PRÁCTICA 2

EVALUACION DE TABLAS DE PURIFICACION DE

ENZIMAS

Resumen
Debido a que la purificación de una enzima (proteína) implica la eliminación selectiva
de otras proteínas, es necesario determinar la cantidad de actividad enzimática con
respecto a la cantidad de proteína presente. Usualmente, se emplea una medida de la
actividad enzimática por miligramo de proteína para indicar el grado de pureza de la
enzima en las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. Este parámetro, la
actividad específica, se calcula a partir de una medida de la actividad enzimática o
unidades, usualmente expresada en términos de micromoles de producto formado por
minuto, y una determinación de la proteína

Objetivos
 Evaluar la eficiencia de los métodos de purificación de enzimas
 Capacitarse en el análisis de tablas de purificación de enzimas

Marco teórico
La actividad específica = unidades por miligramo de proteína = micromoles de sustrato
consumido por minuto por miligramo de proteína = micromoles de producto formados
por minuto por miligramo de proteína También se debe estimar la eficiencia de una
purificación enzimática a través de la determinación de la cantidad de actividad
enzimática que se recupera en cada etapa de purificación. Esto requiere que usted
calcule la actividad total en cada fracción. Actividad total = (actividad específica) x (mg
de proteína total en la preparación) ó Actividad total = (actividad por mililitro) x
(volumen de la preparación en mililitros)

Después que usted conoce estos valores para cualquier preparación de una enzima,
usted puede proceder con la purificación de la enzima aplicando una o más técnicas. Es
esencial calcular la actividad específica, la actividad total, y el porcentaje de
rendimiento para cada fracción obtenida durante una purificación. Porcentaje de
rendimiento = (actividad total de una fracción dada/actividad total del material de
partida) x 100% Por lo tanto, la efectividad de una etapa particular puede ser evaluada
según el incremento de la actividad específica de la enzima y el porcentaje de
rendimiento en las fracciones de mayor enriquecimiento. Un incremento de la actividad
específica indica una purificación. Un fraccionamiento ideal debería proveer un
enriquecimiento completo (enzima pura) en un rendimiento del 100%; en la práctica,
pocos procedimientos son altamente selectivos y se combina varias etapas menos
ideales para el fraccionamiento. De hecho, si el enriquecimiento es grande, se debe
esperar un rendimiento más bajo en una etapa particular. La tabla 2.1 muestra una forma
conveniente y usual para presentar los resultados obtenidos durante un procedimiento de
purificación. Debido a que la concentración de proteína y la actividad enzimática se
determinan usualmente como miligramos por mililitro y unidades por mililitro,
respectivamente, también es necesario registrar el volumen de cada fracción enzimática.
La presente práctica permite al estudiante ganar alguna experiencia en la aplicación de
estos conceptos a la purificación de una enzima

Problemas
Utilizando los datos que se proporcionan en las siguientes tablas, complete los datos que
faltan para obtener una tabla estándar de purificación de enzimas. Una vez completadas
las tablas de purificación, analizar cada una de ellas con respecto a actividad específica,
rendimiento del proceso de purificación de la enzima y grado de pureza alcanzada.
Asimismo, haga un comentario sobre si el proceso de purificación presentado es
aceptable, más o menos aceptable o no aceptable.
Resultados
 Caso 1
contenido
actividad unidades proteico actividad
Fracción vol ml u/ml totales mg/ml especifica rendimiento pureza
Extracto crudo (I) 1480 0.34 503.2 10.2 0.03333333 100% 1
Extracto 1390 0.32 444.8 4.3 0.0744186 88.3942766 2.23255814
Extracto en alúmina 69 4.53 312.57 3.9 1.16153846 62.1164547 34.8461538
DEAE celulosa pH 5.5 100 3.09 309 1.17 2.64102564 61.4069952 79.2307692
DEAE celulosa pH 7.5 12 7.02 84.24 0.65 10.8 16.7408585 324

 Caso 2
Actividad contenido
Volumen total Proteína proteico actividad
fraccion total (ml) contenido (Unidades) total (mg) mg/ml especifica rendimiento pureza
Homogenizado 1612 6963840 4320 211000 130.8933 53202.4174 100% 1
Sobrenadante de pH 5 2881 6972020 2420 21700 7.53210691 925640.075 56.0185185 17.3984589
Sulfato de amonio 278 638288 2296 185000 665.467626 959.157103 53.1481481 0.01802845
Sephadex G-75 98.6 49300 500 1860 18.8640974 2613.43011 11.5740741 0.04912239
DEAE-celulosa Pico I 38.4 15513.6 404 360 9.375 1654.784 9.35185185 0.03110355
Hidroxiapatita 388 154424 398 37 0.09536082 1619365.19 9.21296296 30.4378122
Cristalización 0.8 104 130 7.3 9.125 11.3972603 3.00925926 0.00021422
Cristalización 0.5 45.6 91.2 5.1 10.2 4.47058824 2.11111111 8.403E-05
DEAE-celulosa Pico II 242 22360.8 92.4 140 0.5785124 38652.24 2.13888889 0.72651285
Sephadex G-200 266 20854.4 78.4 29 0.10902256 191285.186 1.81481481 3.59542283
  Caso 3
contenido
Volumen Actividad Proteína proteico actividad
fraccion total (ml) contenido total (mKat) total (mg) mg/ml especifica rendimiento pureza
Extracto 2140 146162 68.3 36000 16.8224299 8688.51889 100% 1
Precipitación con (NH4)2SO4 y acetona385 30569 79.4 19600 50.9090909 600.4625 116.25183 0.06910988
Sulfato de amonio 42 882 21 1870 44.5238095 19.8096257 30.7467057 0.00227998
DEAE-Sephadex 20 366 18.3 378 18.9 19.3650794 26.7935578 0.00222881
Sephacril S-200 20 700 35 30 1.5 466.666667 51.2445095 0.05371073
Concanavalina A Sepharosa 6 33.6 5.6 1.47 0.245 137.142857 8.19912152 0.01578438

Conclusiones
Para evaluar de forma cuantitativa el éxito de una purificación de enzima, es necesario
tener en cuenta dos parámetros:

• El rendimiento y

• El grado de pureza De cada paso de purificación

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