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Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln Campo 4

Medicina Veterinaria Zootecnista

Reporte de prctica#6: Medicin de la actividad enzimtica.

Cintica de la enzima ureasa.

Equipo #2:

Ciriaco Solano Lina Elizabeth

Cruz Mrquez Salvador

Gonzlez Buenda Mara del Carmen

Luna de Alba Antonio

Vallejo Martnez Silvia

Laboratorio Bioqumica

Profesores:

Q.F.B. Juana Alicia Alquiciara Camacho

M.V.Z. Francisco Javier Cervantes Aguilar

M.V.Z. Silvia Leticia Bonilla Orozco

Grupo: 2201

Fecha de entrega: 9 abril 2013

1
INDICE PGINA

Resumen.3

Introduccin/Marco terico..4

Objetivos.7

Material y Metodologa.8

Resultados.10

Discusin14

Conclusin.14

Referencias15

2
RESUMEN

El pasado 2 de abril cumpliendo con el protocolo establecido por el Manual de


Practicas de Bioqumica para la Carrera de MVZ, llevamos a cabo la Practica
nmero 6, correspondiente a la Cintica de la Enzima Ureasa.

Bajo la supervisin de nuestro Profesor, elaboramos la experimentacin


estipulada, con un manejo adecuado del material que el laboratorio nos
proporcion. La prctica estaba comprendida por varios experimentos y debido a
la complejidad y el tiempo que se requiere para elaborarlos, el Profesor decidi
asignar un experimento diferente a cada equipo.

El equipo numero 1 realizo el experimento nmero uno que corresponde a la


determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de sustrato (en este
caso urea) sobre la velocidad de reaccin de la ureasa, cabe destacar que este
experimento es muy importante pues de ellos dependa el anlisis de los mas
resultados que posteriormente se explicaran en este trabajo.

En nuestro equipo, es decir el equipo nmero 2, realizamos el experimento


nmero dos, que corresponda a la determinacin del efecto de la variacin en la
concentracin de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reaccin de la misma, con
un establecimiento adecuado del experimento logramos cumplir con dicha
determinacin, aunque los valores que se arrojaron fueron poco comunes, ms
adelante abundaremos en ellos.

Al equipo 3 le toco llevar a cabo el experimento nmero tres, que corresponda a


la determinacin del efecto de la variacin de la temperatura sobre la velocidad de
la reaccin de la ureasa.

El equipo 4 se encarg de la determinacin del efecto de la variacin del pH del


medio sobre la velocidad de reaccin de la ureasa.

Habiendo realizado cada equipo su experimento, se obtuvieron resultados los


cuales presentamos en el pizarrn a travs de unas tablas que mostraremos en
los resultados.

Cumpliendo con los objetivos de la prctica y habiendo obtenido los resultados de


los experimentos cada equipo anoto los resultados de los dems equipos para
completar y complementar la practica en su totalidad.

Fue as que el pasado 2 de abril concluimos la prctica nmero 6, a continuacin


expondremos el marco terico y todo lo que engloba a dicha prctica.

3
INTRODUCCION/ MARCO TEORICO:

ENZIMAS

Las son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin. Actan
en condiciones muy suaves, a temperatura por debajo de 70C,con un PH de +-
7.Tienen un alto Grado De Especificidad, solamente catalizan la reaccin en que
participa un sustrato o un grupo de sustratos con ciertas caractersticas qumicas y
geomtricas comunes.

Sustrato: es una molcula sobre la que acta una enzima. El sustrato se une al
sitio activo de la enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato.
El sustrato por accin de la enzima es producto y es liberado del sitio activo,
quedando libre para recibir otro sustrato.

ESPECIFICIDAD, SITIO ACTIVO Y GRUPOS


CATALTICOS.

Las enzimas se unen a los sustratos por medio de


interacciones hidrofbicas y electrostticas, puentes
de hidrgeno y fuerzas de van der Waals. Los
residuos de aminocidos de la enzima que
participan en la interaccin con el sustrato estn
alejados unos de otros; pero como resultado de la
unin del plegamiento de la protena, se agrupan
para formar el sitio activo de la enzima. Algunos
residuos participan solo en la unin del sustrato y
definen una regin del sitio activo que se llama sitio
de fijacin o de unin de los sustratos. Los
catalticos (residuos), se encargan dela
transformacin del sustrato en producto.
Normalmente, el nmero de residuos que intervienen en la unin del sustrato es
mayor que el de residuos catalticos. Debido al plegamiento de la protena, su
localizacin se encuentra en los surcos o huecos de la superficie de la enzima.

INHIBICIN

Los inhibidores son molculas que interactan con la enzima y disminuye su


actividad cataltica. Tienen gran importancia desde un punto de vista mdico,
debido a que un buen porcentaje de los medicamentos trabajan como inhibidores

4
de alguna actividad enzimtica. Su importancia industrial radica en su uso como
pesticidas e insecticidas. Dentro del campo de la investigacin, como herramientas
que se usan para indagar el orden de los componentes de una va metablica o
una estructura y el mecanismo de reaccin de una enzima. Conviene pensar en
los inhibidores como herramientas poderosas de gran utilidad y no como
molculas que estorban en un ensayo enzimtico.

INHIBICIN COMPETITIVA

La caracterstica ms importante de este tipo de inhibicin es que el sustrato y el


inhibidor son mutuamente excluyentes. Generalmente, se encuentra que el
inhibidor es una molcula con estructura similar a la del sustrato. Sin embargo
tambin se puede dar el caso de que el inhibidor sea estructuralmente diferente al
sustrato y que, al interactuar con otro sitio diferente de la enzima, induzca un
cambio conformacional que modifique el sitio para el sustrato.

INHIBICIN NO COMPETITIVA

Es un tipo de Inhibicin que reduce la tasa mxima de una reaccin qumica


(Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unin del catalizador por el sustrato. La
inhibicin no competitiva normalmente se aplica a enzimas, y difiere de la
inhibicin competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio
diferente al centro activo de la enzima. Esto afecta a la tasa de la reaccin
catalizada por la enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la
estructura y la forma de la enzima. En este tipo de inhibicin, no hay competicin
entre en inhibidor y el sustrato, as que incrementar la concentracin del sustrato
no produce un aumento de la tasa de actividad enzimtica.

INHIBICIN ACOMPETITIVA

En la inhibicin acompetitiva, el inhibidor slo se une al complejo enzima


sustrato, y no a la enzima libre. La adiccin de ms sustrato a la reaccin da lugar
a un aumento de la velocidad de reaccin, pero no hasta el grado que se observa
en las reacciones sin inhibir. La inhibicin acompetitiva suele observarse en las
reacciones en las que las enzimas unen ms de un sustrato.

INHIBICIN IRREVERSIBLE

Los inhibidores irreversibles normalmente se unen covalentemente a la


enzima,con frecuencia a una cadena lateral del lugar activo.

EFECTO DEL pH.

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El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la
concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la
enzima y el sustrato, pueden participar tambin en la reaccin como sustrato o
producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la
velocidad de la reaccin. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las
enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y
carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una
enzima.

A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en


consecuencia su inactivacin. La concentracin de ion hidrgeno afecta a las
enzimas de diversas formas. En primer lugar la actividad cataltica est
relacionada con el estado inico del lugar activo. Las variaciones de la
concentracin de ion hidrgeno pueden afectar a la ionizacin de los grupos de
lugar activo .En segundo lugar, los cambios de los grupos ionizables pueden
alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drsticos del pH
frecuentemente conducen a la desnaturalizacin. La mayora de las enzimas son
activas dentro de un intervalo
estrecho de PH. Por esta razn. Los
seres vivos emplean
amortiguadores para regular
estrechamente el pH. El valor de pH
al que la actividad de una enzima es
mxima se denomina pH ptimo, y
vara considerablemente segn la
enzima.

EFECTO DE LA TEMPERATURA.

Cuando se estudia la velocidad de


una reaccin qumica en funcin de
la temperatura, y en ausencia de
una enzima, se observa un
incremento de la velocidad
conforme se aumenta la
temperatura. Se debe a dos
razones:
A) Al incremento en el nmero de
choques por unidad de tiempo, debido al aumento en la energa cintica de las
molculas con la temperatura.
B) Al aumento en el nmero de molculas con la energa de activacin adecuada
para que el choque entre los reactivos sea productivo.

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OBJETIVOS:

Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas


y la manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio,
tomando como ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya.
Determinar la influencia del inhibidor bicloruro de mercurio (HgCl2) en la
reaccin catalizada por la ureasa.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Confirmar la habilidad y conocimientos de la titulacion en esta practica


gracias a las prscticas anteriores.
Implemetar y aprender a manejar graficas para el analisis de resultados.

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Material y Metodologa.

Material y equipo.

6 tubos de ensaye grandes


3 pipetas (1,5 y 10 mL)
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1bureta de 50 m L
1 soporte universal
1 pinzas de bureta
1 propipeta
Gradilla para tubos de ensaye
Vortex
Bao Maria

Reactivos y soluciones.

Urea 0.25 M
Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2.
Bicloruro de mercurio al 1%
cido clorhdrico 0.1 N.
Rojo de metilo al 0.04%.

Muestra biolgica

Extracto de Ureasa proveniente de frijol de soya.

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METODOLOGIA

Montaje adecuado 1-Para la 2-Se agregaron 3-En caso de


de experimento y titulacin se dos gotas de obtener
preparacin de los midieron 5mL rojo de metilo y coloracin
reactivos as como del tubo 6 se observo la amarilla
la elaboracin de (blanco) y se coloracin. proceda a
mezclas en cada vertieron en un
titular con
tubo matraz de 125
acido
mL.
clorhdrico.

En el experimento En el experimento Se realizo esto 4- Se titulo 5 m


3, se preparo los 2 se realizo la para cada L de cada uno
tubos y se realizo titulacin de cada experimento de los 5 tubos
la titulacin. tubo as como el partiendo del restantes.
Midiendo como clculo de VTC, punto numero
afecta la como se indica. 2.
temperatura la Viendo como
velocidad de afecta la
reaccin, concentracin de
ureasa

Se recojio y limpio
En el experimento
el material usado
4, se continuo con
la titulacin de Se Tabularon los
cada tubo resultados.
midiendo como el
pH afecta la
velocidad de
reaccin de la
ureasa.

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RESULTADOS OBTENIDOS

DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN LA CONCENTRACION DE SUSTRATO (UREA)


SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA UREASA.

TUBO M de urea inicial en mL de HCL 0.1 N VTC M de Urea


cada tubo hidrolizada

1 10 M 1.4 ml -0.2ml 1.2 X 50 60


2 20 M 1.2 ml -0.2ml 1.0 X 50 50
3 40 M 1.3 ml -0.2ml 1.1 X 50 55
4 100 M 1.0 ml -0.2ml 0.8 X 50 40
5 150 M 0.4 ml -0.2ml 0.2 X 50 10

70

60 10, 60
40, 55
50 20, 50

40 100, 40

30

20

10 150, 10

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

10
DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION EN LA CONCENTRACION DE ENZIMA (UREASA)
SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA MISMA

TUBO mL de enzima mL de HCL 0.1 N VTC M de Urea


inicial en cada tubo hidrolizada
1 0.1 ml 0.4 ml -0.2ml 0.2 X 50 10
2 0.3 ml 0.5 ml -0.2ml 0.3 X 50 15
3 0.5 ml 0.5 ml -0.2ml 0.3 X 50 15
4 0.7 ml 0.6 ml -0.2ml 0.4. X 50 20
5 0.9 ml 0.7 ml -0.2ml 0.5 X 50 25

0.9 25, 0.9

0.8

0.7 20, 0.7

0.6

0.5 15, 0.5

0.4

0.3 15, 0.3

0.2

0.1 10, 0.1

0
0 5 10 15 20 25 30

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DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE
REACCION DE LA UREASA

TUBO TEMPERATURA mL de HCL 0.1 N VTC M de Urea


hidrolizada
1 0.1C 0.3 ml -0.2ml 0.1 X 50 5
2 0.3 C 0.4 ml -0.2ml 0.2 X 50 10
3 0.5 C 0.4 ml -0.2ml 0.2 X 50 10
4 0.7 C 0.3 ml -0.2ml 0.1. X 50 5

12

10 0.3, 10 0.5, 10

6
0.1, 5 0.7, 5
4

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

12
DETERMINACION DEL EFECTO DE LA VARIACION DEL PH DEL MEDIO SOBRE LA VELOCIDAD DE
REACCION DE LA UREASA.

TUBO TEMPERATURA VTC M de Urea


hidrolizada
1 3.0
2 5.0
3 7.0 0.2 10
4 8.5 1.8 90
5 10 1.4 70

100

90 8.5, 90

80

70 10, 70

60

50

40

30

20

10 7, 10

0
0 2 4 6 8 10 12

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DISCUSION

En la prctica realizada se utilizaron varios factores para demostrar la actividad


enzimtica, en ste caso de la ureasa, en cuando a los resultados obtenidos
podemos decir que:

En la determinacin del efecto de la variacin de sustrato (urea) sobre la velocidad


de reaccin de la ureasa, la grafica obtenida adquiere esa forma debido a que en
cada uno de los tubos fue aumentando la [S], entonces, al principio la grafica va
ascendiendo, pero llega un punto en el que sta se vuelve constante, esto es
porque, a esa altura la enzima se ve saturada, tomando en cuenta de que las
variables [E], T y pH se encuentran constantes.

En el caso de la determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de


enzima (ureasa) sobre la velocidad de reaccin de la misma, se fue agregando a
cada tubo una cantidad mayor de [E], teniendo como resultado una grafica
ascendente, esto debido a que la enzima no se satura y sigue formando producto,
en sta caso tuvimos contantes [S], pH y T.

En cuanto a la determinacin del efecto de la variacin de la T y pH sobre la


velocidad de reaccin de la ureasa, la grafica que se obtuvo fue una campana de
Gauss, esto se debe a que la enzima va actuar a determinada temperatura y
determinado pH, aqu las constantes fueron [E] y [S].

CONCLUSIN

Los objetivos planteados al principio de la prctica se llevaron acabo, ya que


pudimos obtener los resultados del comportamiento de la ureasa con las
diferentes variaciones y poder observar mediante las graficas el comportamiento
de la enzima y poder comprender el fundamento.

Tambin se obtuvieron resultados de inhibidor utilizado que fue Bicloruro de


Mercurio HgCl2 comprendiendo su accin sobre la enzima.

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Bibliografa

Laguna J. Y Pia,E,1992.Bioquimica.Salvat.Mexico

Lehniger A., 1993. Principios de Bioquimica. 2da edicin. Ed. Manual Moderno.
Mxico

Pacheco Leal 2012. Bioqumica Medica, 1ra edicin. Limusa. Mxico.

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