enzima PG
Como se aprecia en la Figura 12, los mayores valores de concentraciones de proteínas para la
cascarilla de cacao fueron de 0.032 μg/ml, mientas que la de cáscara de naranja fue de 0,036
μg/ml; ambos a un pH 5; en un rango de pH 5.0- 6.0 los valores de concentración de proteínas
aumentan para ambos sustratos, al aumentar la temperatura. Comparando los resultados de
proteínas y de actividad enzimática obtenidos, se aprecia que no necesariamente un alto nivel de
proteínas es un indicativo de producción de la enzima en PG con alta actividad enzimática, esto
indica que durante la producción se pueden generar diferentes tipos de proteínas en el ECE que
no necesariamente es la PG.
45
Concentración de proteinas de PG de cascarilla de cacao y
cáscara de naranja
Concentración de proteínas μg/ml
0,04
0,03
0,02
0,01
0
3 4 5 6
pH
25°C 30°C 35°C 40°C 25°C 30°C 35°C 40°C
Figura 12 Concentración de proteínas en la producción de PG de cascarilla de cacao y cáscara

de naranja.
4.1.4. Optimización de actividad enzimática
En el estudio de Thakur et al., (2010), se detalla que, posterior a la purificación la enzima
mostró actividad máxima en presencia de ácido poligalacturónico (0.1% p / v) a pH 5.5 y 42 ° C,
siendo esta de 3.8 (U/ml). Mientras que en nuestro estudio se obtuvo valores de actividad de 4.20
y 4.47 UE/mL para cascarilla de cacao y cáscara de naranja respectivamente.
En el trabajo de Silva, (2002), se describe que las condiciones óptimas de pH 4,5 y
temperatura de 28- 30 ° C para la reacción de PG empleando Penicillium viridicatum, se
demuestra que para la reacción de enzima PG empleando cascarilla de cacao como sustrato y A
.niger a esas condiciones de incubación, la poligalacturonasa obtuvo el pico más alto como
demuestra la Figura 13.
46
El período de incubación de 60 minutos aplicado al tiempo de reacción, hizo que aumentara la
actividad de PG, a temperaturas de (30 y 37 ° C) lo que demostró ser la naturaleza de estas
enzimas. La capacidad hidrolítica de la enzima disminuyo considerablemente con el aumento de
temperatura y tiempo.
Optimización de la actividad enzimática de PG de cascarilla

de cacao y cáscara de naranja
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
30°C 37°C 45°C
Temperatura
10 min 30 min 60 min 90 min 10 min 30 min 60 min 90 min
Figura 13 Actividad enzimática bajo las diferentes condiciones de reacción.

4.1.5 Estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa
Para conocer cuan termoestable resultaba ser la PG producida, se sometió a diferentes
condiciones de temperatura y tiempo a la enzima previo a la reacción enzimática, haciendo una
pre-incubación del ECE con buffer acetato/ácido acético (0,2M) pH 4.5; en la cual se pudo
apreciar que a un tiempo de 60 minutos y 35 °C la enzima tuvo mayor actividad para ambos
sustratos, tal como se muestra en la Figura 14, en los que se alcanzaron valores de 1,04 UE/mL
para cascarilla de cacao y 1,47 UE/mL para cáscara de naranja.
47
Se evidencia que al aumentar la temperatura en la incubación esto conduce a una ligera
variación en la actividad de la enzima PG, al aumentar 20 grados a la temperatura óptima de
reacción existe una disminución en un 52,88% en cascarilla de cacao y 28,79% en la cáscara de
naranja, además esto nos indica que la enzima no es termoestable para ninguno de los dos
sustratos.
Estabilidad operacional de PG de cascarilla de cacao y cáscara

de naranja
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
35 °C 55 °C 75 °C
Temperatura
30 min 60 min 90 min 30 min 60 min 90 min

Figura 14 Estabilidad operacional de la enzima poligalacturonasa.
4.1.6 Rendimiento de biomasa.
Posterior a la extracción del ECE se realizó la operación de secado de la biomasa, obteniendo
valores de biomasa (peso seco), valores con los cuales se pudo calcular el rendimiento con
respecto a la actividad enzimática obtenida. En la Figura 15, se puede observar que el valor más
alto de rendimiento es de 7,681 UE/g de biomasa en cascarilla de cacao a las condiciones de pH
3 y temperatura de 30ᵒC, por otro lado, el valor máximo de rendimiento para sustrato de cáscara
48
de naranja fue de 7.62 UE/g de biomasa, a condiciones de temperatura de 35 ᵒC y un pH 5.
Dentro del pH para un buen rendimiento de biomasa se dan en rangos de (3- 5), mientras que en
pH 6, existe una disminución considerable del 43,30%. Las condiciones de temperatura están en
rango de (30- 35 ᵒC).
Rendimiento de cascarilla de cacao y cáscara de naranja

9
Rendimiento UE/g biomasa
8
7
6
5
4
3
2
1
0
3 4 5 6
pH
25°C 30°C 35°C 40°C 25°C 30°C 35°C 40°C
Figura 15 Rendimiento de biomasa.

49
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Posterior a los procesos de adecuación que se dieron a las materias primas, se obtuvo como
resultado el rendimiento de las mismas, siendo en 71,21% y 64,26%, para cascarilla de cacao y la
cáscara de naranja. Por este lado se concluye que el residuo agroindustrial de cascarilla de cacao
tiene un mayor rendimiento y representa un candidato para la producción de PG, con respecto a
la cáscara de naranja.
La cascarilla de cacao propicia el crecimiento del hongo Aspergillus niger, debido a la
apariencia física que presenta transcurridos los 7 días de fermentación, donde se observó que el
sustrato se tornaba de color blanco por la presencia del hongo. Actualmente no existen estudios
que utilicen este residuo como sustrato, siendo este trabajo pionero en implementar cascarilla de
cacao a la producción de enzima PG.
La actividad enzimática de la poligalacturonasa empleando cascarilla de cacao CCN-51 como
sustrato fue de 0.99 (UE/mL), sometida a una temperatura de 30°C, pH 3 y 14 días de
fermentación, el método de DNS fue el seleccionado para realizar el proceso. Mientras que la
concentración de proteínas fue de 0.032 μg/ml a una temperatura de 30°C, pH 5; se aplicó el
método de Bradford para realizar los ensayos
Aplicando las condiciones óptimas con respecto a la actividad enzimática para la producción
de la enzima poligalacturonasa se pudo obtener 4,20 UE/ml, la cual fue sometida a una
temperatura de 30ᵒC, pH 3 y tiempo de 30 minutos.
La cascarilla de cacao utilizada como sustrato en comparación con respecto a cáscara de
naranja, poseen una actividad enzimática de 0.99 (UE/mL) y 1.24 (UE/mL) respectivamente;
50
posterior a la optimización de la actividad enzimática existió un aumento considerable de 4.20
(UE/mL) y 4.47 (UE/mL), al ser sometido el ECE a condiciones más optimas de reacción, por lo
que ambos sustratos son óptimos para la producción de enzima poligalacturonasa en
fermentación en estado sólido empleando Aspergillus niger.
Durante la estabilidad operacional se pudo obtener 1,04 UE/mL de actividad enzimática, a
una temperatura de 60ᵒC y 30 minutos. Se puede observar que, a medida que la temperatura va
en aumento, la actividad enzimática de ambos sustratos va disminuyendo considerablemente.
51
5.2. Recomendaciones
Realizar diversos estudios para poder dar paso a una producción a nivel de planta piloto de la
enzima poligalacturonasa y su aprovechamiento de las mismas en las industrias alimenticias,
farmacéuticas y textiles.
Para una producción más óptima de la enzima poligalacturonasa se debe llevar a cabo un
proceso de purificación de la enzima, con la finalidad que exista una mejor lectura de los análisis
requeridos, y a su vez identificar si las proteínas contenidas dentro del ECE son propiamente de
la enzima o si existen de otros tipos.
Realizar diversas experimentaciones con diferentes residuos agroindustriales a partir de este
estudio, para la utilización de estos desechos y darle un valor agregado a los mismos.
52
BIBLIOGRAFÍA
Abdullah, R., Farooq, I., Kaleem, A., Iqtedar, M., & Iftikhar, T. (2018). Pectinase production
from Aspergillus Niger IBT-7 using solid state fermentation. Bangladesh Journal of
Botany, 47(3), 473–478.
Alcalá, L., Muñoz, P., Peláez, T., & Bouza, E. (n.d.). Aspergillus y aspergilosis. Retrieved from
https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/micologia/asperguillus.pdf
Alexander, J., Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, J., Dogliotti, E., Domenico, A. Di, …
Peteghem, C. Van. (2008). Theobromine as undesirable substances in animal feed1
Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain (Question N° EFSA-Q-
2005-223). The EFSA Journal, (725), 1–55.
Anand, G., Yadav, S., & Yadav, D. (2016). Purification and characterization of
polygalacturonase from Aspergillus fumigatus MTCC 2584 and elucidating its application
in retting of Crotalaria juncea fiber. 3 Biotech, 6(2), 201. https://doi.org/10.1007/s13205-
016-0517-4
Anecacao. (2018). ANECACAO: tradición e innovación. nº 17, p. 16, 2018.
Bernfeld, P. (1955). Amylases, alpha and beta. Methods in Enzymology I, I(540), 149–158.
https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5
Bhatia, S. (2018). Introduction to enzymes and their applications. In Introduction to
Pharmaceutical Biotechnology, Volume 2. IOP Publishing. https://doi.org/10.1088/978-0-
7503-1302-5ch1
53
Birgisson, H., Delgado, O., García Arroyo, L., Hatti-Kaul, R., & Mattiasson, B. (2003). Cold-
adapted yeasts as producers of cold-active polygalacturonases. Extremophiles, 7(3), 185–
193. https://doi.org/10.1007/s00792-002-0310-7
Bradford, M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding, 72, 248–254.
https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
Caprette, D. (2015). Protein determination by the Bradford method. Retrieved September 22,
2019, from https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/bradford.html
Carrillo, L. (n.d.). Los hongos de los alimentos y forrajes, 1. Retrieved from
http://www.microbiota.com.ar/sites/default/files/4aspergilos.pdf
Catalán, M. (1964). Extración de sustancias p;ecticas de la remolacha. Factores que intervienen
en la calidad del producto obtenido. Retrieved from
https://digital.csic.es/bitstream/10261/36066/1/AnEEAD7-3-4-Catalan-33-50.pdf
Cedeño, S. (2011). La revolución del cacao ccn – 51 en el Ecuador, 20–22. Retrieved from
http://appcacao.org/descargas/seminario2011/Revoluci%F3n del Cacao CCN-51 en Ecuador
2011 Marzo.pdf
Chafla, A. L., Rodríguez, Z., Boucourt, R., & Torres, V. (2016). Bromatological characterization
of cocoa shell (Theobroma cacao), from seven cantons of the Amazonia, Ecuador
Caracterización bromatológica de la cáscara de cacao (Theobroma cacao), procedente de
54
siete cantones de la Amazonia, Ecuador. Cuban Journal of Agricultural Science, 50(2), 245–252.
Chang, A. C. C., Tu, Y. H., Huang, M. H., Lay, C. H., & Lin, C. Y. (2011). Hydrogen production
by the anaerobic fermentation from acid hydrolyzed rice straw hydrolysate. International
Journal of Hydrogen Energy, 36(21), 14280–14288.
https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2011.04.142
Díaz, S., & Pinargote, M. (2012). Análisis de las Características Organolépticas del Chocolate a
partir de Cacao CCN51 Tratado Enzimáticamente y Tostado a Diferentes Temperaturas.,
26–27. Retrieved from
http://www.dspace.espol.edu.ec/xmlui/bitstream/handle/123456789/31050/D-
79697.pdf?sequence=-1&isAllowed=y
García, A. R., Balbín, M. I., Cabrera, J. C., & Castelvi, A. (2002). Actividad
endopoligalacturonasa en un preparado de una levadura aislada de la pulpa de cafe.
Garriga, M., Almaraz, M., & Marchiaro, A. (2017). Determination of reducing sugars in extracts
of Undaria pinnatifida (harvey) algae by UV-visible spectrophotometry (DNS method), 3,
173–179. Retrieved from http://fundacioniai.org/actas/Actas3/Actas3.19.pdf
Gomes, J., Zeni, J., Cence, K., Toniazzo, G., Treichel, H., & Valduga, E. (2011). Evaluation of
production and characterization of polygalacturonase by Aspergillus niger ATCC 9642.
Food and Bioproducts Processing, 89(4), 281–287.
https://doi.org/10.1016/j.fbp.2010.10.002
55
Gummadi, S. N., & Panda, T. (2003). Purification and biochemical properties of microbial
pectinases—a review. Process Biochemistry, 38(7), 987–996.
https://doi.org/10.1016/S0032-9592(02)00203-0
Ibrahim, D., Sheh Hong, L., Salikin, N., Ahmad, R., & Weloosamy, H. (2013). Pomelo peels as
alternative substrate for extracellular pectinase production by Aspergillus niger HFM-8.
Malaysian Journal of Microbiology, 9(4), 308–316.
https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
Kruger, N. J. (2009). The Bradford Method For Protein Quantitation (pp. 17–24). Humana Press,
Totowa, NJ. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-198-7_4
Lanka, S. (2015). Solid state fermentation for microbial products : A review Ranganathan
Kapilan, 7, 21–25. Retrieved from
https://pdfs.semanticscholar.org/4bd9/27943bb8878b36fcdc32449858e8f37f9f99.pdf
Lopez, C., Herrera, S., Medina, V., & Zuluaga, A. (2006). Producción de ácido cítrico con
Aspergillus niger NRRL 2270 a partir de suero de leche. Dyna, 73(150), 39–57.
López, N., & Robles, J. (2019). Producción de β -fructofuranosidasa por aspergillus niger a partir
del mucílago del cacao ccn 51 como fuente de carbono - Universidad de Guayaquil trabajo
de titulación previo a la obtención del título de ingeniero químico.
Mamani Crisṕin, P. L., Ruiz Caro, R., & Veiga, M. D. (2012). Pectina: Usos farmaceúticos y
aplicaciones terapéuticas. Anales de La Real Academia Nacional de Farmacia, 78(1), 82–
97.
56
Mendoza, E., & Martínez, M. (2018). “Producción de alfa amilasa por fermentación en estado
sólido de residuos agroindustriales (cáscaras de banano) utilizando bacillus subtilis.
Universidad de Guayaquil. Retrieved from
http://repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/33219/1/401-1324 - Fermentac en estado solido
residuos agroindustr.pdf
Murillo, I. (2009). Evaluacion de 2 dietas experimentales niveles de cascarilla de cacao
(Theobroma cacao l.) en las fases de crecimiento y acabado de cuyes (Cavia porcellus L.)
de raza andina, 2. Retrieved from
https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/2393/1/4733.pdf
Nadumane, V. K., Venkatachalam, P., & Gajaraj, B. (2016). Aspergillus Applications in Cancer
Research. In New and Future Developments in Microbial Biotechnology and
Bioengineering (pp. 243–255). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63505-
1.00020-8
Ocampo, I., Gonzalez-Brambila, M., & Lopez-Isunza, F. (2013). An analysis of the metabolism
of Aspergillus niger growing over a solid substrate, 12(1), 41–56. Retrieved from
http://www.scielo.org.mx/pdf/rmiq/v12n1/v12n1a5.pdf
Pandey, A., Ashakumary, L., & Selvakumar, P. (1995). Copra waste - A novel substrate for
solid-state fermentation. Bioresource Technology, 51(2-3), 217–220.
https://doi.org/10.1016/0960-8524(94)00129-O
Patil, N. P., Patil, K. P., Chaudhari, B. L., & Chincholkar, S. B. (2011). Production, Purification
of Exo-Polygalacturonase from Soil Isolate Paecilomyces variotii NFCCI 1769 and Its
57
Application. Indian Journal of Microbiology, 52(2), 240–246.
https://doi.org/10.1007/s12088-011-0162-x
Pildain, M. B. (2006). Caracterización fenotípica y molecular de Aspergillus sección Flavi.
Estudio de la genética poblacional y capacidad toxigénica de Aspergillus flavus en maní,
218.
Restrepo, A., Rodríguez, E., & Manjarrés, K. (2011). Cortezas de naranja comestibles: una
aproximación al desarrollo de productos con valor agregado a partir de residuos
agroindustriales. Producción + Limpia, 6(2), 47–57.
https://doi.org/10.1134/S1560354712020013
Reyes, Y. (2013). Introduccion pectinasas. Retrieved from
https://www.academia.edu/4215626/Introduccion_pectinasas
Robinson, P. K. (2015). Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays In
Biochemistry, 59(0), 1–41. https://doi.org/10.1042/bse0590001
Rodríguez Gàmez, O., & Serrat Díaz, M. (2008). Poligalacturonasas de levaduras: un producto
biotecnológico de grandes potencialidades (Vol. XXVIII).
Sadh, P. K., Duhan, S., & Duhan, J. S. (2018). Agro-industrial wastes and their utilization using
solid state fermentation: a review. Bioresources and Bioprocessing, 5(1), 1.
https://doi.org/10.1186/s40643-017-0187-z
Sathiyaraj, G., Srinivasan, S., Kim, H. Bin, Subramaniyam, S., Lee, O. R., Kim, Y. J., & Yang,
D. C. (2011). Screening and optimization of pectin lyase and polygalacturonase activity
58
from ginseng pathogen cylindrocarpon destructans. Brazilian Journal of Microbiology,
42(2), 794–806. https://doi.org/10.1590/S1517-83822011000200048
Schuster, E., Dunn-Coleman, N., Frisvad, J., & Dijck, P. (2002). On the safety of Aspergillus
niger - a review. Applied Microbiology and Biotechnology, 59(4–5), 426–435.
https://doi.org/10.1007/s00253-002-1032-6
Suarez, D. L., & Orozco, D. M. (2014). Obtención y caracterización de pectina a partir de la
cascarilla de cacao del theobroma cacao l. subproducto de una industria chocolatera
nacional. Universidad Tecnológica de Pereira - Facultad de Tecnología - Escuela de
Química, 1, 1–102. https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
Swif, M. J. (1973). The estimation of mycelia biomass by the determination of the hexosamine
content of wood tissue decayed by fungi. Soil Biology and Biochemistry 5, 321-332.
https://doi.org/10.1016/0038-0717(73)90080-1
Tapia, C. (2015). Aprovechamiento de residuos agroindustriales, cascarilla de cacao (Theobroma
cacao L.) Variedad arriba y ccn51 para la elaboración de una infusión, 2015, 20–21.
Retrieved from http://repositorio.uta.edu.ec/bitstream/123456789/11981/1/AL 574.pdf
Thakur, A., Pahwa, R., Singh, S., & Gupta, R. (2010). Production, purification, and
characterization of polygalacturonase from mucor circinelloides ITCC 6025. Enzyme
Research, 2010. https://doi.org/10.4061/2010/170549
59
Tucker, G. (2004). Polygalacturonase - an overview | ScienceDirect Topics. Retrieved September
22, 2019, from https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-
sciences/polygalacturonase
United States Environmental Protection Agency (1997). Retrieved from
https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-09/documents/fra006.pdf
Universidad King Saud (n.d.). Retrieved from
http://fac.ksu.edu.sa/sites/default/files/445_lab_2.pdf
Upiig. (2016). Bradford Y DNS - Enzinetic UPIIG. Retrieved September 22, 2019, from
https://sites.google.com/site/enzineticupiig/bradford-y-dns
Vasquez, A. (2009). Caracterización Biológica del hongo Aspergillus sp encontrada en las
semillas de Caesalpinia coriaria (nacascol). Retrieved from
https://sic.ues.edu.sv/storage/app/media/drvasquez/ponencias/EL SALVADOR
PONENCIA CIC UES 2009.pdf
Vasquez, R, Ruesga, L, D'addosio, R, Páez, G, & Marín, M. (2008). Extracción de pectina a
partir de la cáscara de plátano (Musa AAB, subgrupo plátano) clon Hartón. Revista de la
Facultad de Agronomía, 25(2), 318-333. Recuperado en 14 de febrero de 2020, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0378-
78182008000200008&lng=es&tlng=es.
Vermelho, A. B., & Couri, S. (2013). Methods to Determine Enzymatic Activity. Methods to
Determine Enzymatic Activity. https://doi.org/10.2174/97816080530011130101
60
Villalpando, J., Jubert, S., Cordova, J., Ibarra, I., Amaya, L., Mateos, J. C., … Herrera, E. (2010).
Producción de pectinasas por fermentación en estado sólido utilizando residuos
agroindustriales. Journal of Chemical Information and Modeling, 53(9), 1689–1699.
https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
Villalpando, J., Jaubert, S., Cordova, J., Amaya, L., Mateos, J. ., Díaz, D., … Herrera, E. (2010).
Producción de pectinasas por fermentación en estado sólido utilizando residuos
agroindustriales, 2593–2595. Retrieved from
https://ciatej.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1023/253/1/Producción de
pectinasas por fermentación en estado.pdf
Worthington Biochemical Corporation (n.d) Retrieved from http://www.worthington-
biochem.com/introbiochem/enzymes.pdf
Yusuf, M. (2017). Agro-Industrial Waste Materials and their Recycled Value-Added
Applications: Review. In Handbook of Ecomaterials (pp. 1–11). Cham: Springer
International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-319-48281-1_48-1
61
ANEXOS
Anexo 1.1 Preparación del sustrato
62
Anexo 1.2 Preparación del inóculo
63
Anexo 1.3 Preparación del medio de fermentación Czapek
64
Anexo 1.4 Fermentación
65
Anexo 1.5 Extracción de la enzima
Anexo 1.6 Actividad enzimática
66
Anexo 1.7 Cuantificación de proteínas
67

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A

PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN

ROMY DEYANIRA CHÓEZ CASIERRA

SEBASTIÁN RODRIGO PILCO TOMALÁ

DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN

ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSC

GUAYAQUIL, JUNIO 2020

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

TRABAJO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE:

PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR ASPERGILLUS NIGER A

PARTIR DE CASCARILLA DE CACAO CCN-51 EN FERMENTACIÓN EN

ROMY DEYANIRA CHÓEZ CASIERRA

SEBASTIÁN RODRIGO PILCO TOMALÁ

DIRECTOR DE PROYECTO DE TITULACIÓN

ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSC

GUAYAQUIL, JUNIO 2020

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

FICHA DE REGISTRO DE TESIS/TRABAJO DE GRADUACIÓN

CHÓEZ CASIERRA ROMY DEYANIRA

CONTACTO CON Teléfono: E-mail:

Guayaquil, junio de 2020

Envío a Ud. el Informe correspondiente a la tutoría realizada al Trabajo de Titulación:

• El trabajo es el resultado de una investigación.

Adicionalmente, se adjunta el certificado de porcentaje de similitud y la valoración del trabajo de

ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.

CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD

Se informa que el trabajo de titulación: PRODUCCIÓN DE POLIGALACTURONASA POR

ING. CECILIA UZCA SORNOZA, MSc.

Guayaquil, junio de 2020

CERTIFICACIÓN DEL TUTOR REVISOR

LICENCIA GRATUITA INTRANSFERIBLE Y NO EXCLUSIVA PARA EL USO NO

Chóez Casierra Romy Deyanira Pilco Tomalá Sebastián Rodrigo

*CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E

A mis hermanos por siempre estar conmigo.

Romy Deyanira Chóez Casierra

Dedicado especialmente a mis padres SANTIAGO PILCO RODRIGUEZ y VILMA TOMALÁ

triunfo, a mi familia y amigos quienes estuvieron conmigo apoyándome en el transcurso de mi

Sebastián Rodrigo Pilco Tomalá

pueda lograr mis metas, gracias por todo.

nos direccionó y apoyó en la realización de este trabajo de titulación.

experimental de este trabajo.

Romy Deyanira Chóez Casierra

para poder culminar con éxito la carrera.

con mis estudios.

superar diversas dificultades que se nos presentaba.

facilidades para poder desarrollar el trabajo de titulación en los laboratorios.

Sebastián Rodrigo Pilco Tomalá

REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA ..................................... III

Figura 1 Estructura química de la pectina ................................................................................... 11

Figura 2 Espectro IR de pectina extraída a partir de cascarilla de cacao a temperatura y tiempo

Figura 3 Espectro IR de pectina comercial obtenida de muestra de Manzana ............................ 18

Figura 4 Composición de Aspergillus ........................................................................................ 19

Figura 5 Fotografía microscópica del Aspergillus niger ............................................................. 20

Figura 6 Curva estándar de ácido galacturónico .......................................................................... 34

Figura 8 Cascarilla de cacao tratada. ........................................................................................... 42

Figura 9 Cáscara de naranja tratada. ............................................................................................ 42

Figura 10 Crecimiento de hongos en los biorreactores en la fase de fermentación..................... 43

Figura 11 Actividad enzimática de PG de cascarilla de cacao y cáscara de naranja ................... 44

Figura 12 Concentración de proteínas en la producción de PG de cascarilla de cacao y cáscara

Figura 13 Actividad enzimática bajo las diferentes condiciones de reacción. ............................ 47